DE2532151B2 - Antiserum zur quantitativen bestimmung der abbauprodukte des fibrins und fibrinogens und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Antiserum zur quantitativen bestimmung der abbauprodukte des fibrins und fibrinogens und verfahren zu seiner herstellung

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DE2532151B2 DE19752532151 DE2532151A DE2532151B2 DE 2532151 B2 DE2532151 B2 DE 2532151B2 DE 19752532151 DE19752532151 DE 19752532151 DE 2532151 A DE2532151 A DE 2532151A DE 2532151 B2 DE2532151 B2 DE 2532151B2
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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Antiserum zur quantitiativen Bestimmung der Abbauprodukte des Fibrins und Fibrinogens und ein Verfahren zu seiner Herstellung.
Durch die Einwirkung von Plasmin auf Fibrinogen entstehen Fibrinogen-Abbauprodukte bzw. Spaltprodukte (FSP= Fibrinogen-Spaltprodukte oder auch FDP= Fibrinogen Degradation Products), die bei der Diagnose und Behandlung von erworbenen »hämorrhagischen Diathesen« zunehmend an Bedeutung gewonnen haben. Ihr Nachweis kann bei einer Reihe von Erkrankungen als wertvoller diagnostischer Hinweis dienen. Die wichtigsten Erkrankungen, bei denen Fibrinogen-Abbauprodukte auftreten, sind im folgenden kurz aufgeführt:
1. thrombotische Erkrankungen, wie venöse Thrombosen, Lungenembolie, Myocard-lnfarkt, Coronar-Thrombose,
2. bak'erielle Infektionen,
3. Car/mom,
4. Nieren- und Lebererkrankungen,
5. obstetrische Komplika'ionen.
35
4°
45
65 Die bisher verwendeten Methoden /ur Erkennung von FSP sind in der neueren Literatur miteinander verglichen worden, siehe Marder. V. |.. et. a!.. in Am. ). Meu.. 51: 71-82 [197I]. Thomas. P I1., et. al., in N. Engl. ]. Med.. 283: 663-668 [1970], sou eCarvulhu, A C. A.. et. al., in Am. J.CIin. Palhol., 62: 1U7-112(1974).
Alle diese Methoden haben so viele Nachteile, daß sie bisher keinen Eingang in die klinische Routine-Untersuchung gefunden haben.
Bei der Proteolyse des Fibrinogens mit Plasmin entsteht als erstes erkennbares Abbauprodukt das Fg-X-Spaltproduki. Es hat eine Molekulargewicht von etwa 270 000. Fg-X kann durch Thrombin zur Gerinnung gebracht werden, wodurch es sich von allen anderen aus Fibrinogen entstehenden Abbauprodukten unterscheidet. Im Verlauf der weiteren Spaltung des Fibrinogens durch Plasmin entsteht aus fg-X ein Fragment fg-Y und ein fg-D. Fg-Y hat ein Molelulargewicht von 190 000 und wird selbst weher in ein fg-D und ein fg-E gespalten, vgl. M a rde r, F. ).: »Immunologie structure of fibrinogen and its plasmin degradation products. Theoreiical and clinical considerations«, in: Fibrinogen, ed. La k i, K.. New York .and London. 1969. Seite 339-358. ferner Pizzo. S. V., et. al., in J. Biol. Chem.. 248:4574-4583(1973).
Die Fragmente fg-D und fg-E werden als Plasmin resistente Bruchstücke des Fibrinogens bezeichnet (B u d ζ y η s k ι, A. Z., et. al., in Biochem. Biophys. Acta, 147: 313-323 [1967]). Sie umfassen etwa 70% des ursprünglichen Fibrinogenmoleküls. Ihre Antigene können nur im Serum bestimm! werden, wie es /.. B. in der DT-OS 2134 928 beschrieben ist, während die Fragmente X und Y im Plasma bestimmt werden. Die Spaltprodukte des Fibrins (fb) ähneln denen des Fibrinogens, außer daß Fibrin-X (fb-X) durch Thrombin nicht mehr gerinnbar ist, da ihm die A- und B-Pcptide fehlen, die noch i.n fg-X vorhanden sind.
Zusätzlich können die Fibrinogen-Spaltprodukte lösliche Komplexe mit noch nicht abgebautem Fibrinogen bilden, ebenso wie mit Fibrinmonomeren. Die Molekulargewichte der so gebildeten Komplexe reichen von 400 000 bis zu 1 000 000.
Die wichtigste biologische Wirkung der Fibrinogen-Spaltprodukte beruht auf ihrer Antithrombin-Aktivität (solche Produkte werden auch als Antithrombin VI bezeichnet). Die Antithrombin-Aktivität der frühen Spaltprodukte (fg-X und fg-Y) ist etwa lOmal größer als die der späten Spaltprodukte (fg-D und fg-E). Elektronenmikroskopische Untersuchungen (Bang, N. V., et. al., in J. Clin. Invest., 41:935-948 [1962], Part I.) haben gezeigt, daß in Gegenwart von Fibrinogenspaltprcdukten gebildetes Fibrin sich stark von normalem Fibrin unterscheidet, wahrscheinlich in Folge einer anormalen Polymerisation.
Die Fibrin- und Fibrinogen-Spaltprodukte werden meistens mit immunologischen Methoden bestimmt, bei denen ein Fibrinogen-Antiserum verwendet wird. Diese Methoden sind zur Bestimmung solcher Spaltprodukte im Plasma ungeeignet, da das im Plasma enthaltene Fibrinogen auch mit dem Fibrinogen-Antiserum reagiert. Da die frühen FSP, wie das fg-X und die größeren Komplexe mit Thrombin gerinnbar sind und daher beim Gerinnungsvorgang aus dem Plasma entfernt werden, enthält Serum nicht das ganze Spektrum der Fibrin- und Fibrinogen-Spaltprodukte. Nur die Fragmente Y, D und E sowie die kleineren Peptide sind im Serum vorhanden, nicht jedoch das fg-X.
Bekannt sind Antiseren gegen fg-D und fg-E. Sie
/eigen keine Kreuzreaktionen gegen /\ntifibrmogen und auch nicht untereinander Sie werden /ur Unterscheidung verschiedener Fibrin- und Fibrinogen-Spaltprodukte verwendet. Bisher ist es nicht möglich gewestii. auch Antiseren gegen fg-X bzw. fb-X oder fg-Y bzw. fb-Y herzustellen, also die frühen Spaltprodukt«; des Fibrinogens. Wegen der ausgeprägten Antithrombinwirkung dieser Fibrin- bzw. Fibrinogen-Spaltprodukte wäre es wünschenswert, auch gegen diese Produkte Antiseren zu haben, um diese Spaltprodukte direkt im Plasma nachweisen zu können.
Gegenstand der Erfindung ist ein für diagnostische Zwecke geeignetes spezifisches Antiserum zur quantitativen Bestimmung der Abbauprodukte des Fibrins und Fibrinogens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es spezifisch gegen die Abbauprodukte X und Y des Fibrins und Fibrinogens gerichtet ist.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Anuses ums, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Versuchstiere mit den gereinigten Abbauprodukten X und Y des Fibrins und Fibrinogens immunisiert und das gewonnene Serum anschließend so lange bzw. so oft adsorbiert, bis das spezifische Antiserum gewonnen wird.
Ein Antiserum gemäß der Erfindung zeigt nur noch mit den frühen Abbauprodukten des Fibrins oder Fibrinogens in der Immundiffusionsieehnik nach Ouchterlony eine Reaktion, nicht aber mehr mit Plasma, Serum oder Fibrinogen.
Geeignete Adsorptionsmittel sind Heparinplasma, Citratplasma oder Plasmen, die mit anderen bekannten Antikoagulantien stabilisiert werden, wie z. B. Oxalate, Äthylendiamintetraessigsäure oder Mischungen aus diesen Plasmen. Diese Plasmen müssen so gewonnen werden, daß in ihnen keine Fibrin- oder Fibrinogen-Spaltprodukte entstehen können.
Besser für die Adsorption geeignet als die aufgeführten Plasmen sind Plasmen, die mit Glutaraldehyd polymerisiert wurden. Die Herstellung von Immunadsorbentien unter Verwendung von Glu'araldehyd und Protein-Lösungen ist von Avrameas, St., beschrieben worden (lmmunochemistry, 6: 53 — 66 [1966]). Die Protein-Lösung, die für die Herstellung des Immunadsorbens verwendet wird, kann sehr unterschiedlicher Zusammensetzung sein. Wichtig ist nur, daß in ihr alle Proteine enthalten sind, die in humanem Plasma vorkommen, mit Ausnahme der hochmolekularen Fibrinogen-Abbauprodukte.
Das einfachste und schnellste Verfahren zur Herstellung des spezifischen Antiserums gegen die frühen Abbauprodukte des Fibrinogens verwendet über Bromcyan an Sepharose gekuppeltes. Plasma. Hierbei wird in Analogie zu Arbeiten von Cuatrecasas, P., et. al. Sepharose mit Proteinlösungen über Bromcyan (BrCN) verbunden. Dieses bekannte Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Proteinen wird als Affinitätschromatographie bezeichnet (Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 61 [1968], S. 636-643).
Die verwendeten Antiseren sollten bereits vor der Aufarbeitung einen möglichst hohen Antikörper-Titer in der Doppeldiffusions-Teehnik nach Ouchterlony (Archiv Kemie Mineral. Geol. Bd. 26 B, Nr. 14: 1-9 [1948]) gegen die frühen Fibrin· und Fibrinogen-Abbauprodukte haben, da während der häufiger Adsorptionsprozesse auch Antikörper gegen die frühen Abbau-Produkte verlorengehen. Daher ist es zweckmäßig, den Titer des Serums jedes einzelnen Kaninchens vor der Adsorotion zu bestimmen und nur solche Seren zu verwenden, deren Titer zufriedenstellend sind. Man stellt sich dann einen Pool aus mehreren ausgewählten Kaninchen-Aniiseren her und gibt das Adsorptionsmittel zu dem gepoolieii Antiserum. Antikörper, d:e nicht gegen die frühen Fibrinogcn-Abbauprodukte gerichtet sind, werden an das Adsorpiionsmittel gebunden und werden anschließend, wie nachstehend beschrieben, in geeigneter Weise aus dem Serum entfernt. Durch Wiederholung der Adsorption gelangt man schließlich
ίο zu einem Antiserum, das spezifisch mit den frühen Fibrin- oder Fibrinogen-Abbauprodukten fg-X, fg-Y. fb-X und fb-Y reagiert.
Das Antiserum kann dann direkt verwendet werden, wird aber vorteilhafterweise zur Erhöhung des Titers,
is d. h. Anreicherung des Immunglobulin-Gehalts. fraktioniert. Vorteilhaft ist es sogar, wenn man vor Beginn tier Adsorptionsprozesse die Immunglobulin-G-Fraktion der Antiseren gewinnt. Besonders bewährt hat sich die Chromatographie des Serums an modifizierten De\-
ίο tränen. z.B. Sephadex G 150, und Isolierung der Immunglobulm-G-Fraktion aus den gewonnenen Fraktionen der Gelchromatographie. Die isolierte Gammagiobulin-Fraktion wird dann mit geeigneten Adsorptionsmitteln so lange adsorbiert, bis die Fraktion spezifisch nur noch mit den frühen Abbauprodukten des Fibrins oder Fibrinogens reagiert.
Das gewonnene Antiserum eignet sich besonders zum Nachweis von hochmolekularen Aobauprodukten des Fibrin:, und Fibrinogens im Plasma, was bisher nicht
}o möglich gewesen ist. In einer einfachen Versuch.sano.rdnung können mit Hilfe dieses Antiserums quantitativ die frühen Abbauprodukte des Fibrins und Fibrinogens im Plasma bestimmt werden. Dazu werden gleiche Volumina einer entsprechend verdünnten Menge des An'iserums zu einem gleichen Volumen eines verdünnten Plasmas, das Fibrinogen-Abbauprodukte enthält, gegeben, und nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten wird die entstandene Trübung bei einer Extinktion E 436 I Ig gemessen. Von diesem Meßwert ist eine Leerwertbesummung, die mit einem Normalplasma erstellt wird, abzuziehen. Der verbleibende Extinktionswert gibt mit Hilfe einer Bezugskurve den Gehalt an Fibrinogen-Abbauprodukten des geprüften Plasmas an.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1
Die durch Immunisierung von Kaninchen mit gereinigten frühen Abbauprodukten des Fibrins und Fibrinogens erhaltenen Antiseren wurden gepoolt. Zu 100 ml Kaninchenserum wurden 200 mg lyophilisiertes Heparin-Plasma gegeben und die Mischung 4 Stunden bei 37°C belassen. Anschließend wurde die Mischung für etwa 16 Stunden bei etwa +40C stehengelassen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Der Überstand wurde dann erneut mit Heparin-Plasma (200 mg/100 ml) versetzt, bei 37°C 4 Stunden inkubiert und anschließend erneut etwa 16 Stunden bei +4UC stehengelassen und der gebildete Niederschlag erneut abzentrifugiert. Der Erfolg eines jeden dieser Adsorptionsschritte wurde mit der Immundiffusionstechnik nach Ouchterlony überprüft. Der beschriebene Adsorptionsvorgang ist so oft zu wiederholen, bis das Antiserum in der Immundiffusion mit den frühen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukten eine Präzipitationslinie zeigt, jedoch nicht mehr mit Fibrinogen oder einem NormalDlasma oder einem Normalserum reagiert.
b 3
Erfahrungsgemäß ist die Adsorption 12- bis 15m.:i /u wiederholen, bevor das Antiserum spezifisch ist.
Das spezifische Antiserum wurde an einer Sephadev Cj 150 Säule Chromatographien, wobei physiologische Kochsalzlösung als Elulionspuffer verwendet wurde. s Der 2. Elutionspeak enthält die lmmungk>buim -G-Fraktion des Antiserums. Diese Fraktion wurde gepooli und mit Hilfe eines Ankonzentrierungsgerätes auf eine Protein-Konzentration von etwa 5% gebracht.
In diesem Beispiel sind Adsorptionsbedingiingen beschrieben, die zu besonders guten Frgebnissen geführt haben. Die angegebenen Bedingungen, die ,ich auf die Adsorptionsdautr, Adsorptionstemperatur und die verwendete Menge Adsorptionsplasma beziehen, lassen sich in weiten Großen variieren, ohne daß dies zu i, anderen als den beschriebenen Ergebnissen führ:.
Beispiel 2
Das durch Immunisierung mit den frühen \bbauprodukten des Fibrins und Fibrinogens gewonnene Antiserum von Kaninchen wurde an Sephadex G 150 Chromatographien, wobei physiologische Kochsalzlösung als F.luiionspuffer verwendet wurde. Der 2. F.iutions-Peak der Chromatographie wurde mit einem Ankon/entrierungsgcräi auf eine Proteinkonzentration von etwa 5% gebracht. Zu 100 ml dieser Fraktion wurden 200 mg lyophilisiertes Heparin-Plasma und die Adsorption, wie in Beispiel 1 beschrieben, duichgeführt. Der Adsorptionsschritt wurde so oft wiederholt, bis die behandelte Fraktion in der Immundiffusion nach
0 11 c h t e r I ο η y nur noch mit den frühen Fibrin- und
1 ihnnogen-Abbauprodukten reagiert, nicht aber mehr mit Fibrinogen, Normalplasma und/oder Noniialseiuni. Anschließend wurde die mit Heparin-Plasma adsorbierte Antiserum-Fraktion nochmals an modifiziertem Dextran (Sephadex G 150) Chromatographien und die lmmunglobulin-G enthaltende Fraktion gepoolt und auf einen Proteinwert von 5% ankonzentriert.
In diesem Beispiel ist die Herstellung eines mit Glutaraldehyd polymerisieren Plasmas beschrieben.
Beispiel 3
Zur Adsorption des Kaninchen-Antiserums wurde wie folgt ein Immun-Adsorbcns hergestellt. 100 ml Ionenaustauscher-Plasma wurden mit 1 M Acetat-Puffer, pH 5,0, auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Zu 100 ml dieses Plasmas wurden tropfenweise unter Rühren bei Zimmertemperatur 30 ml einer 25%igen Glutardia'.dehyd-Lösung gegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen und der Niederschlag durch Zentrifugation abgetrennt. Der Niederschlag wurde mit 100 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und 15 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Anschließend wurde zentrifugiert und der Niederschlag erneut mit physiologischer Kochsalz· lösung resuspendiert, 15 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt und erneut zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde noch einmal wiederholt. Das polymerisierte Plasma wurde anschließend durch ein feinmaschiges Sieb gepreßt. Der oben beschriebene W jsehprozcLi wurde dann noch dreimal mit dem gesiebten poKmerisierten Plasma wiederholt.
/u 100 ml Kaninchenserjm wurden 1,5g des mit Glutaraldehyd poKmerisierten Plasmas gegeber und die Mischung ' Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Anschließend blieb die Mischung für etwa 16 Stunden bei etwa +4 C stehen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugalion abgetrennt Der Überstand wurde dann erneut wie bei der oben beschriebenen I. Adsorption niit Glutaraldehyd polymerisieriem Plasma behandelt. Dieser Adsorptionsschriti ist so oft zu wiederholen, bis das Antiserum in der Immundiifusion mit den frühen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukten eine Präzipiiationslmie zeigt, jedoch nicht mehr mit Fibrinogen oder einem Normalplasma oder einem Normalserum reagiert.
Das spezifische Antiserum kann dann zur Erhöhung des Titers gegen die frühen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukie. wie im Beispiel I beschrieben, weiterverarbeitet werden. Wie im Beispiel 2 beschrieben, ist es auch möglich, das Kaninchenserum vor der Adsorption an Sephadex G 150 zu chromaiographieren und die isolierte Immunglobulin-G-Fraktion mit dem pohmerisierten Plasma zu adsorbieren.
Beispiel 4
100 ml Sepharose 4 B wurden mit 100 ml H2O verrührt. Zu dieser Suspension wurden unter Rühren bei Zimmertemperatur 10 g BrCN in 100 ml H:O gelöst gegeben. Der pH-Wert wurde mit 4 N-NaOH auf pH 11 gebrach' und für 30 Minuten durch weitere Zugabe von NaOH u.if diesem pH-Wert gehalten. Die Suspension wurde anschließend auf einer Nutsche mit 800 ml 0.1 M NaHCOj-L.ösung vom pH 8,9 gewaschen. Anschließend wurde die aktivierte Sepharose mit 100 ml 0,1 M NaHCOi pH 9,8 suspendiert und mit 10g Irischem Plasma 24 Stunden bei etwa +4"C gerührt. Diese Mischung wurde dann in ein Chromatographie-Rohr gegeben und mit 0.9%iger Kochsalzlösung gewaschen, bis kein Protein mehr eluiert wurde. 5 ml des Kaninchen-Antiserums wurden dann auf der Säule Chromatographien. Das Eluat wurde in Fraktionen gesammelt, die Proteinfraktionen vereint und auf einen Proteingehalt von etwa 6% ankonzentriert.
Der Erfolg dieser Affinitätschromatographie wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, mit der Immundiffusionstechnik nach Ouchterlony überprüft.
Die beschriebene Affinitäts-Chromatographie war so oft zu wiederholen, bis das Antiserum in der Immundiffusion spezifisch mit den frühen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukten reagiert.
Die in diesem Beispiel beschriebenen Bedigungen können in bezug auf die angegebenen Mengenverhältnisse und die anderen aufgeführten Parameter geändert werden, ohne daß dadurch wesentlich andere Ergebnisse erzielt werden.

Claims (9)

Patentansprüche:
1. Antiserum zur quantitativen Bestimmung der Abbauprodukte des Fibrins und Fibrinogens, dadurch gekennzeichnet, daß ec spezifisch gegen die Abbauprodukte X und Y des Fibrins und Fibrinogens gerichtet ist.
2 Verfahren zur Herstellung eines Annserums nach Anspruch I1 dadurch gekennzeichnet, daß man Versuchstiere mit den gereinigten Abbauprodukten X und Y des Fibrins und Fibrinogens immunisiert und das gewonnene Serum anschließend so lange bzw. so oft adsorbiert, bis das spezifische "iniiacrum gewonnen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man wiederholt mit Heparin-Plasma bzw. Citrat-, Oxalat- oder Äthylendiamintetraaeetat-Plasma adsorbiert.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antiserum wiederholt mit durch Giuiaraldehyd versetztem Plasma adsorbier!.
5. Verfahren nach Anspruch 2. dadurch gekennzeichnet, daß man Antiserum wiederholt mit Bromcyan aktivierter Sepharose adsorbiert, an das Plasma gekuppelt ist.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das spezifische Antiserum an Sephadex filtriert und die Immunglobulin-G-Fraktion isoliert.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Fraktionierung des spezifischen Anüserums die Immunglobulin-G-Fraktion isoliert.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 — 5. dadurch gekennzeichnet, daß man die Adsorption 12- bis 15mal wiederholt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 — 8, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Aufarbeitung ein Antiserum mit hohem Antikörper-Titer verwendet.
DE2532151A 1975-07-18 1975-07-18 Antisenim zur quantitativen Bestimmung der Abbauprodukte des Fibrins und Fibrinogen« und Verfahren zu seiner Herstellung Expired DE2532151C3 (de)

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