DE2532151A1

DE2532151A1 - Antiserum und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2532151A1
Application number: DE19752532151
Authority: DE
Inventors: Ronald Dr Phil Kotitschke; Wolfgang Dr Phil Stephan
Original assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Current assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Priority date: 1975-07-18
Filing date: 1975-07-18
Publication date: 1977-01-20
Also published as: DE2532151C3; DE2532151B2; NL7607289A; AT349155B; GB1527268A; ATA488376A; JPS5212922A; JPS5654586B2; CH620299A5; FR2318423B1; FR2318423A1; SE7608174L; US4147765A

Description

Biotest-Serum-Institut GmbH, 6 Frankfurt/M.-Niederrad, Flughafenstraße H

ANTISERUM ZUR QUANTITATIVEN BESTIMMUNG VON HOCHMOLEKULAREN ABBAUPRODUKTEN DES FIBRINS UND FIBRINOGENS UND VERFAHREN ZU SEINER HERSTELLUNG.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Antiserum, das spezifisch mit den durch Einwirkung von Plasmin auf Fibrin und Fibrinogen entstehenden frühen Fibrin- und Fibrinogen- Abbauprodukten bzw. Spaltprodukten (FSP = Fibrinogen-Spaltprodukte oder auch FDP = Fibrinogen Degradation Products), die in der Literatur als Fibrinogen-X (fg-X) bzw. Fibrinogen-Y (fg-Y) bezeichnet werden, reagiert und auf seine Gewinnung.

Durch die Einwirkung von Plasmin auf Fibrinogen entstehen Fibrinogen-Abbauprodukte, die bei der Diagnose und Behandlung von erworbenen "Hämorrhagischen Diathesen" zunehmend an Bedeutung gewonnen haben. Ihr Nachweis kann bei

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einer Reihe von Erkrankungen als wertvoller diagnostischer Hinweis dienen. Die wichtigsten Erkrankungen, bei denen Fibrinogen-Abbauprodukte auftreten, sind im Folgenden kurz aufgeführt:

1. Thrombotische Erkrankungen, wie venöse Thrombosen, Lungenembolie, Myocard-Infarkt, Coronar-Thrombose.

2. Bakterielle Infektionen

3. Carzinom

4·« Mieren- und Lebererkrankungen
5. Obstretische Komplikationen

Die bisher verwendeten Methoden zur Erkennung von FSP sind in der neueren Literatur miteinander verglichen worden (MARDER, V,J,, MATCHETT, M,0. , SHEHRY, S.: «Detection of serum fibrinogen and fibrin degradation products." Am.J.Med. Sl₁: 71 - 82 <19 71),

THiMAS, D.P., HIEWIAROWSKI, S., MiERS, A.R., et al? "A comparative study of four methods for detecting fibrinogen degradation products in patients with various diseases." M, Engl» J. Med« 283_ϊ 863 - SSB (197O)₅ CARVALHO, A.C.A*, ELLMAN, L*L., COLMAM, R.W.ϊ ¹¹A comparison of the staphylococcal clumping test and an agglutination test for detection of fibrinogen degradation products." Am. J. Clin. Pathol. 62_: 107 - 112 (197^)).

Alle diese Methoden haben so viele Nachteile, daß sie bis-

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her keinen Eingang in die klinische Routine-Untersuchung gefunden haben«

Bei der Proteolyse des Fibrinogens πι it Plasmin entsteht als erstes erkennbares Abbauprodukt des fg-X-Spaltprodukt. Es hat ein Molekulargewicht von etwa 2 70000. Fg-X kann durch Thrombin zur Gerinnung gebracht werden, wodurch es sich von allen anderen aus Fibrinogen entstehenden Abbauprodukten unterscheidet. Im Verlauf der weiteren Spaltung des Fibrinogens durch Plasmin entsteht aus fg-X ein Fragment fg-Y und ein fg-D. Fg-Y hat ein Molekulargewicht von 180000 und wird selbst weiter in ein fg-D und ein fg-E gespalten (MARDER, F.J.: "Immunologie structure of fibrinogen and its plasmic degradation products_o Theoretical and clinical consxderatxons." In Fibrinogen, ed. Laki, K. 1969, Parcel Dekker, Inc., New York and Edward Arnold (Publishers, Ltd.) London, 339 - 358.

PIZZO, S.V., SCHWARTZ, M₀L., HILL, R.L. , and McKEE, P.A.: "The effect of plasmin on the submit structure of human Fibrin." J.Biol.Chem. 2_48: 4574 - 4583 (1973)). Die Fragmente fg-D und fg-E werden als Plasmin-resistente Bruchstücke des Fibrinogens bezeichnet (BUDZYNSKI, A.Z., STAHL, M., KOPEC, M., LATALLO, Z., KOWALSKI, E.: "High molecular weight products of the late stage of fibrinogen proteolysis by plasmin and their structural relation to the fibrinogen molecule_β" Biochem. Biophys. Acta, 147;

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313 - 323 (1967)). Sie umfassen etwa 70% des ursprünglichen Fihrinogenmoleküls. Die Spaltprodukte des Fibrins (fb) ähneln denen des Fibrinogens, außer daß Fibrin-X (fb-X) durch Thrombin nicht mehr gerinnbar ist, da ihm die A- und B-Peptide fehlen, die noch im fg-X vorhanden sind. Zusätzlich können die Fibrinogen-Spaltprodukte lösliche Komplexe mit noch nicht abgebautem Fibrinogen bilden, ebenso wie mit Fibrinmonomeren. Die Molekulargewichte der so gebildeten Komplexe reichen von WO 000 bis zu 1 000 000,

Die wichtigste biologische Wirkung der Fibrinogen-Spaltprodukte beruht auf ihrer Ant!thrombin-Aktivität (solche Produkte werden auch als Antithrosnbin VI bezeichnet). Die Antithrombin-Ajctivität der frühen Spalt produkte <fg-X und fg-Y) ist etwa 10 mal größer als die der spaten Spaltprodukte (fg-D und fg-E). Elektronenmikroskopiscne Untersuchungen <BAMG, N. V., FLETCHER, A. P., ALKJAERSIS, N. and SHERRY, S.: Patnogenesis of tne Coagulation Defect Developing During Pathological Plasma Proteolytic <Fibrinolytic) States. -Ill Demonstration of Abnormal Clot Structur by Electron Microscopy, J. Clin. Invest. Hl; 93S - 9%8 C1982) Fart I«) laben gezeigt, daß in Gegenwart von Fibrinogenspaltprodukten gebildetes Fibrin sich stark von normales Fibrin unterscheidet ₉ wahrscheinlich in Folge einer anormalen Polymerisation*

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Die Fibrin- und Fibrinogen-Spaltprodukte werden meistens mit immunologischen Methoden· bestimmt, bei denen ein Fibrinogen-Anti serum verwendet wird. Diese Methoden sind zur Bestimmung solcher Spaltprodukte im Plasma ungeeignet, da das im Plasma enthaltene Fibrinogen auch mit dem Fibrinogen-Antiserum reagiert. Da die frühen FSP, wie das fg-X und die größeren Komplexe mit Thrombin gerinnbar sind und daher beim GerinnungsVorgang aus dem Plasma entfernt werden, enthält Serum nicht das ganze Spektrum der Fibrin- und Fibrinogen-Spaltprodukte. Nur die Fragmente Y, D und E, sowie die kleineren Peptide sind im Serum vorhanden, nicht jedoch das fg-X.

Bekannt sind Antiseren gegen fg-D und fg-E. Sie zeigen keine Kreuzreaktionen gegen Antifibrinogen und auch nicht untereinander. Sie werden zur Unterscheidung verschiedener Fibrin- und Fibrinogen-Spaltprodukte verwendet. Bisher ist es nicht möglich gewesen, auch Antiseren gegen fg-X bzw. fb-X oder fg-Y bzw. fb-Y herzustellen, also die frühen Spaltprodukte des Fibrinogens. Wegen der ausgeprägten Antithrombinwirkung dieser Fibrin- bzw. Fibrinogen-Spaltprodukte wäre es wünschenswert, auch gegen diese Produkte Antiseren zu haben, um diese Spaltprodukte direkt im Plasma nachweisen zu können.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man ein für

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diagnostische Zwecke geeignetes spezifisches Antiserum. gegen die frühen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukte durch Immunisierung von Kaninchen mit fg-X bzw. fb-X und fg-Y bzw. fb-Y und/oder einer Mischung aus fg-X bzw. fb-X und fg-Y bzw. fb-Y gewinnen kann, wenn durch genügend häufig wiederholte Adsorptionen mit Plasma oder Serum und Fibrinogen alle Unspezifitäten des gewonnen Antiserums entfernt werden, insbesondere die Kreuzreaktion mit Fibrinogen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Antiserum zur quantitativen Bestimmung von hochmolekularen Abbauprodukten des Fibrins oder Fibrinogens, die durch Einwirkung von Plasmin auf Fibrin oder Fibrinogen erhalten werden.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Antiserums gegen die hochmolekularen Abbauprodukte fg-X, fg-Y, fb-X, fb-Y des Fibrin und Fibrinogens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Kaninchen oder andere geeignete Labortiere in an sich bekannter V/eise, vorzugsweise mit hochgereinigten frühen Abbauprodukten des Fibrins oder Fibrinogens immunisiert und die gewonnenen Kaninchen-Antiseren so lange mit geeigneten Adsorptionsmitteln adsorbiert, bis das Antiserum nur nocn mit den frühen Abbau-Produkten des Fibrins oder Fibrinogens in der Immundiffusionstechnik nach Ouchterlony eine Reaktion zeigt,

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nicht aber mehr mit Plasma, Serum oder Fibrinogen reagiert. Geeignete Adsorptionsmittel sind Heparinplasma, Citratplasma oder Plasmen, die mit anderen bekannten Antikoagulantien stabilisiert werden, wie z. B. Oxalate, Äthylendiarqintetraessigsaure oder Mischungen aus diesem Plasmen. Diese Plasmen müssen so gewonnen werden, daß in ihnen keine Fibrin- oder Fibrinogen-Spaltprodukte entstehen können.

Besser für die Adsorption geeignet als die aufgeführten Plasmen sind Plasmen, die mit Glutaraldehyd polymerisiert wurden. Die Herstellung von Immunadsorbentien unter Verwendung von Glutaraldehyd und Protein-Lösungen ist von Avrameas, St. beschrieben worden. (Avrameas, S. und Terwynek, T.: "The cross-linking of proteins with Glutaraldehyde and its use for the preparation of immunoadsorbents." Immu no chemistry _§_: 53 - 66 (19 66). Die Protein-Lösung, die für die Herstellung des Immunadsorbens verwendet wird, kann sehr unterschiedlicher Zusammensetzung sein. Wichtig ist nur, daß in ihr alle Proteine enthalten sind, die in humanem Plasma vorkommen, mit Ausnahme der hochmolekularen Fibrinogen-Abbauprodukte.

Das einfachste und schnellste Verfahren zur Herstellung des spezifischen Antiserums gegen die frühen Abbauprodukte des Fibrinogens verwendet über Bromcyan an Sepharose gekuppeltes

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Plasma, Hierbei wird in Analogie zu Arbeiten von CUATRECASAS, P. et al. Sepharose 4B,(ein Agarosegel, das man erhält, wenn 4%ige Agarose-Lösung zur Gelbildung in Perlenform gebracht wird, Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit Proteinlösungen über Bromcyan (BrCN) verbunden. Dieses von CUATRECASAS beschriebene Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Proteinen wird als Affinitätschromatographie bezeichnet. (CUATRECASAS, P., WILCHEK, M. und ANFINSEN, C.B.: "Selected enzyme purification by affinity chromatography." Proceedings of the National Academy of Sciences USA 61 (1968) S. 63 6 - 643).

Die verwendeten Antiseren sollten bereits vor der Aufarbeitung einen möglichst hohen Antikörper-Titer (in der Doppeldiffusxons-Technik nach Ouchterlony (OUCHTERLONY, Ö. "Antigen-Antibody-Reaction in Gel" Archiv Kemie Mineral. Geol. Bd. 26B, No. IM-: 1-9 (1948)) gegen die frühen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukte haben, da während der häufigen Adsorptionsprozesse auch Antikörper gegen die frühen Abbau-Produkte verloren gehen. Daher ist es zweckmäßig, den Titer des Serums jedes einzelnen Kaninchens vor der Adsorption zu bestimmen und nur solche Seren zu verwenden, deren Tit er zufriedenstellend sind. Man stellt sich dann einen Pool aus mehreren ausgewählten Kaninchen-Antiseren her und gibt das Adsorptionsmittel zu dem gepoolten Antiserum. Antikörper, die nicht gegen die frühen Fibrinogen-Abbauprodukte gerichtet sind, werden an das Ad-

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sorptionsmittel gebunden und werden anschließend, wie nachstehend beschrieben, in geeigneter Weise aus dem Serum entfernt. Durch Wiederholung der Adsorption gelangt man schließlich zu einem Antiserum, das spezifisch mit den frühen Fibrin- oder Fibrinogen-Abbauprodukten fg-X, fg-Y, fb-X und fb-Y reagiert.

Das Antiserum kann dann direkt verwendet werden, wird aber vorteilhafter Weise zur Erhöhung des Titers, d. h. Anreicherung des Immunglobulin-Gehalts fraktioniert. Vorteilhaft ist es sogar, wenn man vor Beginn der Adsorptionsprozesse die Immunglobulin-G-Fraktion der Antiseren gewinnt. Besonders bewährt hat sich die Chromatographie des Serums an modifizierten Dextranen (Sephadex G 150 der Firma Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) und Isolierung der Immunglobulin-G-Fraktion aus den gewonnenen Fraktionen der Gelchromatographie. Die isolierte Gammaglobulin-Fraktion wird dann mit geeigneten Adsorptionsmitteln solange adsorbiert, bis die Fraktion spezifisch nur noch mit den frühen Abbauprodukten des Fibrins oder Fibrinogens reagiert.

Das gewonnene Antiserum eignet sich besonders zum Nachweis von hochmolekularen Abbauprodukten des Fibrins und Fibrinogens im Plasma, was bisher nicht möglich gewesen ist. In einer einfachen Versuchsanordnung können mit Hilfe dieses

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Antiserums quantitativ die frühen Abbauprodukte des Fibrins und Fibrinogens im Plasma bestimmt werden. Dazu werden gleiche Volumina einer entsprechend verdünnten Menge des Antiserums zu einem gleichen Volumen eines verdünnten Plasmas, das Fibrinogen-Abbauprodukte enthält, gegeben und nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten wird die entstandene Trübung bei einer Extinktion E 43 6 Hg gemessen. Von diesem Meßwert ist eine LeerwertsbeStimmung, die mit einem Normalplasma erstellt wird, abzuziehen. Der verbleibende Extinktionswert gibt mit Hilfe einer Bezugskurve den Gehalt an Fibrinogen-Abbauprodukten des geprüften Plasmas an.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Die durch Immunisierung von Kaninchen mit gereinigten frühen Abbauprodukten des Fibrins und Fibrinogens erhaltenen Antiseren wurden gepoolt. Zu 100 ml Kaninchenserum wurden 200 mg lyophilisiertes Heparin-Plasma gegeben und die Mischung M- Stunden bei 3 7°C belassen. Anschließend wurde die Mischung für etwa 16 Stunden bei etwa +H⁰C stehengelassen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Der Überstand wurde dann erneut mit

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Heparin-Plasma (200 mg/100 ml) versetzt, bei 3 7°C U Stunden inkubiert und anschließend erneut etwa 16 Stunden bei + 4⁰C stehengelassen und der gebildete Miederschlag erneut abzentrifugiert. Der Erfolg eines jeden dieser Adsorptions sehr it te wurde mit der Immundiffusionstechnik nach Ouchterlony überprüft. Der beschriebene Adsorptionsvorgang ist so oft zu wiederholen, bis das Antiserum in der Immundiffusion mit den frühen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukten eine Präzipitationslinie zeigt, jedoch nicht mehr mit Fibrinogen oder einem Normalplasma oder einem Normalserum reagiert. Erfahrungsgemäß ist die Adsorption 12 bis 15 mal zu wiederholen, bevor das Antiserum spezifisch ist.

Das spezifische Antiserum wurde an einer Sephadex G 150 Säule chromatographiert, wobei physiologische Kochsalzlösung als Elutionspuffer verwendet wurde. Der 2. Elutionspeak enthält die Immunglobulin-G-Fraktion des Antiserums. Diese Fraktion wurde gepoolt und mit Hilfe eines Ankonzentrierungsgerätes auf eine Protein-Konzentration von etwa 5% gebracht.

In diesem Beispiel sind Adsorptionsbedingungen beschrieben, die zu besonders guten Ergebnissen geführt haben. Die angegebenen Bedingungen, die sich auf die Adsorptionsdauer, Adsorptionstemperatur und die verwendete Menge Adsorptions-

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plasma beziehen, lassen sich in weiten Größen variieren, ohne daß dies zu anderen als den beschriebenen Ergebnissen führt.

Beispiel 2

Das durch Immunisierung mit den frühen Abbauprodukten des Fibrins und Fibrinogens gewonnene Antiserum von Kaninchen wurde an Sephadex G 150 chromatographiert, wobei physiologische Kochsalzlösung als Elutionspuffer verwendet wurde. Der 2. Elutions-Peak der Chromatographie wurde mit einem Ankonzentrierungsgerät auf eine Proteinkonzentration von etwa 5% gebracht. Zu 100 ml dieser Fraktion wurden 200 mg lyophilisiertes Heparin-Plasma und die Adsorption, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Der Adsorptionsschritt wurde so oft wiederholt, bis die behandelte Fraktion in der Immundiffusion nach Ouchterlony nur noch mit den frühen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukten reagiert, nicht aber mehr mit Fibrinogen, Normalplasma und/oder Normalserum. Anschließend wurde die mit Heparin-Plasma adsorbierte Antiserum-Fraktion nochmals an modifiziertem Dextran (Sephadex G 150) chromatographiert und die Immunglobulin—G-enthaltende Fraktion gepoolt und auf einen Proteinwert von 5% ankonzentriert<

In diesem Beispiel ist die Herstellung eines mit

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Glutaraldehy polymerisierten Plasmas beschrieben. Beispiel 3

Zur Adsorption des Kaninchen-Aritiserums wurde wie folgt ein Immun-Adsorbens hergestellt. 100 ml Ionenaustauscher-Plasma wurden mit 1 M Acetat-Puffer, pH 5,0, auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Zu 100 ml dieses Plasmas wurden tropfenweise unter Rühren bei Zimmertemperatur 30 ml einer 2 5%igen Glutardialdehyd-Lösung gegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen und der Niederschlag durch Zentrifugation abgetrennt. Der Niederschlag wurde mit 100 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und 15 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Anschließend wurde zentrifugiert und der Niederschlag erneut mit physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert, 15 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt und erneut zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde noch einmal wiederholt. Das polymerisierte Plasma wurde anschließend durch ein feinmaschiges Sieb gepreßt. Der oben beschriebene Waschprozeß wurde dann noch dreimal mit dem gesiebten polymerisierten Plasma wiederholt.

Zu 100 ml Kaηincheηserum wurden 1,5 g des mit Glutaraldehy d polymerisierten Plasmas gegeben und die Mischung 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Anschließend blieb

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die Mischung für etwa 16 Stunden bei etwa +4°C stehen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Der Oberstand wurde dann erneut wie bei der oben beschriebenen 1. Adsorption mit Glutaraldehyd-polynerisiertem Plasma behandelt. Dieser Adsorptions schritt ist so oft zu wiederholen, bis das Antiserum in der Immundiffusion mit den frühen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukten eine Präzipitationslinie zeigt, jedoch nicht mehr mit Fibrinogen oder einem Normalplasma oder einem Normalserum reagiert.

Das spezifische Antiserum kann dann zur Erhöhung des Titers gegen die frühen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukte,wie im Beispiel 1 beschrieben, weiter verarbeitet werden. Wie im Beispiel 2 beschrieben, ist es auch möglich, das Kaninchenserum vor der Adsorption an Sephadex G 150 zu Chromatographieren und die isolierte Immunglobulin-G-FEaktion mit dem polymerisiert en Plasma zu adsorbieren.

Beispiel M-

100 ml Separose 4 B wurden mit 100 ml H₃O verrührt. Zu dieser Suspension wurden unter Rühren bei Zimmertemperatur 10 g BrCN in 100 ml H₂O gelöst gegeben. Der pH-Wert wurde mit 4 N NaOH auf pH 11 gebracht und für 30 Minuten durch

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weitere Zugabe von i'JaOH auf diesem pH-Wert gehalten. Die Suspension wurde anschließend auf einer Nutsche mit 800 ml 0,1 Ά NaHCOg-Lösung vom pH 8,9 gewaschen. Anschließend wurde die aktivierte Sepharose mit 100 ml 0,1 M NaHCO₃ pH 8,9 suspendiert und mit 10 g frischem Plasma 24 Stunden bei etwa +M-⁰C gerührt. Diese Mischung wurde dann in ein Chromatographie-Rohr gegeben und mit 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen, bis kein Protein mehr eluiert wurde. 5 ml des Kaninchen-Antiserums wurden dann auf der Säule chromatographiert. Das Eluat wurde in Fraktionen gesammelt, die Proteinfraktionen vereint und auf einen Proteingehalt von etwa 6% ankonzentriert.

Der Erfolg dieser Affinitätschromatographie wurde,wie im Beispiel 1 beschrieben, mit der Immundiffusionstechnik nach Ouchterlony überprüft.

Die beschriebene Affinitäts-Chromatographie war so oft zu wiederholen, bis das Antiserum in der Immundiffusion spezifisch mit den frühen Fibrin- und Fibrinogen-Abbauprodukten reagiert.

Die in diesem Beispiel beschriebenen Bedingungen können in Bezug auf die angegebenen Mengenverhältnisse und die anderen aufgeführten Parameter geändert werden, ohne daß dadurch wesentlich andere Ergebnisse erzielt werden.

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Claims

4h

Pat entansprüc he

Antiserum zur quantitativen Bestimmung von hochmolekularen Abbauprodukten von Fibrin und Fibrinogen, hergestellt durch Immunisierung von Versuchstieren mit gereinigten hochmolekularen Abbauprodukten des Fibrins
und Fibrinogens und anschließende Adsorption.
2. Verfahren zur Herstellung eines Antiserums gegen hochmolekulare Abbauprodukte des Fibrins und Fibrinogens,
die durch Einwirkung von Plasmin auf Fibrin oder Fibrinogen erhalten werden, dadurch gekennzeichnet, daß man Versuchstiere mit den gereinigten Abbau produkt en immunisiert und das gewonnene Serum anschließend adsorbiert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man wiederholt mit Heparin-Plasma bzw. Citrat-, Oxalat- oder Äthylendiamintetraacetat-Plasma adsorbiert, bis
man das spezifische Antiserum gewinnt.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antiserum wiederholt mit durch Glutaraldehyd
versetztem Plasma adsorbiert.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Antiserum wiederholt mit Bromcyan-aktivierter

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Sepharose adsorbiert, an das Plasma gekuppelt ist.
6. Verfahren nach Ansprüchen 2-5, dadurch gekennzeichnet, daß man das spezifische Antiserurn an Sephadex filtriert
und die Imrr.unglobulin-G-Fraktion isoliert.
7. l/erfahren nach Ansprüchen 2 - 5, dadurch gekennzeichnet, daC man durch Fraktionierung des spezifischen Antiserums die Immunglobulin-G-Fraktion isoliert.
8. Verfahren nach Ansprüchen 2-5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Adsorption so oft wiederholt, bis das Antiserum spezifisch ist.
9. Verfahren nach Ansprüchen 2-0, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Aufarbeitung ein Antiserum mit hohem

Antikörper-Titer verwendet.

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