DE2612433A1

DE2612433A1 - Enzym-elektrode

Info

Publication number: DE2612433A1
Application number: DE19762612433
Authority: DE
Inventors: Sven Olof Dr Phil Enfors; Nils Ludvig Prof Molin; Klaus Hermann Prof Mosbach; Hans Joergen Nilsson
Original assignee: SERVOCHEM; Servo Chem AB
Current assignee: SERVOCHEM; Servo Chem AB
Priority date: 1975-03-27
Filing date: 1976-03-24
Publication date: 1976-10-14
Also published as: SE397731B; SE7503652L; US4024042A; GB1508247A

Description

ServoChem AB, Sorterargatan 6, S-162 26 Vällingby, Schweden

Enzym-Elektrode

Die Erfindung betrifft eine sterilisierbare und regenerierbare Enzym-Elektrode mit einer Meßelektrode, die eine empfindliche Oberfläche und ein mit dieser direkt oder indirekt in Berührung stehendes Enzym aufweist, und ein Verfahren zur Herstellung dieser Elektrode.

Die Enzym-Elektrode kann zur qualitativen und quantitativen Analyse von Substanzen verwendet werden, z.B. in Verbindung mit Fermentierungsprozessen oder im medizinischen Bereich für in vivo Messungen bzw. Untersuchungen von Metaboliten (Stoffwechselprodukten, z.B. Glucose, Urea usw. )_β Die Enzym-Elektrode wird dabei dem Medium ausgesetzt, das mit Bezug auf das Substrat des Enzyms analysiert werden soll. Wenn das Substrat des Enzyms in der Lösung vorhanden ist, wird das Substrat über eine semipermeable Filmschicht oder Membran auf die Enzym-Elektrode auf eine Enzym-Schicht zwischen der Membran und der Meßelektrode aufgebracht, wobei eine Enzym-Reaktion stattfindet, die von der Meßelektrode registriert wird. Statt dessen kann auch der Verbrauch des Substrats in der Enzym-Schicht registriert werden. Das von der Meßelektrode gebildete Signal ist ein Maß für die Substratkonzentration.

Bei einer bekannten Enzym-Elektrode wird ein Träger, z.B. ein Nylonstreifen, auf den ein Enzym in der Gel-Phase aufgebracht ist, in unmittelbare Berührung mit der Elektrode gebracht, und danach wird der Träger mit einer semipermeablen Membran überzogene

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Bei einer anderen bekannten Ausführung ist das Enzym durch eine semipermeable Membran in einer dünnen flüssigen Schicht . um die empfindliche Oberfläche der Meßelektrode herum eingeschlossen.

Die Verwendung dieser bekannten Enzym-Elektroden in Fermentierungsprozessen ist im wesentlichen durch Schwierigkeiten bei der Sterilisierung der Elektrode und die begrenzte Lebensdauer des Enzyms beschränkt, wobei der zuletzt genannte Faktor hauptsächlich eine Folge der Inaktivierung des Enzyms während einer kontinuierlichen Benutzung in komplexen Medien ist.

Das einfachste und wirksamste Verfahren der Sterilisierung der Meßelektrode ist die Sterilisation in einem Autoklaven. Das Enzym kann jedoch nicht in einem Autoklaven sterilisiert werden, so daß es auf andere Weise getrennt sterilisiert und danach mechanisch auf die Meßelektrode aufgebracht werden muß. Die Sterilität ist jedoch einerseits unbedingt zu fordern und andererseits bei bekannten Enzym-Elektroden nur schwer zu erreichen, da sie schon dann verlorengehen kann, wenn die Elektrode nur kurzzeitig der Luft ausgesetzt wird. Ferner ist es schwierig, diese Enzym-Elektroden während des Betriebs zu regenerieren.

Bei Verwendung einer Enzym-Elektrode in einem Fermentierungsprozeß läßt die Aktivität des Enzyms mit der Zeit nach, und zwar häufig so schnell, daß die Elektrode gar nicht erst in der Praxis eingesetzt werden kann.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Enzym-Elektrode anzugeben, deren wesentliche Teile in einem Autoklaven sterilisiert werden können. Ferner soll die Enzym-Elektrode zu kontinuierlichen Messungen über eine längere Zeit als bisher verwendet werden können.

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Nach der Erfindung weist die Enzym-Elektrode eine Meßelektrode und ein Enzym auf, das direkt oder indirekt mit dieser in Berührung steht, während eine semipermeable Membran in einem Abstand von der empfindlichen Oberfläche der Meßelektrode angeordnet ist und eine das Enzym aufweisende Kammer begrenzt. Ein Einlaßrohr und ein Auslaßrohr sind für das Ein- und Auslassen des Enzyms vorgesehen. Das Einlaßrohr kann mit einer Sterilisierungseinrichtung für das Enzym versehen sein. Das Enzym ist gewöhnlich als Lösung vorhanden, kann jedoch auch eine Suspension aus immobilisierten Enzymen aufweisen. Das Enzym kann kovalent an einen Träger gebunden, an einen Träger absorbiert sein, der in einem vernetzten Träger, mikrogekapselten oder vernetzten Enzym-Aggregat enthalten ist. Eine Immobilisierung von Enzymen führt häufig zu einer größeren Stabilität (einer längeren Lebensdauer). Enzymatische Reaktionen, die Koenzyme benötigen, können ebenfalls verwendet werden, und zwar mit Hilfe des Koenzyms, gewöhnlich Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid NAD (H) und NADP (H), das an einen wasserlöslichen Träger, z.B. Dextran, gebunden ist und über das Einlaßrohr in ähnlicher Weise zugeführt wird.

Vorzugsweise ist die Sterilisationseinrichtung ein Membranfilter, doch kann auch ein Strahlungssterilisator oder eine andere geeignete Sterilisationseinrichtung verwendet werden.

Die Elektrode kann erst ohne das Enzym in einem Autoklaven sterilisiert werden, wonach das Enzym über das Einlaßrohr eingelassen und durch die Sterilisationseinrichtung hindurch in die Enzym-Kammer der Elektrode geleitet wird. Dies läßt sich herstellen, da alle Einzelheiten, die in der Elektrode enthalten sind, in einem Autoklaven behandelt werden können.

Vorzugsweise liegt das Enzym in Form einer Lösung vor. Das Enzym kann auch mit Vorteil in Form einer Suspension aus mikrogekapselten Enzymen verwendet werden.

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Ferner kann das in der Elektrode enthaltene Enzym kontinuierlich oder intermittierend bei der oder zur Regenerierung der Enzym-Elektrode ersetzt werden. Auf diese Weise kann die Elektrode für kontinuierliche Messungen über lange Zeiten verwendet werden.

Die Erfindung wird im folgenden anhand schematischer Zeichnungen näher beschrieben. Darin zeigt

Fig. 1 ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung und

Fig. 2 ein Diagramm einer Regenerierung der Enzym-Elektrode nach der Erfindung.

Nach Fig. 1 enthält die Enzym-Elektrode 1 eine pH-Elektrode 2 in einem Halter 3. Der Halter 3 ist zylindrisch und weist eine obere Durchführung 4 für die Elektrode 2 und eine untere Durchführung 5 auf, die beide durch eine Abstandshülse 6 und zwei Schraubverschlüsse 7 und 8 zusammengehalten sind. Zwei O-Ringe dienen der Abdichtung des Behälters. Die pH-Elektrode 2 ist in der Mitte des Behälters 3 angeordnet, so daß ihre empfindliche Oberfläche 9 in der unteren Ebene der unteren Durchführung 5 liegt. Eine semipermeable Membran 11 ist mit Hilfe des Schraubverschlusses 18 direkt unter der empfindlichen Oberfläche der pH-Elektrode befestigt und begrenzt eine Kammer 10 für die Enzym-Lösung. Ein Einlaßrohr 12 und ein Auslaßrohr 13 führen durch die obere und untere Durchführung 4 und 5 in die Kammer 10. Das Einlaßrohr 12 weist eine Sterilisierungseinrichtung 14 in Form eines Membranfilters auf.

Bei der Herstellung der Enzym-Elektrode wird die gesamte Enzym-Elektrode 1 zunächst ohne das Enzym sterilisiert und danach die Enzym-Lösung über das Einlaßrohr 12 und die Sterilisierungseinrichtung 14 in die Kammer der Elektrode geleitet. Danach kann die Enzym-Elektrode benutzt werden. Eine neue Enzym-Lösung kann kontinuierlich oder intermittierend über

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das Einlaßrohr 12 zugeführt werden, wobei sie gleichzeitig sterilisiert wird. Die ursprüngliche Enzym-Lösung wird dabei über das Auslaßrohr 13 aus der Kammer hinausgedrückt.

Die Wahl der Meßelektrode und des Enzym-Präparats hängt von der Art der Reaktion ab, die durch die Enzym-Elektrode kontrolliert werden soll. Anstelle der pH-Elektrode kann beispielsweise auch eine Sauerstoff-Elektrode oder eine NH^⁺- Elektrode verwendet werden.

Fig. 2 stellt ein Diagramm einer Regenerierung der Enzym-Elektrode nach Fig. 1 dar. Als Beispiel wurde die Messung der Penicillin-Konzentration in einem Fermentor (Gärbehälter) gewählt, wobei als Meßelektrode eine pH-Elektrode und als Enzym eine Penicillinase-Lösung verwendet wurde. Die Kurve 1 (Punkte) stellt eine Eichkurve für die Enzym-Elektrode vor der Benutzung dar. Die Kurve 2 (Kreise) stellt die Empfindlichkeit bzw. Kennlinie der Enzym-Elektrode nach fünfzigstündiger Benutzung dar (nach der die Elektrode völlig unbrauchbar ist). Die Kurve 3 (Kreuze) stellt schließlich die Empfindlichkeit der Elektrode nach einer Regenerierung entsprechend dem oben beschriebenen Regenerierungsverfahren dar. Das Diagramm zeigt, daß die Regenerierung zu einer vollständigen Reproduzierbarkeit führt.

Abweichungen vom dargestellten und beschriebenen Ausführungsbeispiel liegen im Rahmen der Erfindung.

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Claims

Pat entansprüche

.'j Sterilisierbare und regenerierbare Enzym-Elektrode mit einer Meßelektrode, die eine empfindliche Oberfläche und ein mit dieser direkt oder indirekt in Berührung stehendes Enzym aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß eine semipermeable Membran in einem Abstand von der empfindlichen Oberfläche der Meßelektrode angeordnet ist und eine Kammer begrenzt, die das Enzym enthält, und daß ein Einlaßrohr und ein Auslaßrohr für das Ein- und Auslassen des Enzyms vorgesehen sind, wobei das Einlaßrohr eine Sterilisationseinrichtung für das Enzym aufweist.
2. Enzym-Elektrode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Einlaßrohr mit einer Sterilisierungseinrichtung für das Enzym versehen ist.
3. Enzym-Elektrode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym als Lösung vorgesehen ist.
4. Enzym-Elektrode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym in Form einer Suspension aus immobilisierten Enzymen vorhanden ist.
5. Enzym-Elektrode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sterilisationseinrichtung ein Membranfilter ist.
6. Enzym-Elektrode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sterilisationseinrichtung ein Strahlungssterilisator ist.
7. Verfahren zur Herstellung der Enzym-Elektrode nach Anspruch 1, die sterilisierbar und regenerierbar ist und eine Meßelektrode mit einer empfindlichen Oberfläche sowie ein Enzym

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in direkter oder indirekter Berührung mit dieser aufWeist, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßelektrode in an sich "bekannter Weise sterilisiert wird, daß das Enzym durch ein Einlaßrohr in eine Kammer geleitet wird, so daß es mit der empfindlichen Oberfläche der Meßelektrode und mit einer semipermeablen Membran, die in einem Abstand von der empfindlichen Oberfläche der Meßelektrode angeordnet ist, in Berührung kommt, und daß das Enzym kontinuierlich oder intermittierend über die Sterilisationseinrichtung und das Einlaßrohr erneuert und gleichzeitig das zuvor in die Kammer geleitete Enzym über ein Auslaßrohr entfernt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch, gekennzeichnet, daß das Enzym in Form einer Lösung in die Kammer geleitet wird·
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym in Form einer Suspension aus immobilisierten in die Kammer geleitet wird.

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