DE2622062A1

DE2622062A1 - Verfahren zum zuechten von zellen von lebewesen in einlagiger schicht und vorrichtung zur durchfuehrung dieses verfahrens

Info

Publication number: DE2622062A1
Application number: DE19762622062
Authority: DE
Inventors: Colin Burbidge
Original assignee: Beecham Group PLC
Current assignee: Beecham Group PLC
Priority date: 1975-05-21
Filing date: 1976-05-18
Publication date: 1976-12-02
Also published as: US4224413A; NL7605438A; GB1525022A; AU1419776A; IT1061297B; CH624713A5; BE842002A; FR2311845B1; AU512590B2; HU175045B; FR2311845A1; DK223976A; ATA365176A; AT356617B; JPS527479A

Description

"Verfahren zum Züchten von Zellen von Lebewesen in einlagiger Schicht und Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens"

Beanspruchte

Priorität: 21. Mai 1975 - Großbritannien - Nr. 21998/75

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Züchtung von Zellen von Lebewesen in vitro in einer einlagigen Schicht sowie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.

Man kennt zwei Hauptverfahren zum Züchten von Einzelsellen oder Mikroorganismen in vitro, nämlich erstens als Suspension unter Rühren in einem Reaktionsgefäß und zweitens als einlagige Schicht, die auf einer Trägeroberfläche festsitzend aufgebracht ist. Gewöhnlich läßt sich das Züchten in Suspension nur bei ausgebildeten Zellen, Zellen des lymphozytischen Typs einschließlich normaler Lymphozyten, Tumorzellen, wie den Burkitt-Lymphorazellen, und leukämischen Myopiasten geeignet erscheinen. Zellen, die Schichten oder Pasern bilden., wie die Bindegewebszellen und Epithelzellen, wenn sie nicht überführt werden, erfordern einen

609849/0916

festen Trägerstoff, auf dem sie wachsen können. Mit diesem letztgenannten Züchtungsverfahren befaßt sich vorliegende Erfindung.

Das Züchten in einer Lage im Laboratoriumsmaßstab ist ein einfaches Verfahren, bei dem sich die Zellen auf einem Träger befinden und an den Innenwänden einer ruhenden oder sich drehenden Flasche wachsen. Es ist bekannt, daß für eine einlagige Massenzüchtung ein großer Oberflächenbereich für die Zellen vorgesehen sein muß. Das Drehgefäß ist für eine Erzeugung im großen Maßstab dadurch angepaßt worden, daß man eine Anzahl von Züchtungsgefassen so miteinander verbindet, daß das Züchtungsmedium kontinuierlich durch eine Reihe von Gefäßen gepumpt werden kann. Diese Verfahren jedoch, bei denen eine derartige Vorrichtung Anwendung findet, sind arbeitsaufwendig, da häufig eine Subkultur erforderlich ist, und außerdem ist die Vorrichtung als solche teuer, umfangreich und mechanisch kompliziert.

Eine Vorrichtung, die innerhalb eines einzigen Züchtungsgefäßes eine große Oberfläche schafft, ist von W. Wohler und Mitarbeitern in der Zeitschrift "Journal of Experimental Cell Research" £2 (1972), S. 571, beschrieben und iöt auch Gegenstand der DT-OS 2 300 567· Diese Vorrichtung besteht aus einem Erlenmeyerkolben, der eine Matrix mit einem hohen Oberflächenbereich, wie Glasperlchen, enthält. Die Zellen werden auf die Matrix aufgebracht, die in dem Züchtungsmedium vollständig eingetaucht sind. Das Züchtungsmedium wird kontinuierlich ergänzt.

Die Nachteile dieses Submers-ZüchtungsVerfahrens sind , daß

(1) die Vorrichtung, die zur Aufrechterhaltung der Eigenschaften

609849/0916

des Mediums erforderlich sind, kompliziert ist, und daß (2) infolge von Unterschieden bei der Konzentration des die Zellen bedeckenden Züchtungsmediums im allgemeinen keine guten Wachstumsbedingungen, wie bei dem Drehgefäß, erreicht werden können, in denen die Zellen mit einem dünnen Film des Wachstumsmediums bedeckt sind.

Derartige Nachteile beim Züchten von Zellen auszuschalten, lag vorliegender Erfindung als Aufgabe zugrunde. Es wurde nun gefunden, daß man diese Schwierigkeiten dadurch umgehen kann, indem man einen dünnen Film eines Nährmediums auf Einzelzellen in einlagiger Schicht aufbringt.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zum Züchten von Zellen von Lebewesen in einlagiger Schicht, die sich fest auf einer Oberfläche einer festen porösen Matrix befindet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die sich fest auf der Matrixoberfläche befindlichen Zellen mit einer Schient eines flüssigen Nährmediums in Berührung gebracht werden, das sich von einem zusammengefallenen Schaum ableitet, der aus dem Nährmedium und einem Gas gebildet worden ist.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist eine einlagige Schicht von Zellen zumindest teilweise auf der festen porösen Matrix festsitzend, indem man beispielsweise die Matrix in eine Zellensuspension in einem flüssigen Medium eintaucht, die Zellen sich auf der Matrix festsetzen läßt und anschließend das Suspensionsmedi-_%um .abzieht. Dann wird das Nährmedium in Form eines Schaums in einer genügend raschen Geschwindigkeit zugeführt, um ein Austrock-

609849/091 6

nen der Matrix zu vermeiden, während die Zellen auf der geeigneten physiologischen Temperatur, d.h. 35 bis 38°C, gehalten werden. Sobald der Schaum mit der Matrix in Berührung kommt, fällt er zusammen und fließt als dünne Schicht durch die Matrix hindurch auf die Oberfläche der Zellen, während Gas in den Zwischenräumen belassen wird. Das aus der Matrix fließende Medium kann dann entweder abgezogen oder zweckmäßigerweise wiederum eingesetzt werden. Die Zellen werden so lange gezüchtet, bis die Matrix mit einer ausreichend großen einlagigen Schicht Zellen bedeckt ist. Die Zellen werden dann zum Entfernen des Nährmediums gewaschen, gegebenenfalls unter Anwendung einer dünnen Schicht eines Waschmittelschaums. Die Zellen werden dann nach

üblichen Verfahren entfernt, beispielsweise durch Behandeln mit Trypsin, gegebenenfalls mit schwachem Bewegen der Matrix, und dann gesammelt.

Dieses Verfahren ist zum Züchten all derjenigen Zellen geeignet, die sich von Tieren, einschließlich Säugetieren, Vögeln, Amphibien, Fischen und Insekten ableiten, die in vitro in Schichten wachsen. Als Beispiele derartiger Zellen werden Epithelgewebe, Bindegewebe, Muskelgewebe, Nervengewebe und Lymphgewebe genannt. Insbesondere ist das Verfahren zum Züchten von Haut- und Muskelfibroblasten geeignet, die sich von Säugetieren, einschließlich Menschen, ableiten.

Die'erfindungsgemäß einzusetzende Matrix ist porös. Die Zwischenräume der porösen Matrix müssen ausreichend groß sein, um (a) die einlagigen Schichten der Zellen aufzunehmen, (b) das Züchtungsmedium als dünne Schicht über die Oberfläche der einlagigen

609849/0916

Schicht der Zellen fließen zu lassen, während das Gas in den Zwischenräumen zurückbleibt, und um (c) ein Entfernen der Zellen zu ermöglichen.

Die Oberfläche der porösen Matrix nach vorliegender Erfindung muß für die zu züchtenden Zellen einmal als Haftgrund dienen können und zum anderen auch ein leichtes Entfernen der Zellen ermöglichen, wenn das Züchtungsverfahren beendet ist. Es ist bekannt, daß tierische Zellen besonders gut an Oberflächen haften, die hohe Dichten an Natriumionen aufweisen. Sie haften deshalb an Substanzen, die eine negative Ladung aufweisen können und sich deshalb mit den Natriumionen verbinden. Die Matrix kann aus Substanzen gefertigt sein, an die die Zellen haften oder aus einem inerten Träger bestehen und mit einer derartigen Substanz beschichtet bzw. überzogen sein. Geeignete Substanzen umfassen Kunststoffe, wie Polyamide, Polycarbonate, Polystyrol, Epoxyharze, Silikon-Kautschuke, Celluloseacetat, Cellulosenitrat, Zellglas, Polytetrafluoräthylen, Polyäthylen-terephthalat, Polyoxymethylen, fluorierte Ä'thylen/Propylen-Mischpolymerisate, Polyphenylenoxid, Polypropylen, Collagen, ferner Glimmer, Kohlenstoff, unlösliche inerte Metalloxide, Phosphate, Silikate.oder Carbide, Siliciumcarbid, inerte Metalle, wie rostfreier Stahl, Aluminium, Titan oder Palladium oder keramische Substanzen oder Glas. Es ist gefunden worden, daß die verschiedenen Zelltypen an den Matrices mit unterschiedlichen Pestigkeitsgraden haften. Beispielsweise haften einige Zellen so gut an manchen der vorgenannten Typen von Trägermaterialien, so daß man Schwierigkeiten bekommt, diese Zellen zu entfernen, wenn ein Gewinnen des Ertrags erforderlich ist. Aus diesem Grund ist es manchmal notwendig, die Oberflächen-

609849/0916

-⁶ - 2B22Ö62

eigenschaften dadurch zu modifizieren, daß man einen Überzug einer weniger stark an den Zellen haftenden Substanz aufbringt, die ein Entfernen der Zellen erleichtert. Wie gefunden worden ist, sind Überzugssubstanzen, die die Zellen leichter von den Matrixoberflächen entfernbar machen, polyfluorierte Kohlenwasserstoffe, wie Polytetrafluoräthylen, oder Silicone, wie Polymethylhydrogensiloxan. Andererseits kann eine Oberfläche mit einer geringen Haftfähigkeit verändert werden, damit sie eine bessere Haftfähigkeit erhält, indem man einen geeigneten Überzug aufbringt.

Demzufolge hängt der besondere Oberflächenüberzug, der einzusetzen ist, von dem Typ der zu züchtenden Zellen und auch davon ab, ob ein Entnehmen des Ertrags von der Matrix erforderlich ist. Ein geeigneter Überzug oder eine Kombination von Überzügen kann für jeden besonderen Anwendungszweck empirisch bestimmt werden.

Substanzen, die - wie gefunden wurde - besonders für die Bildung von Matrices zum erfindungsgemäßen Einsatz vorteilhaft sind, sind Polycarbonate, Polyamide, wie "Nylon 6", "Nylon 11" und "Nylon 12", ferner Glas, Polyoxymethylen, Polypropylen und 2,6-Dimethyl-phenylenoxid. Überzogene bzw. beschichtete Matrices, die für die Bildung von Matrices zum erfindungsgemäßen Einsatz besonders vorteilhaft sind, sind ein mit Polytetrafluoräthylen, Silikon oder PoIymethylhydrogensiloxan beschichtetes Polycarbonat, ein mit Silikon, Polytetrafluoräthylen oder Stearinsäure beschichtetes Glas oder Polyäthylenterephthalat, "Nylon 6",'"Nylon 11" und "Nylon 12", die mit Polytetrafluoräthylen beschichtet sind.

609849/0916

Bei einer besonderen Anwendung dieses Verfahrens kann die jeweils ausgewählte Substanz aufgrund von Nebenfaktoren bestimmt sein, wie bei einem Verfahren, bei dem die Matrix sterilisiert werden muß.

Die Matrix kann aus einem oder mehreren festen makroschwammskelettartigen Stücken hergestellt sein. Beispiele derartiger Matrices sind feste Schäume, die aus einer Substanz gebildet sind, welche die Zellen zu tragen vermögen, z.B. Kunststoffe, wie Polyamide, Polycarbonate, Polystyrol oder eine anorganische Substanz, wie Silicagel.

Gegebenenfalls kann die Matrix in Form eines Pfropfens aus Fasermaterialien, wie Metalldrahtwolle, Kunststoffwolle oder Glaswolle, vorliegen. Unter diesen Umständen würde die Substanz locker gepackt, um ein Zusammenlaufen des Dünnschichtflusses zu Flüssigkeitströpfchen, wobei ein Teil der Matrix untergetaucht wird, zu verhindern. Ein weiterer Matrixtyp kann die Form von reglulären Gittern oder Fäden, wie ein Netz, annehmen, die beispielsweise aus Kunststoff-, Metall- oder Glasfäden gebildet sind.

Bei einer weiteren anderen Ausführungsform kann die Matrix aus einer Masse von regulären oder irregulären festen oder hohlen Granulaten bestehen, die aus den zuvor besprochenen Substanzen bestehen oder damit beschichtet sind. Die Form, und Größe der Granulate ist nicht kritisch. Reguläre Formen, wie Kügelchen oder Zylinder, werden irregulären Formen bevorzugt, da gefunden worden ist, daß Zylinder aus Polyamiden geeigneter sind als Kunststoffschnitzel oder -abfall, woraus sie hergestellt worden sind. Kügel-

609849/0916

chen sind zweckmäßiger als Zylinder, da sie bei einem gegebenen Volumen einen größeren Oberflächenbereich aufweisen.

Bei Kügelchen liegen die geeigneten Durchmesser im Bereich von 1 bis 10 mm , vorzugsweise im Bereich von 2 bis 4 mm. Die Durchmesser der Zylinder liegen zweckmäßigerweise im Bereich von 1 bis 10 mm, vorzugsweise 3 bis 5 mm. Die Länge der Zylinder kann 1 bis 10 mm, vorzugsweise J5 bis 5 mm, betragen. Besonders geeignete Zylinder haben einen Durchmesser von 4 mm und eine Länge von 4 mm. Die aus kleineren als den vorgenannten Substanzstücken hergestellten Matrices weisen kleine Porengrößen auf, so daß ein vollständiges Entfernen der Zellen schwierig ist. Andererseits weisen größere Stücke einen kleineren .Oberflächenbereich auf.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nährmedium muß leicht assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoff- und Sauerstoffquellen enthalten. Das Medium ist auf den richtigen physiologischen pH-Wert von 6,5 bis 8,0 gepuffert und kann zusätzlich Metallsalze enthalten, wie Earle'sehe Salze, Ascorbinsäure, nicht-essentielle Aminosäuren, wie Alanin, Asparagin, Asparaginsäure, Glycin, Glutaminsäure, Prolin und Serin, oder ein Serum, wie das Rinderfötus-Serum. Erforderlichenfalls kann das Nährmedium auch Antibiotika, wie Penicilline, enthalten. Wenn man Zellen von Säugetieren züchten will, kann man beliebige Medien, die üblicherweise bei derartigen Zellen eingesetzt werden, beim vorliegenden Verfahren verwenden. Geeignete Nährböden sind solche nach Eagle, Fischer, Harn, Leibovitz, McCoy, Neumann und Tytell, Puck, Swim, Trowell oder Waymouth. Ferner eignen sich auch die 199-, NCTC 109-, NCTC 135-, CMRL ΙΟββ- oder die RPMI-Medien.

609849/0916

Der Schaum kann in den Medien nach üblichen Verfahren zur Schaumerzeugung erzeugt werden, beispielsweise indem man ein Gas mittels eines oder mehrerer Rühr- oder Schlagbesen in das Nährmedium einbringt. Gegebenenfalls kann man den Schaum auch dadurch erzeugen, daß man sich auf das im Medium gelöste Gas verläßt. Durch Verwendung einer Hohlräume schaffenden Pumpe, wobei sich ein Rührer mit hoher Geschwindigkeit dreht, werden in dem flüssigen Medium Bereiche von niedrigem Druck geschaffen, in denen sich Gasblasen bilden, die den Schaum hervorrufen. Bei einer weiteren Ausführungsform kann das Gas in die Flüssigkeit mittels eines oder mehrerer, fest oder beweglich angeordneter GasZuführungen oder durch eine Kugel aus gesintertem Glas eingeleitet werden.

Der Schaum kann aus einem beliebigen nicht-giftigen Gas oder Gasgemischen erzeugt werden. Der Schaum kann in dem Medium unter Verwendung eines völlig inerten Gases erzeugt werden, und die zur Züchtung der tierischen Zellen erforderlichen aeroben Bedingungen können durch anschließendes Einbringen der erforderlichen Menge Sauerstoff in das System erzeugt werden. Es ist gefunden worden, daß sich durch Einleiten von Kohlendioxid in das Kulturmedium ein Gleichgewicht zwischen dem Kohlendioxid in der Gasphase und dem in der flüssigen Phase ausbildet. Dieses Gleichgewicht erzeugt eine Pufferwirkung, die ein Aufrechterhalten eines gleichmäßigen pH-Wertes im gesamten Kulturmedium unterstützt. Wenn zuerst der Schaum in. dem Kulturmedium mittels eines inerten Gases gebildet wird und wenn dann ein zweites Gas hinzukommt, ist es vorteilhaft, daß das zweite Gas in das Kulturmedium an einem Punkt eingeleitet wird, entgegengesetzt dem der Schaum mit der

609849/091 6

Matrix in Berührung gebracht und zusammengefallen ist, um dadurch jedwede Verschlechterung des Schaums zu verhindern. Gegebenenfalls kann der Schaum unmittelbar durch Verwendung eines Gasgemisches mit einem Gehalt an Sauerstoff und gegebenenfalls Kohlendioxid erzeugt werden. Unter diesen Umständen muß ein inertes Verdünnungsgas mit eingesetzt werden, um sich innerhalb des Kulturmediums bildende Oxidationsbedingungen zu verhindern, die nachteilig auf die Zellen wirken würden. Wenn in ähnlicher Weise Kohlendioxid mitverwendet wird, ist gefunden worden, daß das Gasgemisch vorzugsweise keinen Sauerstoff und kein Kohlendioxid allein enthält, da häufig toxische Wirkungen beobachtet werden. Aus diesem Grund sollte als Verdünnungsgas Stickstoff zugegeben werden.

Für eine aerobe Züchtung von Zellen von Säugetieren, z.B. Fibroblasten, sind Gemische mit einem Gehalt von 1 bis 15 Volumenprozent Sauerstoff und 99 bis 85 fo Stickstoff geeignet. Ein bevorzugtes Gemisch besteht aus 10 % Sauerstoff und 90 % Stickstoff. Im Falle von Schäumen für aerobe Züchtungen, die aus Gasgemischen mit einem zusätzlichen Gehalt von Kohlendioxid erzeugt worden sind, sind zweckmäßige Anteile 7 bis 10 Volumenprozent Sauerstoff, 0,5 bis 7,5 Volumenprozent Kohlendioxid und der Rest Stickstoff. Ein bevorzugtes Gemisch enthält 5 % Kohlendioxid, 10 % Sauerstoff und 85 % Stickstoff.

Selbstverständlich kann der Schaum auch aus einem Gas erzeugt werden, das weder als solches noch zusätzlich Kohlendioxid enthält, wobei der pH-Wert des Mediums mittels Standardpuffersystemen eingestellt werden kann.

609849/0916

Der Schaum kann durch Ergänzen des Mediums mit einer nicht-toxischen grenzflächenaktiven Verbindung stabilisiert werden. Beispiele von grenzflächenaktiven Verbindungen, die in dieser Weise vorteilhaft sind, sind Sera, wie das Rinderfötus-Serum, ferner ^wBactopepton, Liponsäure, Linolsäure, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Polyoxyalkylen-Derivate von Propylenglykol oder Äthylenoxid-Anlagerungsprodukte an Sorbitan-mono-oleat. Einige Medien, z.B. diejenigen nach McCoy oder nach Harn, und die Medien NCTC 109, NCTC 135, CMRL IO66 enthalten bereits grenzflächenaktive Verbindungen, wie "Bactopepton", Liponsäure, Linolsäure und fithylenoxid-Anlagerungsprodükte an Sorbitan-mono-oleat. Es ist gefunden worden, daß, obwohl diese Medien zum Schäumen gebracht und als dünne Schicht fließen können, ein weiterer Zusatz von grenzflächenaktiven Verbindungen vorteilhaft sein kann, um ein zufriedenstellendes Züchten zu erreichen. Die eingesetzte zusätzliche grenzflächenaktive Verbindung kann eine weitere Menge der bereits in dem Medium vorliegenden grenzflächenaktiven Verbindung oder eine beliebige andere unterschiedliche grenzflächenaktive Verbindung der vorstehend genannten Art sein.

Wenn der Schaum erzeugt worden ist, wird er auf die feste Matrix aufgebracht. Um dies zu erreichen, ist der Schaumerzeuger so gelegen, daß der Schaum zu mindestens einem Teil der Matrix zugeführt werden kann. Die Überführung des Schaums vom Erzeuger zur Matrix wird entweder durch Pumpen des Schaums unter Verwendung beispielsweise einer peristaltischen Pumpe oder dadurch erreicht, daß man von dem durch den Erzeuger dem Schaum verliehenden Fliessen Gebrauch macht, beispielsweise wenn der Schaum in einer Kavitationspumpe oder durch Einblasen von Gas erzeugt wird. Gegebenen-

609849/0916

falls kann der Ort bzw. die Stelle der Schaumerzeugung oberhalb des Anwendungspunktes gelegen sein, so daß der Schaum unter Einfluß der Schwerkraft durch Kanäle auf die Matrix fließen kann.

Eine bevorzugte Eigenschaft, die von dem erfindungsgemäß verwendeten Schaum gefordert wird, liegt darin, daß er ausreichend stabil sein muß, um auf der Matrix anzukommen, ohne daß ein beträchtliches Zusammenfallen stattgefunden hat. Schäume niedriger Stabilität, die zwischen den Punkten der Erzeugung und der Anwendung zusammenfallen, neigen dazu, einen Flüssigkeitsstrom zu verursachen, der die Matrix untertaucht, so daß die Vorteile der Filmzüchtung nicht erreicht werden. Dieser unerwünschte Flüssigkeitsstrom kann vom Schaum abgeleitet werden, um zurückgeführt oder verworfen zu werden, bevor er auf der Matrix auftrifft, doch kann dadurch der wirksame Gebrauch des Mediums herabgesetzt werden.

Die Eigenschaften eines jeden einzelnen Schaums kann durch den Anteil der eingesetzten grenzflächenaktiven Verbindung und durch die Größe der in die Flüssigkeit eingebrachten Gasblasen bestimmt werden. Die Schaumstabilität wird durch einen höheren Anteil an grenzflächenaktiver Verbindung und eine Herabsetzung der Gasblasengröße gesteigert. Der jeweils gewählte Schaum hängt von der Entfernung ab, die der Schaum von Erzeuger zum Anwendungspunkt zurücklegen muß. Diese Merkmale hängen dann wieder von der jeweilig zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzten Vorrichtung ab, doch lassen sie sich in einfacher Weise durch Erzeugen eines Schaums und Beobachten des Grades seines Zusammenfallens beim Überführen bestimmen. Es ist gefunden worden,

609849/0916

daß ein Schaum, der unter Verwendung eines Nährmediums erzeugt worden ist, das mindestens 0,05 % zusätzliche grenzflächenaktive Verbindung enthält und bei dem die Gasblasen Durchmesser innerhalb eines Bereiches von 0,1 bis 2 mm einschließlich aufweisen, einen Weg von mindestens 175 cm zurücklegen muß, ohne daß der Schaum in beträchtlichem Maße zusammenfällt. Ein" bevorzugter Schaum zur Verwendung unter den jeweiligen Umständen enthält 0,1 % grenzflächenaktive Verbindung oder 5 oder 10 % eines Serums und weist Gasblasen eines mittleren Durchmessers von hauptsächlich 0,5 mm auf.

Die Geschwindigkeit, mit der der Schaum auf die Matrix aufgebracht wird, muß ausreichen, um mit praktisch allen Zellen der einlagigen Schicht auf der Matrix in Berührung zu gelangen. Diese Geschwindigkeit hängt von der Art der verwendeten Matrix und der dem Schaum sich anbietenden Querschnittsfläche ab. Es ist gefunden worden, daß eine geeignete Fließgeschwindigkeit des Schaums, der auf eine Matrix aus Kügelchen mit Durchmessern im Bereich von 2 bis 4 mm oder Zylindern mit Durchmessern von 1 bis 10 mm und Längen von 1 bis 10 mm aufgebracht werden soll, zwischen 20 und 320 cnr/Stunde je cm Bettquerschnittsfläche liegt.

Die Zellen können nach dem Züchten und vor dem Entfernen mit geeigneten physiologischen Pufferlösungen mit einem zusätzlichen Gehalt an grenzflächenaktiver Verbindung, z.B. mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung mit einem Zusatz an Methylcellulose, gewaschen vier den.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders zur Herstellung von

609849/091 6

Zellprodukten, wie Interferon, oder zur Erzeugung von für einen Einschluß in Vaccinen geeigneten Virusantigenen vorteilhaft.

Somit können die Zellen, die sich fest in einer einlagigen Schicht auf der Matrix befinden, vor einem Inberührungsbringen mit dem Film eines flüssigen Nährmediums nach vorliegender Erfindung mit einem Interferon-Induktor oder mit einem ansteckenden Virus behandelt werden. Eine derartige Behandlung der Zellen kann entweder vor oder nach dem FestaribrIngen der Zellen auf der Matrix erfolgen. Die Behandlung kann auch vorteilhaft unter Verwendung eines Films durchgeführt werden, der sich von einem zusammengefallenen Schaum ableitet.

Somit bildet einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Zellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine einlagige: Schicht von Säugetierzellen, die sich fest auf der Oberfläche einer festen porösen Matrix befinden, mit einem flüssigen Medium in Berührung bringt, das entweder Interferon-Induktoren oder ansteckende Viren enthält, wobei das flüssige Medium in Form einer Schicht vorliegt, die sich von einem zusammengefallenen, aus einem flüssigen Medium und einem Gas erzeugten Schaum ableitet.

Das Interferon kann in solche Zellen durch Inkubieren mit induzierenden Substanzen, wie Viren, Teilen von Viren, doppelstran- giger Ribonucleinsäure aus Viren und synthetischen doppelstrangigen Ribonucleinsäuren, induziert werden. Doppelstrangige Ribonucleinsäuren mit dieser Fähigkeit können aus bestimmten virusinfizierten Fungi, wie Penicillia und Aspergili, isoliert werden,

609849/0916

wie es beispielsweise in den GB-PS 1 I70 929 und 1 300 259 sowie von Banks und Mitarbeitern in der Zeitschrift "Nature" 2_l8 (1968), S. 542, beschrieben ist.

Der beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte am besten geeignete Interferon-Induktor ist eine doppelstrangige Ribonucleinsäure aus Viren, wie sie in mit Virenteilen infizierten Penicillia, beispielsweise Penicillium chrysogenum (GB-PS 1 I70 929), Penicillium stoloniferum (Banks und Mitarbeiter in "Nature" (1968), S. 5'42) und Penicillium cyaneofulvum (Banks und Mitarbeiter in. "Nature" 212, (1968), S. 155), und in mit Virus teilchen infizierten Aspergilli gefunden worden sind, z.B. Aspergillus niger und Aspergillus foetidus (GB-PS 1 300 259). Vorzugsweise stammt die doppelstrangige Ribonucleinsäure aus mit Virenteilchen infizierten Penicillium chrysogenum (GB-PS 1 I70 929).

Für eine Virusinfektion hängt die jeweilige Spezies, aus der die Zelle erhalten wird, vom Typ des herzustellenden Vaccins ab. Virusantigene zum Einbringen in pharmazeutische Vaccine werden aus Zellen höherer Primaten, wie Affen oder Menschen, erzeugt, doch werden sie vorzugsweise aus menschlichen Zellen erhalten. Virusantigene zum Einarbeiten in veterinärmedizinische Vaccine werden aus den entsprechenden Tierarten hergestellt.

Die Zellen werden durch Inkubieren der Zellen mit ansteckenden Viren infiziert. Beispiele von Viren, die nach diesem Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen: Impfstoffen erzeugt werden können, umfassen Tollwut-, Masern-, Mumps-, Röteln-, Poliomyelitis-, Adeno-, Gelbfieber-, Herpes-, Zytomegalie-, Influenza-,

609849/0916

Parainfluenza-, Hepatitis-, infektiöse Mononucleosis- und "Respiratory-syncytial"-Viren (RS-Viren).

Beispiele von Viren, die zur Herstellung von veterinärmedizinischen Impfstoffen erzeugt werden können, umfassen Marek-Hühnerlähmungs-, Parainfluenza-, Adeno-, Staupe-, Katzenleukämie-, infektiöse Rinder-Nasen-Luftröhrenkatarrh-, infektiöse Bronchitis-, Maul- und Klauenseuche-, Kälberdiarrhöe-, Pferde-Rhinopneumonitis-, Pseudotollwut-, infektiöse Laryngotracheitis-, Schweineseuchen- und übertragbare Gastroenteritis-Viren.

Die Typen von Zellen, die zur Verwendung bei diesem Verfahren geeignet sind, sind in Schichten wachsende Zellen von Lebe-wesen, z.B. Fibroblasten und Epithelzellen, wie dies zuvor ausgeführt worden ist. Der Einfachheit halber werden Haut- und Muskeif ibroblas ten bevorzugt.

Vor der Induktions- oder Infektionsbehandlung werden die Zellen zumindest an einen Teil der Matrix gebunden.und entwickeln sich nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren zu einer zusammengewachsenen Schicht. Hierfür sind beliebige der vorstehend besprochenen Medien geeignet. Bei Fibroblasten wird als besonderes Medium das Medium nach Eagle verwendet, das mit Rinderfötus-Serum, Rinderbragenextrakt, nicht-essentiellen Aminosäuren, Earle¹sehen Salzen, Ascorbinsäure und einem Antibiotikum ergänzt und mit Natriumbicarbonat abgepuffert worden ist.

Für eine Interferon-Induktion induziert man das Interferon in den Zellschichten entweder durch Untertauchen der Matrix in ein

609849/0916

Induktionsmedium oder durch Einbringen des Induktionsmediums als dünne Schicht, die sich von einem zusammengefallenen Schaum ableitet, welcher in einem mit einer grenzflächenaktiven Verbindung ergänzten Induktionsmedium erzeugt worden ist. In zweckmäßiger Weise wird die Induktionsinkubation bei einer Temperatur in einem Bereich durchgeführt, der gewöhnlich für ein Zellenwachstum geeignet ist, d.h. 35 bis 38⁰C, vorzugsweise etwa 37°C· Diese Induktionsinkubation kann Ibis 3 Stunden lang durchgeführt werden. Es wurde gefunden, daß 2 Stunden eine angemessene Dauer ist. Das Induktionsmedium ist eine Lösung, die aus doppeistrangiger Ribonucleinsäure in einem üblichen Züchtungsmedium besteht, das gegebenenfalls mit einer, der zuvor beschriebenen grenzflächenaktiven Verbindungen ergänzt worden ist. Gewöhnlich ist es besonders zweckmäßig, die doppelstrangige Ribonucleinsäure in dem gleichen Medium zu lösen, wie es für die Zellzüchtung angewendet wird. Bei einer Verwendung von Pibroblasten ist bei dem bevorzugten Induktionsmedium die doppeistrangige Ribonucleinsäure in einer möglichst geringen Menge des wesentlichen (Eagle¹sehen) Mediums gelöst, das .mit einem Antibiotikum und einem wasserlöslichen Hydrochlorid eines Poly-diäthylaminoäthyläthers von Dextran ("DME-Dextran") ergänzt und mittels Natriumbicarbonat auf einen physiologischen pH-Wert gepuffert ist.

Für eine Infektion mit Viren infiziert man dann die Zellen entweder durch Untertauchen der Matrix in ein Infektionsmedium oder durch Einbringen des Infektionsmediums als dünne Schicht, die sich von einem zusammengefallenen Schaum ableitet, welcher in einem mit einer grenzflächenaktiven Verbindung ergänzten Infektionsmedium erzeugt worden ist. Dieses Infektionsmedium ist eine Lö-

-* r= <-. .■%?*♦■ / Γί fy Λ R lö U S) U i* O i UO ι W

sung, die den Virus in einem üblichen Züchtungsmedium enthält, das gegebenenfalls mit einer, der vorgenannten grenzflächenaktiven Verbindungen ergänzt worden ist. Gewöhnlich ist es besonders zweckmäßig, den Virus in dem gleichen Medium zu suspendieren, wie es für die Zellzüchtung angewendet wird. Bei Verwendung von Pibroblasten wird bei einem bevorzugten Infektionsmedium der Virus in

einer möglichst geringen Menge des wesentlichen (Eagle'sehen) suspendiert,

Mediums / das mit einem Antibiotikum und einem wasserlöslichen Hydrochlorid eines Poly-diäthylaminoäthyläthers von Dextran ergänzt und mittels Natriumbicarbonat auf einen physiologischen pH-Wert gepuffert worden ist. Zweckmäßigerweise wird die Infektionsinkubation bei einer Temperatur innerhalb eines Bereiches durchgeführt, der im allgemeinen für ein Zellwachstum üblich ist, d.h. 55 bis 38⁰C, vorzugsweise etwa 37°C· Die Infektionsinkubation kann in l'.bis 3 Stunden durchgeführt werden. Es ist gefunden worden, daß 2 Stunden eine angemessene Dauer sind.

Nach der Induktions- oder Infektionsperiode werden die Zellen mittels phosphatgepufferter Salzlösung frei vom Infektionsmedium gewaschen, indem man sie in die Salzlösung eintaucht oder indem man die Salzlösung als dünne Schicht aufbringt. Dann wird ein Sammelmedium auf die Zellschicht als dünne Schicht für eine Dauer

zwischen β und 25 Stunden, vorzugsweise 16 bis 20 Stunden, für das Sammeln von Interferon und für eine Dauer von 3 bis 7 Eagen für das Sammeln des Virus aufgebracht. Das Sammelmedium kann ein beliebiges typisches Züchtungsmedium darstellen, wie es zuvor beschrieben worden ist. Gewöhnlich ist es am zweckmäßigsten, das gleiche Medium wie für die Zellzüchtung zu verwenden, wobei im Falle von Fibroblasten ein besonders geeignetes Sammelmedium eine geringstmögliche Menge des wesentlichen (Eagle'sehen) Mediums ist, das mit Rinderfötus-Serum und einem Antibioti-

80S849/0S1S "

kum ergänzt und mit Natriumbicarbonat auf einen physiologischen pH-Wert gepuffert worden ist. Das Sammeln wird bei einer Temperatur in einem Bereich durchgeführt, der gewöhnlich für die Züchtung von Zellen angewandt wird, d.h. 35 bis 38⁰C, vorzugsweise j57°C. Nach der Sammelperiode wird der Kreislauf des Sammelmediums unterbrochen, die Matrix abgezogen und das Interferon oder Virus enthaltende Medium dann gesammelt. Der Interferon- oder Virusgehalt der Lösung kann dann geprüft werden, und das Interferon oder der Virus nach beliebigen Standardmethoden isoliert werden.

Des weiteren bildet einen Gegenstand vorliegender Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Diese Vorrichtung besteht aus einem die zur Anhaftung der Zellen feste poröse Matrix enthaltenden Reaktionsgefäß mit einem Einlaß für das flüssige Medium und einem Auslaß für das abgezogene flüssige Medium und weist das kennzeichnende Merkmal auf, daß dem Reaktionsgefäß ein Schaumerzeuger und Mittel zum Aufbringen des erzeugten Schaums auf zumindest einen Teil der Oberfläche der festen porösen Matrix zugeordnet sind.

Das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Reaktionsgefäß kann ein Turm oder Trog mit rundem oder rechteckigem Querschnitt sein, oder in Form eines Hohlkegels, hängenden Kegels oder einer Kugel vorliegen. Das Reaktionsgefäß weist einen Einlaß auf, durch den die Matrix eingebracht werden kann, sowie einen Auslaß aus dem Schaumerzeuger, durch den der Schaum auf die Matrix aufgebracht wird. Das Reaktionsgefäß kann auch mit einem weiteren Einlaß zum Einbringen der Zellsuspension ausgerüstet

609849/091 6

sein. Dieser Einlaß kann in Form einer selbstdiohtenden Gummimembran oder einer normalen dampfsterilisierbaren Einlaßöffnung bestehen. Um sicherzustellen, daß die Eigenschaften des Mediums in dem erwünschten Bereich bleiben, kann das Reaktionsgefäß mit empfindlichen Elektroden für den pH-Wert und/oder den partiellen Säuerstoffdruck ausgerüstet sein.

Das Gefäß kann auch mit einem Gasauslaß gegebenenfalls durch ein steriles Filter versehen sein, um Gas aus dem Schaum austreten zu lassen. Das Gefäß kann ferner mit einem zusätzlichen Gaseinlaß ausgestattet sein, der zweckmäßigerweise auf der gegenüberliegenden Seite angeordnet ist, auf der der Schaum auf der Matrix zusammenbricht, so daß das einströmende Gas nicht den Schaum auftreibt. Das Medium wird dem Schaumerzeuger aus einem Flüssigkeitsvorratsbehälter zugeführt, wobei die Zufuhr .mittels Fallstrom oder gegebenenfalls durch Pumpen erfolgt.

Der Ausfluß des Mediums aus dem Reaktionsgefäß kann abgeleitet und verworfen oder aber durch Pumpen zurückgeführt werden, erforderlichenfalls in den Flüssigkeitsvorratsbehälter.

Die Vorrichtung nach vorliegender Erfindung wird nachstehend an.einem Beispiel unter Bezugnahme auf die Fig. 1 der Zeichnung beschrieben, die in schematischer Weise die Vorrichtung der Erfindung beschreibt.

In der Fig. 1 ist eine Zellzüchtungsvorrichtung nach der Erfindung gezeigt, die aus einem Schaumerzeuger 1, einem Reaktionsgefäß in Form eines zylindrischen Turmes 2, der die feste poröse

609849/0916

Matrix 5 enthält, und einem Auslaß 4 aus dem Gefäß als Mittel zum Abziehen der Flüssigkeit besteht.

Bei einer besonderen Ausführungsform besteht der Schaumerzeuger aus einem zylindrischen Gehäuse 5* einem Gaszuleitungsrohr 6, das an einem Ende mit dem Strömungsmesser 6a verbunden ist und dessen anderes Ende in das Gehäuse 5 durch dessen Seitenwand reicht und in einer Platte 7 aus gesintertem Glas endet. Der Schaumerzeuger 1 weist auch an dem einen Ende des Gehäuses einen Flüssigkeitseinlaß 8 und am anderen Ende des Gehäuses 5 einen Schaumauslaß 9 auf. Der Flussigkeitseinlaß 8 steht in Verbindung mit dem Flüssigkeitsvorratsbehälter 10 über eine Einspeisleitung 8a, in der ein Rückschlagventil 11 eingebaut ist. Bei dieser Ausführungsform kann die Flüssigkeitseinspeisleitung durch das Ventil 12 entleert werden, das zwischen dem Rückschlagventil 11 und dem Schaumerzeuger 1 angeordnet ist. Der Schaumauslaß 9 steht in Verbindung mit dem einen Ende der Schaumeinspeisleitung 9a, die in das Reaktionsgefäß 2 oberhalb der Deckfläche Ij5 der festen porösen Matrix 3 endet.

Bei dieser Ausführungsform enthält das Reaktionsgefäß 2 die Matrix J5 in Form kleiner Kunststoffzylinder. Das Reaktionsgefäß ist am oberen Ende mit einem dicht sitzenden durchbohrten Stopfen 14 verschlossen, durch den die Schaumeinspeisleitung 9a läuft. Das Reaktionsgefäß 2 läuft an seinem unteren Ende unter Bildung des Auslasses 4 spitz zu. Ferner weist das Reaktionsgefäß 2 einen Einlaß für die Zellsuspensionen in Form einer selbstdichtenden Gummimembran 15 und ein Gasauslaßrohr 16 auf, das in dem Bakterienfilter 17 endet. Der Auslaß 4 steht mit dem einen Ende des-

609849/0916

Ableitungsrohres l8 in Verbindung, das sich teilt, und zwar in einen Teil l8a, der über das Ventil I9 zum Flüssigkeitsvorratsbehälter 10 führt, und einen zweiten Teil 18b, der den Abflußablauf durch das Ventil 20 bildet. Der Flüssigkeitsvorratsbehälter 10, zu dem das Medium zurückkehrt, weist eine Gasabzugsleitung 22 und einen Flüssigkeitseinlaß in Form einer selbstdichtenden Gummimembran 23 auf. Die Gasabzugs leitung 22 ist bei dieser Ausführungsform mit.dem Gasauslaßrohr l6 aus dem Reaktionsgefäß unter dem Bakterienfilter 17 verbunden.

Um die Vorrichtung in Betrieb zu nehmen, wird das Reaktionsgefäß 2 mit einer geeigneten Menge von kleinen Zylindern eines Polycarbonate gefüllt. Dann wird der durchbohrte Stopfen 14 in das Reaktionsgefäß 2 eingesetzt und die Vorrichtung zusammengebaut. Danach wird .die gesamte Vorrichtung sterilisiert, indem sie in einer Umgebung mit konstanter Temperatur von etwa 37 C angeordnet und dann auf Raumtemperatur- abkühlen gelassen wird. Dann werden über die selbstdichtende Gummimembran I5 in das Reaktionsgefäß 2 die in einer ausreichenden Menge des Mediums suspendierten Zellen eingespeist, um die Matrix unterzutauchen. Die Vorrichtung läßt man 2 bis 20 Stunden stehen, damit sich die Zellen auf der Matrix festsetzen können. Dann speist man das Nährmedium über die selbstdichtende Gummimembran 23 in das Flüssigkeitsvorratsgefäß 10 ein und läßt es über die Einspeisleitung 8a in den Schaumerzeuger 1 fließen. Dann wird ein steriles Gas bei einer Geschwindigkeit, die mit dem Strömungsmesser 6a bemessen wird, in den Schaumerzeuger 1 eingeleitet, wodurch das Medium aufgeschäumt wird. Der Schaum gleitet mittels des Gasstromes durch den Schaumauslaß 9 zum oberen Ende der Matrix 3· Wenn der Schaum auf der

609849/0916

Matrix auftrifft, bricht er zusammen,und das Flüssigkeitsmedium fließt über die Matrixoberfläche. Gleichzeitig wird das Ventil 20 geöffnet, um das Suspensionsmedium mit einer Geschwindigkeit ausfließen zu lassen, die ausreichend ist, um das Suspensionsmedium durch das sich vom Schaum ableitende Nährmedium ersetzen zu lassen und ein Trockenwerden der Zellschicht zu verhindern. Wenn das Suspensionsmedium durch das sich vom Schaum ableitende Nährmedium ersetzt worden ist, wird das Ventil 20 geschlossen und das Ventil 19 geöffnet, so daß das Medium in den Flüssigkeitsvorratsbehälter 10 zurückkehrt. Das Nährmedium wird im Kreislauf geführt, bis sich eine Zellenkolonie in der gewünschten Größe festgesetzt hat. Dann wird die Gaszufuhr abgestellt und das Ventil 19 geschlossen. Der Flüssigkeitsvorratsbehälter 10 und der. Schaumerzeuger 1 werden vom Nährmedium befreit .und mit einem Waschmedium gefüllt. Dann wird die Gaszufuhr wieder in Betrieb genommen. Die Zellen werden mit einem dünnen Film des Waschmediums so lange gewaschen, bis sie frei von dem Kulturmedium sind. Das abfließende Waschwasser wird entweder durch das Ventil 20 abgezogen und. verworfen oder durch das Ventil 19 zum Flüssigkeitsvorratsbehälter 10 zurückgeleitet. Dann wird die Schaumzufuhr unterbrochen, und die Zellen werden von der Matrix in geeigneter Weise durch Füllen des Reaktionsgefäßes 2 mit einer die Zellen freisetzenden Lösung, wie Trypsin, entfernt. Die Matrix kann dabei gegebenenfalls durch langsames Gasdurchleiten durch die Matrix durch das Rohr l8 bei geschlossenen Ventilen 19 und 20 schwach bewegt werden, um ein Freisetzen der Zellen zu unterstützen.

Die Zellsuspension wird dann durch das Ventil 20 abgezogen, während das Ventil 19 geschlossen bleibt und das Ventil 20 geöffnet

609849/0916

ist.

Die Vorrichtung kann gegebenenfalls unterhalb des Bakterienfilters VJ mit einem Dampfabfangkühler und einer zusätzlichen Gaszufuhr ausgerüstet sein, die so angeordnet ist, daß das Gas bei einem Punkt eingespeist wird, unter dem sich das Ableitungsrohr 18 in die beiden Teile l8a und l8b teilt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Die vorstehend beschriebene Vorrichtung mit einem Reaktionsgefäß 2, das einen Durchmesser von J5,5 cm aufweist, wird bis zu einer Höhe von 25 cm mit aus gepreßtem Polycarbonat bestehenden Zylindern von 4 mm Durchmesser und 4 mm Länge gefüllt. Die Gesamtvorrichtung wird J>0 Minuten unter Druck bei 1,05 kg/cm sterilisiert.

Dann läßt man die Vorrichtung auf Raumtemperatur abkühlen und speist über die selbstdichtende Gummimembran 15 unter Verwendung einer Pravazspritze bei geschlossenen Ventilen 19 und 20 einen Impfstoff von 3,6 χ 10^ L929-Mäuse-Fibroblastenzellen ein, die in 100 cm Wachstumsmedium suspendiert sind. Das verwendete Wachstumsmedium ist ein Medium nach Eagle, das mit Earle'sehen Salzen, lOprozentigem Rinderfötus-Serum, nicht-essentiellen Aminosäuren, Ascorbinsäure und einem Gemisch aus Penicillin und Streptomycin ergänzt worden ist. Das Medium ist mit 2,2 g Natriumbicarbonat/Liter gepuffert und enthält als pH-Indikator Phenolrot.

609849/0916

Dann läßt man die Impfvorrichtung 20 Stunden bei 57⁰C stehen, um die Zellen an der Füllung sich ansiedeln und festsetzen zu lassen.

Wenn sich die Zellen auf der porösen Matrix angesiedelt haben, wird das Ventil 19 etwas geöffnet, um die Flüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß ablaufen und gleichzeitig ein Gasgemisch aus 10 % Sauerstoff und 85 % Stickstoff und 5 # Kohlendioxid einströmen zu lassen. Das Gasgemisch wird dem Schaumerzeuger in einer Geschwindigkeit von 25 cnr/Minute zugeführt, so daß der Schaum an der Deckfläche der porösen Matrix dann eintrifft, wenn die vorhandene Flüssigkeit wieder abgezogen wird. Die Fließgeschwindigkeit des Mediums durch das Ventil 19 wird so eingestellt, daß das Medium, in dem die Zellen suspendiert sind, durch das sich von dem Schaum ableitende Medium ersetzt wird, so daß die Zellen auf der Matrix nicht trocken werden. Wenn das Medium, in dem die Zellen suspendiert worden sind, vollständig aus dem Reaktionsgefäß abgezogen ist, wird das Ventil I9 vollständig geöffnet, und die Strömungsgeschwindigkeit der Flüssigkeit durch die Säule wird durch die Geschwindigkeit des Zusammenfallens des Schaums an der Oberfläche der Matrix kontrolliert.

Man läßt den Schaum etwa 72 Stunden zirkulieren.

Dann wird die Gaszufuhr zu dem Schaumerzeuger 1 unterbrochen und das Ventil I9 geschlossen. Der Flüssigkeitsvorratsbehälter und der Schaumerzeuger 1 werden durch das Ventil 12 geleert. Bei geschlossenem Ventil 12 wird der Flüssigkeitsvorratsbehälter mit einem Waschmedium gefüllt, das aus einer 0,15-m Kochsalzlö-

60984 9/09 16

sung besteht, die mittels Phosphat auf einen pH 7,3 äbgepuffert und mit 0,1 $ Methylcellulose ergänzt worden ist. Man läßt das Waschmedium schäumen und durch das Reaktionsgefäß laufen und durch das Ableitungsrohr l8b durch das Ventil 20 ablaufen, bis die Zellen von den letzten Spuren des roten Nährmediums frei sind. Dann schließt man das Ventil 20 und speist bei j57°C eine Lösung von Trypsin und dem Natriumsalz der A'thylendiamintetraessigsäureJn das Reaktionsgefäß 2 über die selbstdichtende Gummimembran 15 ein, um die poröse Matrix unterzutauchen. Nach 10 Minuten bewegt man die Füllung und die Lösung schwach während 5 Minuten, indem man über das Ventil 20 einen schwachen Strom steriler Luft einleitet. Die Zellen, die als Ergebnis dieser Bewegung in der Pufferlösung suspendiert sind, werden aus dem Reaktionsgefäß 2 durch das Ventil 20 abgezogen. Dann wird ein weiterer Teil der vorgenannten Pufferlösung aus Trypsin und dem Natriumsalz der Ä'thylendiämintetraessigsäura.abgegeben, um die restlichen Zellen zu entfernen.

Die Anzahl der geernteten Zellen wird durch Auszählen unter Verwendung einer Zählkammer bestimmt.

Gesamtzahl der überimpften Zellen J>,6 χ 10'

geerntete Zellen (i) in dem abgezogenen Wachstumsmedium und in der gepufferten Kochsalz- „ waschlösung 0,8 χ 10'

(ii) in der Lösung mit Trypsin

und dem Natriumsalz der ~

Athylendiamintetraessig- 5*25 x 10' säure ₇

insgesamt 6,05 x 10.

609849/0916

Beispiel 2

Unter Anwendung des Verfahrens nach Beispiel 1 werden menschliche Fibroblasten gezüchtet und das Interferon wie folgt erzeugt :

Eine Matrix von 5 x 15 cm von mit Silikon behandelten Polycarbonatperlchen mit 4 mm Durchmesser, die in ein zylindrisches Reaktionsgefäß aus Glas eingefüllt worden sind, wird mit 2,5 χ 10' Fibroblasten aus menschlicher Haut bzw. menschlichen Muskeln beimpft. Die Zellen werden als Suspension in ein Wachstumsmedium gegeben, das ein Minimum an dem wesentlichen (Eagle¹sehen) Medium mit Earle¹sehen Salzen besteht, die mit 10 % Rinderfötus-Serum, nicht-essentiellen Aminosäuren, Ascorbinsäure , einem Fibroblasten-Wachs turns faktor, einem Gemisch aus Penicillin aus Streptomycin und mit 0,88 g/Liter Natriumbicarbonat ergänzt worden ist.

Die beimpfte Matrix wird bebrütet und bei J57°C über Nacht stehengelassen. Dann läßt man das Suspensionsmedium langsam ablauf?r und beginnt die Bebrütung des Nährmediums, indem ein Gemisch von 5 % Kohlendioxid in steriler Luft "zu der Flüssigkeit in dem Schaumerzeuger zugeführt wird. Dieses Gemisch wird so eingestellt, daß es in dem Medium den zutreffenden pH-Wert von 7*0 bis 7*2 ergibt. Der Umlauf des Mediums wird 48 Stunden fortgesetzt.

Dann 13ßt man das Medium sich in der Matrix ansammeln, die dann durch Überschichten der Perlchen und des Mediums gewaschen wird. Anschließend läßt man die Flüssigkeit von der Basis der Matrix langsam ablaufen. In der gleichen Weise wird Induktionsmedium zugegeben, das aus der Mindestmenge des wesentlichen (Eagle) Mediums

609849/091 6

besteht, dem Earle'sche Salze, Natriumbicarbonat, ein Gemisch aus Penicillin und Streptomycin, 5 ug/ml doppelstrangige Ribonucleinsäure und 100 pg/ml eines wasserlöslichen Hydrochlorids eines Poly-diäthylaminoäthyläthers von Dextran ("DEAE-Dextran") zugegeben sind. Man läßt das Medium 2 Stunden bei 37°C mit den Zellen in Berührung und wäscht dann die Zellen wie vorstehend beschrieben mit der mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung. Das Waschwasser wird durch das Sammelmedium ersetzt, das aus dem Eagle¹ sehen Medium besteht, das mit Earle*sehen Salzen, Natriumbicarbonat, einem Gemisch aus Penicillin und Streptomycin und 1 % Rinderfötus-Serum ergänzt worden ist. Das Reaktionsgefäß läßt man unter diesen Bedingungen über Nacht bei 37°C stehen. Dann wird das Medium abgezogen und festgestellt, daß es 3300 internationale Einheiten menschliches Interferon enthält.

Beispiel 3

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt unter Verwendung von menschlichen Fibroblasten.

Eine Matrix von 3*5 x 25 cm von Polycarbonatperlchen mit 4 mm Durchmesser, die mit einem Poly te traf Iuoräthylen-Aerosol-Spra.y besprüht und in das zylindrische Reaktionsgefäß aus Glas eingefüllt worden sind, wird mit 8 χ 10 Pibroblasten aus menschlicher Haut bzw. menschlichen Muskeln beimpft. Die Zellen werden als Suspension in ein Wachstumsmedium zugegeben, das eine Mindestmenge an wesentlichem (Eagle*sehen) Medium mit Earle'sehen Salzen enthält, das mit 10 % Rinderfötus-Serum, nicht-essentiellen Aminosäuren, einem Gemisch aus Penicillin und Streptomycin und 0,88 g/Liter Natriumbicarbonat ergänzt worden ist.

609849/0916

Die beimpfte Matrix wird über Nacht bei J57°C bebrütet. Dann zieht man das Suspensionsmedium langsam ab und beginnt mit dem Kreislauf des Nährmediums, indem· man ein Gemisch aus Luft und Kohlendioxid zu der Flüssigkeit in dem Schaumerzeuger zugibt. Dieses Gemisch wird so eingestellt, daß es in dem Medium den richtigen pH-Wert von 7,0 bis 7,2 ergibt. Der Kreislauf des Mediums wird 75 Stunden fortgesetzt.

Dann wird die Gaszufuhr zum Schaumerzeuger 1 unterbrochen und das Ventil 19 geschlossen. Der Flüssigkeitsvorratsbehälter 10 und der Schaumerzeuger 1 werden durch das Ventil 12 entleert. Bei geschlossenem Ventil 12 wird der Flüssigkeitsvorratsbehälter 10 mit einer 0,15-m Kochsalzlösung als Waschmedium gefüllt, die ; mittels Phosphat auf pH 7,3 gepuffert und mit 0,1 Jo Methylcellu-

lose ergänzt worden ist. Das Waschmedium wird zum Schäumen veranlaßt und dann durch das Reaktionsgefäß 2 geleitet und schließlich durch die Leitung l8b durch das Ventil 20 abgezogen und verworfen, bis die Zellen frei von letzten Spuren des roten Nährmediums sind. Dann schließt man das Ventil 20 und leitet in das Gefäß durch die selbstdichtende Gummimembran 15 bei 37°C eine Lösung von Trypsin und dem Natriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure, um die poröse Matrix unterzutauchen. Nach 10 Minuten wird die Füllung und die Lösung 5 Minuten lang schwach bewegt, indem durch das Ventil 20 ein langsamer schwacher Strom von steriler Luft eingeleitet wird. Die Zellen, die als Ergebnis der Bewegung in der Pufferlösung suspendiert worden sind, werden durch das Ventil 20 aus dem Reaktionsgefäß 2 abgezogen. Das Bewegen wird unter Verwendung einer 0,15-tn Kochsalzlösung, die mittels Phosphat auf pH 7j3 gepuffert worden ist, wiederholt. Dann wird ein Ucö4b/Us Ib

weiterer Anteil der Pufferlösung aus Trypsin und dem Natriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure zugegeben., der ein weiterer Anteil von Kochsalzlösung folgt, die beide bewegt werden, um verbliebene Zellen zu entfernen.

Überimpfte Zellen insgesamt 8 χ

geerntete Zellen

(i) in dem abgezogenen Wachstumsmedium und g

in dem gepufferten Kochsalzwaschwasser

(ii) nach der ersten Behandlung mit Trypsin und dem Natriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure

(iii) in dem ersten bewegten Kochsalzwaschwasser

(iv) nach der zweiten Behandlung mit Trypsin und Natriumsalz der A'thylendiamintetraessigsäure

(ν) in dem zweiten bev/egten Kochsalzwaschwasser '

0,5	X	10^w
10,7		10⁶
1,95		10⁶
2,48	X	10⁶
4,13	X	10⁶
I! t-· Il VO Il <· I OD Il	X	10⁶

In der nachstehenden Tabelle sind Beispiele nach dem Verfahren vorliegender Erfindung angegeben, wobei zahlreiche menschliche Fibroblasten unter Verwendung unterschiedlicher Matrices gezüchtet worden sind.

Die in der Tabelle verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:

1000 : Strom von 1000 menschlichen Haut- un'd Muskelfibro-

blasten
: Strom von 7000 menschlichen Vorhautfibroblasten

6 0 9 8 4 9/0918

Fortsetzung	Strom von 12000 menschlichen Nasenschleimhaut-
12000 :	Epithelzellen
	Methylcellulose
meth	Fibroblasten-Wachstumsfaktor
F.G.F.	Polycarbonat
P.C.	Ascorbinsäure
VIT.C.	Polyamid ("Nylon 6")
N β	("Nylon 11")
N 11	("Nylon 12")
N 12	Polyäthylen-1 erephthalat·
PET	oxidiertes Polyäthylen-terephthalat
PET(O)	Polyphenylenoxid
PPO	Polypropylen
PP :	Polyäthylen
PE :	Polyoxymethylen
PF " :	fluoriertes Äthylen-Propylen-Mischpolymerisat
FEP :	Polytetrafluoräthylen
P.T.F.E. :	Silikon
S	Silikon
SiI	Silikon
D.C.SiI :	Stearinsäure
Stearic	Luft
	Stickstoff
N	über Nacht
G/N

609849/091 6

Beispiel

Zellen

Serum Zusätze

Substratfüllung

Gas

- 32 -

Impfung

Ertrag

\Wachs turns- Ver- Pestlehälfegungsnis dauer

4	1000(P25)	10%	-	PC	A/N/C0₂	4:2,5	1,78	4	-	0/N
VJl	1000(P25)	10%	0,1% meth	PC	A/N/C0₂	2,5 .	2,07	4	-	0/N
6	1000(P26)	10%	-	PC	A/N/C0₂	1,35	1,15	4	-	0/N
7	1000(P26)	10%	-	PC	A/N/C0₂	1,35	1,26	4	-	0/N
8	1000(P28)	10%	-	PC	A/N/C0₂	1/7	1,35	8	- .	0/N
9	1000(P28)	10%	-	PC	A/N/C0₂	1/7	1_r71	11	1	0/N
10 >	1000(P29)	10%	-	N 11	A/N/C0₂	1,9	1,46	8	-	0/N
11	1000(P29)	10%	Wi	PET(O)	A/N/C0₂	. 1_f6	1,61	8	1	0/N
12	1000(P29)	10%	-	PC/S	A/N/C0₂	1,6	1,72	8	1,08	0/N
13	1000(P29)	10%	-	PC/PTFE	A/N/C0₂	1,6	3,05	8	1/9	0/N
14	7000(P2A)	10%	-	glas;	A/N/C0₂	1/5	0,72	9	—	0/N
15	7000(P24)	10%	-	GLAS /S	A/N/C0₂	1f5	0,74	9	-	0/N
16	7000(P24)	10%	-	GLAS. /PTFE	A/N/C0₂	-1,5	0,59	9	-	0/N
17	7000(P25)	10%	-	PC/PTFE	A/N/C0₂	1,4	2,09	8	1,49	0/N
18	7000(P25)	10%	-	PC/PTFE	A/N/C0₂	1,4	2,9	. 8	2,07	0/N
19	7000(P26)	10%	-	PC/PTFE	A/N/C0₂	1_T8	1,92	4	1,07	0/N
20	7000(P26)	10%	-	PC/PTFE	A/N/C0₂	1,8	2,51	6	1,4	0/N
21	7000(P26)	10%	-	PC/PTFE	A/N/C0₂	1,8	2,80	5	1,56	0/N

CD N> N) O CD NJ

Bel- spiel	Zellen	Serum	Zusätze	Substrat füllung	Gas	- 55 - Impfung	¹ , \Wachsturns- Ver- Ertrag \-^· «*	11	2,88	Pestle- gungs- dauer
22	7000(P26)	10%	-	PC/PTFE	A/N/C0₂	1,8	5,18	7	2,02	0/N
23	7000(P26)	10%	-	PC/PTFE	A/N/C0₂	1,8	3,64	4	2,8	0/N
24	7000(P27)	10%	-	PC/PTFE	, A/C0₂	1,05	2_;94	4	2,36	0/N
25	7000(P27)	10%	-	PC/PTFE	A/C0₂	1,25	2,95	1	1,10	0/N
26	1OOO(P37)	10%	-	PC/PTFE	A/C0₂	0,9	0,99	2	1,31	0/N
27	1OOO(P37)	10%	-	PC/PTFE.	A/C0₂	' 0,9	1,18	5	2,52	0/N
28	1000(P37)	10%	-	PC/PTFE	A/C0₂	- 0,9	2,27	8	2,34	0/N
29	1000(P37)	10%	-	PC/PTFE	A/C0₂	0,9	2,11	9	2,75	0/N
30	1000(P37)	10%	-	PC/PTFE	A/C0₂	0,9	2,47	4	2,47	0/N
31	1OOO(P39)	10%	-	PC/PTFE	A/C0₂	0,8	1,98	4	2,66	0/N
32	1000(P39)	10%	-	PC/PTFE	A/C0₂	0_f8	2,13	4	%25	0/N
33	1000(P40)	10%	-	N6/PTFE	A/C0₂	0,6	0,75	4	-	0/N
34	1000(P40)	10%	-	N11/PTFE	A/C0₂	0,6	nicht; ab- sshätzbar	4	-	0/N
35	1000(P40)	10%	-	N12/PTFE	A/C0₂	0,6	It	4	1,57	0/N
36	1000(P40)	10%	-	PC/PTFE	A/C0₂	0,6	0,94	4		0/N
37	7000(P32)	10%	-	PF	A/C0₂	1,0	V	4	-	0/N
38	7000(P32)	10%	-	PF/PTFE	A/C0_p	1,0	0,335	0/N

Bel- Substratspiel Zellen Serum Zusätze füllung ,Wachs turns-

Gas

Impfung .

Ertrag

39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

7000(P32)	10%	-
7000(P31)	10%	-
7000(P31)	10%
7000(P31)	10%	-
1OOO(P23)	10%	-
1000(P23)	10%	-
1000(P23)	10%	-
1000(P24)	10%	-
1000(P24)	10%	-
1000(P24)	10%	-
1000(P26)	10%	-
10'00(P26	10%	-
1000(P26)	10%	-
1000(P26)	10%	-
1000(P26)	10%	- ·
1000(P26)	10%	-
12000(P23)	10%	-

PC/PTFE

PET/PTFE

PET(O)/PTFE

PC/PTFE

PET/PTFE

PET(O)/PTFE

PC/PTFE

PET/PTFE

PET(O)/PTFE

PC/PTFE

FEP

PPO

PPO/PTFE

PC/PTFE

A/CO₂ A/C0₂ A/CO₂ A/CO₂ A/CO₂ A/CO₂ A/C0₂ A/C0₂ A/CO₂ ' A/C0₂ A/C0₂ A/C0₂ A/C0₂ A/C0₂ A/C0₂ A/C0₂ A/C0₂

1,0

0,8

0_r8

1,25

1_r25

1,25

1_r375

1,375

1,0

0,725

0_t725

1,07 0,96
0,88
vergiftet
0,89 1,27 1_t26

Induziert

0_f25

0,685

0_f91

induziert

1t .. '

1_f24

Verhält
nis

Festlegungs dauer

7 4 4

mm

4 4 4

7
8

9
4
4

10

1,07 1,20 1,10

1,02 1,01

1_T03

O/N O/N O/N O/N O/N O/N O/N

O/N O/N O/N O/N O/N O/N O/N O/N O/N O/N

Bei- Substratspiel Zellen Serum Zusätze füllung

wachs turns- Ver-

Gas

Impfung

56	12000(P23)	10%	—	FEP	A/C0₂	1»2	0,41	4	-	0/N
57	12000(P23)	0	0.1% Meth	FEP	A/C0₂	0,8	0,59	4	-	0/N
58	12000(P24)	5%	5% FGF	,PC/PTFE.	A/C0₂	0,95	0,77	3	- ■	0/N
59	12000(P24)	10%	-	PC/PTFE	A/C0₂	1,05	0,79	3	-	0/N
60	12000(P24)	10%	-	PC/PTFE	A/C0₂	1,05	1,18	3	1,12	0/N
61 '	12000(P25)	5%	-	PC/PTFE	A/C0₂	0,8	0,675	4		2&Std.
62	12000(P25)	5%	-	PC/PTFE *	A/C0₂	0,8	0,503	4	-	16 -«
63	12000(P25)	5%	-	PC/PTFE	A/C0₂	0_T8	0,734	4	-	16 " .
64	100.0(P30)	5%	-	PC/PTFE	A/C0₂	1,0	2,03	4	2,03
65	1000(P30)	5%	mm	PC/PTFE	A/C0₂	1,0	1,45	4	1,45	*2k"*
66	1000(P24)	10%	-	PC/PTFE	A/C0₂	1,375	1,23	4	-	0/N
67	1000(P24)	10%	-	PC/PTFE	A/C0₂	1,375	1,175	4	-	0/N
68,	1000(P25)	5%		PC/PTFE	A/C0₂	0,925	0,57		-	3-Sbd.I
69	1000(P25)	5%	-	PC/PTFE	A/C0₂ .	0,925	0,42	4	-	5 \
70	1000(P25)	5%	-	PC/PTFE	A/C0₂	0,925	0,13	4	-	r V
71	1000(P25)	5%	-	PC/PTFE	A/C0₂	0,925	0,21	4	-	9- " I 1

Festlegungsdauer

Beispiel Zellen

Substrat- " 36
Serum Zusätze füllung , Gas .

Impfung

Ertrag

,Jf achs turns .er in
Tagen

Ver- Festlehältgungsnis dauer

72	1000(P27)	10%	FGF	-	VITC	FGF	PP	ι A/C0₂	0,72	0,34	4	-	3 Std.
73	1000(P27)	10%	FGF	VITC	FGF	PP	A/C0₂	0,72	0,39	4	-	5· "
" 74	1000(P28)	5%	FGF	FGF/VITC	PP	A/C0₂	1,04	0,41	4	-	3' ·-'■
75	1000(P28)	5%	FGF	-	PP	A/C0₂	1,04	0,53	4	-	3. "
76	1000(P28)	5%	VITC	-	PP	A/C0₂		0_;86	4	-	3 "
77	1000(P29)	5%1		PC	A/C0₂	1,2	0,91	4	-	3: !'
78 !	1000(P29)	5% J		PC	A/C0₂		0,53	4	-	3 "
79 !	12000(P25)	5%		PC	A/C0₂		induziert	3	-	3, ?
80	12000(P26)	5%	FC/Sil	A/C0₂	1,9	1,40	4	-	3 ¹J
81	12000(P26)	5%	PC/Sil	A/C0₂	1,9	1,46	4	-	3 "
82	1000(P26)	5%	PC/Sil	A/C0₂	2,5	induziert	2	-	3 "
83	I10Ö0(P29)	10%	PC/DC.Sil	A/C0₂	2,1	1,32	4	-	-
84	1000(P29)	10%	PC/Sil	A/C0₂	2;¹	1,29	4	-	-
85	1000(P29)	10%	PC/PTFE/Sil	A/C0₂	2f1	1,62	4	-	-
86	1000(P31)	5%	PC/Sil	A/C0₂	¹;7	0,7	4.	-	3 Std.
87	1OOO(P31)	5%	GLAS. /Stearic	A/C0₂		0,6	4	-	3 "
88	1OOO(p33)	5%	PC/Sil	A/C0₂	1f7	1,13	4	-	3 "
89	I1O00(P33)	5%	PC/Sil	A/C0₂	■v	0,9	4	- 3 "

N> N) CD

σ>
ο

JÜS1 —
spiel

Zellen

Serum .

Substrat-

PC/DC.SIl

- 37 -

Impfung

Wachstums- Ver

uer to. ·
Tagen

hält-
nis

Festle

c©
co

90

1000(p33)

. 5%..

Zusätze füllung

PP

Gas

Ertrag NT

4

gungs
dauer ,

I

CO

91

12OOO(P33)

5%

FGF

PE

A/C0₂

V

2,2 .j

4

1,21

3 SM.

"**»«.
O
€O

92

12000(P33)

596

VITC

PP

A/C0₂

¹;7 .
{

2,06 ;

k

1,0

3 "

«j
CD

93

12000(P33)

590

VITC

PP

A/C0₂

1,7 !

1,67 \

4

1,05

3 "

94

1OOO(P35)

590

VITC

PP

A/C0₂

1,36
J

1,79

4

3 "

95

1OOO(P35)

5%

FGF/VITC

PE

A/C0₂

1,36 j

1,16

4

—

3 "

96

1OOO(P35)

5%

FGF/VITC

PP

A/C0₂

1,36

0,58

4

—

3 ·■"

97

1000(P23)

5#

FGF/VITC

PP

A/C0₂

1,78

0,76 '

4

0,54

3 »

98

1000(P23)

5%

FGF/VITC

PE ' '

A/C0₂

1,97

0,896 .

2

—

3 "

99

1000(P23)

5%

FGF/VITC

PC/DC.Sil'

A/C0₂

2,56

induzier-ti

4

0,47

3 ^tf

100

1000(P24)

■ 5%

/FGF/VITC/
Uepes

PC/DC.SiI

A/N₂

1,45

1,20

4

1,69

3 "

101

1000(P24)

596/109

FGF/VITC

A/C0₂

1,45

2,45 ;

4

1,32

3 "^:

FGF/VITC/

A/C0₂

1,92 '
(2,38)

3 "

Meth

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Züchten von Zellen von Lebewesen in einlagiger Schicht, die sich fest auf einer Oberfläche einer festen porösen Matrix befindet, dadurch gekennzeichnet, daß die sich fest auf der Matrixoberfläche befindlichen Zellen mit einer Schicht eines flüssigen Nährmediums in Berührung gebracht werden, das sich von einem zusammengefallenen Schaum ableitet, der aus dem Nährmedium und einem Gas gebildet worden.ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Matrix eine Masse fester Granulate verwendet.

J>. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zylindrische oder kugelige Granulate verwendet.

k. Verfahren nach den Ansprüchen 2 oder J>, dadurch gekennzeichnet, daß man Granulate in Form von Kunststoffen, Keramik, Glas, einem inerten Metall, einem inerten Metalloxid, einem Phosphat, einem Silikat oder einem Carbid verwendet.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen von Säugetieren züchtet.

6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß man menschliche Zellen züchtet.

7. Verfahren nach Anspruch mindestens einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in dem Medium

. 609849/0916

zusätzlich eine nicht-toxische grenzflächenaktive Verbindung verwendet .

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis J, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erzeugung des Schaums ein Gas verwandet, das bis zu 10 % Kohlendioxid enthält.

9.. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man einen ausreichend stabilen Schaum verwendet, der ohne wesentliches Zusammenfallen vom Erzeugungsort zum Anwendungsort auf der Matrix überführt werden kann.

10. Verfahren nach mindestens einem .der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit einem Interferon-■ Induktor oder einem ansteckenden Virus behandelt, bevor die Zellen mit der Schicht dbs flüssigen Nährmediums in Berührung gebracht werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10.. zum Erzeugen von Interferon in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man eine einlagige Schicht von Säugetierzellen, die auf der Oberfläche einer festen porösen Matrix verankert sind, mit einem flüssigen Medium in Berührung bringt, das eine Interferon-induzierende Substanz enthält, wobei das flüssige Medium in Form einer Schicht vorliegt, die sich von einem zusammengefallenen, aus. einem flüssigen Medium und einem Gas erzeugten Schaum ableitet, und danach das Interferon abtrennt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß

man als Zellen Haut- und/oder Muskeifibroblasten verwendet.

609849/0916

13. Verfahren nach den Ansprüchen 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Interferon-induzierende Substanz eine doppelstrangige Ribonucleinsäure aus einem Virus verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch Ij5, dadurch gekennzeichnet, daß man als doppelstrangige Ribonucleinsäure eine solche verwendet, die aus mit Virusteilchen infizierten Penicillium chrysogenum isoliert worden sind.

15· Verfahren nach Anspruch 10 zur Herstellung eines Virus in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man eine einlagige Schicht von Zellen von Lebewesen, die auf der Oberfläche einer festen porösen Matrix verankert sind, mit einem flüssigen Medium in Berührung bringt, das den ansteckenden Virus enthält, wobei das Medium in Form einer Schicht vorliegt, die sich von einem zusammengefallenen, aus einem flüssigen Medium und einem Gas erzeugten Schaum ableitet, und danach das Interferon abtrennt.

16. Verfahren nach Anspruch 15* dadurch gekennzeichnet, daß man als Virus den Marek-Hühnerlähmungs-Virus oder den Maul- und Klauenseuche-Virus verwendet.

17. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 16, bestehend aus einem die zur Anhaftung der Zellen feste poröse Matrix enthaltenden Reaktionsgefäß mit einem Einlaß für das flüssige Medium und einem Auslaß für das abgezogene flüssige Medium, dadurch gekennzeichnet, daß dem Reaktionsgefäß (2) ein Schaumerzeuger (1) und Mittel zum Aufbringen des erzeugten Schaums auf zumindest einen Teil der Oberfläche der

609849/0916

festen porösen Matrix (^) zugeordnet sind

ORIGlHAL INSPECTED

609849/09 1.

Leerseite