DE2613373A1

DE2613373A1 - Radioaktiver folattest

Info

Publication number: DE2613373A1
Application number: DE19762613373
Authority: DE
Inventors: Hyman Dr Rosen
Original assignee: ROSEN INGE
Current assignee: ROSEN INGE
Priority date: 1975-03-31
Filing date: 1976-03-29
Publication date: 1976-10-21
Also published as: FR2306448B3; FR2306448A1; SE7603790L; IT1057463B; IL49283A0; BE840196A

Description

Priorität: 31. März 1975, V.St.A., Nr. 563 340

Die Erfindung betrifft einen radioaktiven Test zur Folatbestimmung in Körperflüssigkeiten und Geweben, insbesondere im Serum.

Es sind verschiedene Verfahren zur Bestimmung von Folsäure und deren Stoffwechselprodukten, die in biologischen Systemen, insbesondere im menschlichen Organismus, nebeneinander vorkommen, bekannt.Das durch die Nahrung aufgenommene und durch die normale Bakterienflora im Körper gebildete Folat liegt im wesentlichen in Form von Folsäure vor, die auch als Pteroylglutaminsäure (PGA) bezeichnet wird. Jedoch bestehen die biologisch
aktiven Formen im Serum, Erythrozyten und dergl. aus einer

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ORIGINAL INSPECTED

Anzahl von Stoffwechseiprodukten, hauptsächlich aus 5-Methyltetrahydrofölsäure. Auf den Übersichtsartikel in "The Red Cell" von John W. Harris, Harvard University Press 1965j S. 186 bis 191 wird Bezug genommen. Folsäure und die verschiedenen Stoffwechselprodukte von Folsäure werden mit dem Sammelbegriff Folate bezeichnet.

Es besteht ein Bedarf nach einem raschen und genauen Test zur Bestimmung von Folaten in Körperflüssigkeiten, wie Serum. Die bekannten Verfahren weisen beträchtliche Nachteile auf. Mikrobiologische Verfahren unter Züchtung von bestimmten Bakterien eignen sich nicht zur raschen Bestimmung. Bei einem kürzlich •vorgeschlagenen Radiotest, der auf einer kompetitiven Proteinbindung beruht, wird tritierte PGA verwendet. Dabei ist zur Tritiumbestimmung ein Szintillationsmeßgerät erforderlich. Außerdem ist dieses Verfahren, wie die meisten Verfahren, bei denen PGA als Ligand verwendet wird, mit einem gewissen Unsicherheit sfaktor behaftet, da nicht sicher ist, ob die Stoffwechselprodukte von Folsäure, die das Ziel derartiger Bestimmungen sind, eine der tritierten PGA vergleichbare Bindungsaktivität aufweisen.

1 CR

Radiotests, bei denen als Marker J, d.h. radioaktives Jod, verwendet wird, haben den allgemeinen Vorteil, daß kein Szintillationsmeßgerät, sondern lediglich ein K-Strahlendetektor erforderlich ist. Bei den bisherigen Versuchen, zur Folatbestimmung radioaktives Jod einzusetzen, trat die Schwierigkeit

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auf, daß durch Jodierung von PGA das Molekül so verändert wird, daß es durch das bindende Protein nicht mehr als Polat erkannt wird, so daß der Radiotest versagt.

Aufgabe der Erfindung ist es, unter Vermeidung der vorgenannten Nachteile ein Verfahren zur radioaktiven PolatbeStimmung zur Verfügung zu stellen, das sich schnell und einfach durchführen läßt und zu zuverlässigen Ergebnissen führt.

Gegenstand der Erfindung ist ein radioaktiver Polattest unter Bestimmung der kompetitiven Bindung zwischen dem zu bestimmenden Polat und einem radioaktiv markierten Polsäurederivat an eine ■Polat bindende Milchproteinfraktion, der dadurch gekenn-

1 25 zeichnet ist, daß man als Polsäurederivat mit J-jodiertes Polsäuretyramid verwendet.

Das erfindungsgemäß verwendete Polsäuretyramid wird durch Kondensation von Tyramin und Polsäure hergestellt. Das Produkt wird anschließend mit radioaktivem Jod jodiert, so daß man ein markiertes Polsäurederivat erhält, das gegenüber Milchprotein die gleichen Bindungseigenschaften wie Polsäure und die erwähnten Polsäure-Stoffwechselprodukte aufweist, sofern für die Bindung ein entsprechender pH-Wert gewählt wird. Es wird angenommen, daß das radioaktive Jod an die Phenylgruppe des Tyraminrests des neuen, vorerwähnten Polsäurederivats gebunden ist, und zwar als Monojodid oder Dijodid oder ein Gemisch dieser Jodide, was jeweils vom Jodierungsgrad abhängt.

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Das neue Folsäuretyramid wird vorzugsweise durch Kondensation von Tyramin mit PGA unter Verwendung eines geeigneten Carbodiimide als Kondensationsmittel hergestellt. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von 1~Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid. Weitere geeignete Carbodiimide sind in "Methods in Immunology and Immunochemistry", herausgegeben von CA. Williams u. Mitarb., New York 1967, Bd. 1, S. 150 bis 167 und "Advances in Protein Chemistry", Bd. 12, (1957), S. bis 490, beschrieben.

Beispielsweise werden 140 mg PGA, 61 mg Tyramin-hydrochlorid und 79 mg des vorerwähnten Carbodiimids in einem möglichst geringen Volumen an wasserfreiem Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird 20 Stunden bei.Raumtemperatur gerührt und anschließend in destilliertes Wasser gegossen. Der flockige Niederschlag von Fo!säuretyramid wird attzentrifugiert und mit einem Gemisch aus 2 Teilen destilliertem. Wasser, 2 Teilen Äthanol und 1 Teil Diäthyläther gewaschen. Gegebenenfalls kann das Produkt durch übliche chromatographische Verfahren, die nach-

stehend erläutert werden, gereinigt werden.

1 25
Folsäuretyramid- -jodid kann durch Vermischen der folgenden Bestandteile in der angegebenen Reihenfolge innerhalb einer Gesamtzeit von höchstens 30 Sekunden hergestellt werden:

20 ;ul einer Lösung von 5 )xg Folsäuretyramid in 5 ml Dimethyl-

125

formamid, 1 Millicurie Natrium- -jodid, 10^uI einer Lösung von 50 mg Chloramin-T in 10 ml 0,2 m S/rensen-Phosphatpuffer

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vom pH-Wert 7,4, 10 ^l einer Lösung von 120 mg Natriummetabisulfit in 10 ml 0,05 m Sirensen-Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,4 und 10 ^l einer Lösung von 200 mg Kaliumiodid in 10 ml des gleichen Puffers. Das Produkt kann gegebenenfalls durch herkömmliche Säulenchromatographie an einem vernetzten Dextran (Sephadex G-25) gereinigt werden; vgl. Advances in Protein Chemistry, Bd. 17 (1962), S. 209 bis 226: "Cross-Linked Dextrans as Molecular Sieves".

Folgende Bezeichnungen für das mit radioaktivem Jod umgesetzte Produkt kommen in Frage:

"jodiertes Folsäuretyramid;

1 25

■Folsäuretyramid-mono- ^jodid;

1 25

Folsäuretyramid-di- jodid.

Der Jodierungsgrad ist nicht kritisch, da das Produkt entsprechend seiner Radioaktivität, gemessen in Mic.rocurie pro Gewichtseinheit, eingesetzt wird.

Die chromatographische Reinigung von Tyramid und kodiertem Tyramid kann gegebenenfalls nach üblichen Verfahren vorgenommen werden. Die Verbindungen werden dabei zweckmäßigerweise in einem Gemisch aus gleichen Volumteilen 0,2 m CpH₁-SH-Lösung und 0,02 m S/rensen-Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,4 gelöst und mit der gleichen Lösung eluiert.

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Als Folat bindende Milchproteinfraktion kann Vollmilch oder entrahmte Milch verwendet werden, da diese Produkte die Proteinfraktion, die Folat bindet, enthalten. Eine andere Möglich- · keit besteht darin, die ß-Lactoglobulinfraktion, die im allgemeinen als Folatbinder in der Milch bzw. als mit dem Folatbinder verbundenes Produkt angesehen wird, nach üblichen Verfahren im gewünschten Umfang zu isolieren. Entsprechende Verfahren sind in "Milk Proteins", Advances in Protein Chemistry, Bd. 5 (1949), S. 201 bis 228 angegeben.

Die Durchführung des erfindungsgemäßen radioaktiven Folattests erfolgt nach allgemeingültigen Prinzipien, die dem Fachmann geläufig sind. In diesem Zusammenhang wird auf einen Aufsatz von Waxman u. Mitarb. "Blood", Bd. 42, S. 281 bis 290 und auf die Übersichtsartikel von Skelley u. Mitarb., "Radioimmunoassay", Clinical Chemistry, Bd. 19, (1973), S. 146 bis 186 und von Hawker, Analytical Chemistry, Bd. 45, (1973), S. 878A bis 890A, verwiesen.

Das folgende Beispiel erläutert die Durchführung des erfindungsgemäßen Radiotests.

Folgende Lösungen werden hergestellt:

1. Puffer: 150 mg Gelatine, 750 mg Tromethamin (Tris^(hydroxymethy1)-aminomethan), 100 mg Ifatriumazid und 150 mg Ascorbinsäure werden bis zu einem Gesamtvolumen von 150 ml in destilliertem Wasser gelöst und auf den pH-Wert 9,3 eingestellt.

609843/103 3,

2. Standard: 3 Nanogramm PGA pro ml in 0,2 m S/rensen-Phos-

phatpuffer vom pH-Wert 7»4.

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3. Radiofolat: 1,2 Microcuries des vorerwähnten jodierten

Folsäuretyramids in 2,5 ml 10 prozentigem wäßrigem Dimethylformamid mit einem Gehalt an 0,1 Prozent 1 ,4-Dimercapto-2,3-dihydroxybutan.

4. Folatbinder: 20 mg Rinder-ß-Lactoglo'bulin und 100 mg Gelatine

in 100 ml Wasser.

5. Aktivkohle-Adsorptionsmittel: 1,5 g Aktivkohle (NORIT-A) und

38 mg hydrolisiertes Dextran (Molekulargewicht 80 000) sowie 100 mg Natriumazid in 150 ml destilliertem Wasser.

Die Bestimmung wird folgendermaßen durchgeführt: . In neun Reagenzgläser werden jeweils 500 ^il des Puffers Nr. 1 gegeben. Anschließend werden folgende Mengen des Standard Nr. 2 zugesetzt: 0, 0, 5, 10, 20, 30 und 50^1 entsprechend einem Gesamtwert von 0, 0, 1,5, 3,0, 6,0, 9»0 und 15,0 ng/ml. In zwei weitere Reagenzgläser werden jeweils jil Puffer ohne Zusatz von Standard gegeben. Die beiden letztgenannten Proben ergeben den Kontrollwert ohne Binderzusatz (NBC).

6 0 9 8 η / 1 Π λ Ί

2. In drei, für die Serumproben bestimmte Reagenzgläser, werden jeweils 500 ^l Puffer Nr. 1 gegeben.

3. Mit Ausnahme des dritten Reagenzglases werden jeweils 10 p.1 Serum zugesetzt. Dieses dritte Reagenzglas wird nicht mit Binder versetzt und stellt das "NBC-"-Reagenzglas dar.

1 25 4. Alle Reagenzgläser werden mit 10 μΐ J-Folsäure, Reagenz

Wr. 3j versetzt und leicht vermischt.

5. Alle Reagenzgläser (mit Ausnahme der mit "JTBG" bezeichneten) werden mit 50 ^uI Folatbinder versetzt und leicht vermischt.

6. Es wird 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

7. Unter Röhren mit einem Magnetrührer werden 500 ^l Aktivkohle-Suspension, Reagenz Ur. 5, zugesetzt.

8. Man läßt das Gemisch 5 Minuten stehen und zentrifugiert 5 Minuten bei 3500 U/min.

9. Der Überstand wird in ein sauberes Reagenzglas gegossen. 10. Beide Reagenzgläser werden jeweils 1 Minute gezählt.

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Berechnung:
1.

'Bindung = r?p_w _ΠΡΜ

^o±lvIAktivkohle + ^^Flüssigkeit

2. Die Werte für die prozentuale Bindung werden gegen die Standardwerte von-ng/ml aufgetragen. Mit Hilfe dieser Eichkurve werden die Meßwerte bestimmt.

3. Gegebenenfalls wird auf den "NBC"-Wert (Kontrollwert ohne Binder) korrigiert.

Aus den vorstehenden Ausführungen ergibt sich, daß vorzugsweise Polsäure (PGA) als Standard zur Aufstellung der Eichkurve verwendet wird. Es kann aber auch 5-Methyltetrahydrofolsäure als Standard verwendet werden, sofern diese durch ein entsprechendes Reduktionsmittel geschützt wird. Beispielsweise hat sich 1,4-Dimercapto-2,3-dihydroxybutan als geeignetes Reduktionsmittel erwiesen. Diese Verbindung kommt in Form von drei Stereoisomeren vor (entsprechend der Weinsäure). Alle drei Stereoisomeren sind wirksam. Zwei dieser Isomeren, nämlich Dithiothreit und Dithioerythrit sind handelsübliche Verbindungen. Die erstere ist auch als Cleland-Reagenz bekannt. Diese Reduktionsmittel werden in einer Konzentration von nur 0,01 Prozent, bezogen auf die 5-Methyltetrahydrofolsäure verwendet. Die gleiche Wirkung wird mit Konzentrationen bis zu 0,2 Prozent erzielt« Die Verwendung von größeren Mengen Reduktionsmittel stellt eine

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unnötige Chemikalienverschwendung dar. Bei dieser Alternative enthält der Standard Fr.2 3 ng 5-Methyltetrahydrofölsäure pro ml Wasser und beispielsweise 0,3 bis 6 Picogramm 1,4-Dimercapto-2,3-dihydroxybutan.

Es sei darauf hingewiesen, daß die 5-Methyltetrahydrofölsäure auch als 5-Methyltetrahydro-PG-A bezeichnet werden kann.

Im vorstehenden Beispiel wird als Milchprotein ein Rinderprotein verwendet, .dessen pH-Optimum für die Bindung der Folate im Bereich von 9,2 bis 9,4 und vorzugsweise bei etwa 9,3 liegt. Milchproteine anderen Ursprungs weisen andere pH-Optima auf:

Proteinart pH-Optimum bevorzugter pH-Wert

Ziegenprotein etwa 9,3 bis 9,5 etwa 9,4 menschliches Protein etwa 9,4 bis 9,6 etwa 9,5

Bei Verwendung eines bindenden Proteins aus Ziegenmilch oder menschlicher Milch wird dementsprechend der pH-Wert des Puffers . 1 auf etwa 9,4 bzw. 9,5 eingestellt.

Wie bereits erwähnt, kann der Folatbinder auf der Basis ύοώ. Milchprotein verschiedenen Ursprungs sein. Vorzugsweise wird handelsübliches Rinder-ß-Iactoglobulin verwendet. Im allgemeinen stören die anderen Milchbestandteile nicht, so daß vorteilhafterweise auch durch Sprühtrocknung erhaltenes Milch pulver aus Kuhmilch oder Ziegenmilch verwendet werden kann.

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Claims

am» I I taw

Patentansprüche

^f1 ,) Radioaktiver Polattest unter Bestimmung der kompetitiven Bindung zwischen dem zu bestimmenden Polat und einem radioaktiv markierten Polinsäurederivat an eine Polat bindende Milchproteinfraktion, dadurch gekennzeichnet,

12*5
daß man als Polsäurederivat mit J-jodiertes Polsäuretyramid verwendet.
2. Polattest nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Milchproteinfraktion aus Kuhmilch verwendet.
3. Polattest nach Anspruch 2,dadurch gekennzeichnet, daß man die Bindung bei einem pH-Wert von etwa 9j2 bis etwa 9₅4 durchführt.
4. Polattest nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert von etwa 9_?3 arbeitet.
5. Polattest nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Milchproteinfraktion aus Ziegenmilch verwendet.
6. Polattest nach Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, daß man die Bindung bei einem pH-Wert von etwa 9j3 bis etwa 9>5 durchführt.

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7. Folattest nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert von etwa 9,4
arbeitet.
8. Folattest nach Anspruch !,dadurch gekennzeichnet, daß man eine Milchproteinfraktion aus menschlicher Milch verwendet.
9. Polattest nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bindung bei einem pH-Wert von
etwa 9,4- bis etwa 9,6 durchführt.
10. Polattest nach Anspruch 9, dadurch gekennze ichnet, daß man bei einem pH-Wert von etwa 9,5
arbeitet.
11. Folattest nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Eichkurve unter Verwendung von PGA als Eichsubstanz aufstellt.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Eichkurve unter Verwendung·von 5-Methyltetrahydro-PGA aufstellt, wobei gleichzeitig etwa
0,01 bis etwa 0,2 Prozent 1,4-Dimercapto-2,3-dihydroxybutan
eingesetzt werden.
13. Folsäuretyramid.

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14. ^Jodiertes Folsäuretyramid.

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15. Folsäuretyramid-mono- jodid,

1 25
16. Folsäuretyramid-di- ^jodid.

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