DE2404416A1 - Neurotropisch wirksames mittel und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents
Neurotropisch wirksames mittel und verfahren zu seiner herstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein neurotropisch wirksames Mittel, insbesondere zur Behandlung von bisher überhaupt
nicht oder schwierig zu behandelnder degenerativer neurologischer Krankheiten, wie amyotrophischer Lateral-'.
Sklerose, sowie ein Verfahren zur Herstellving dieses Mittels.
Degenerative neurologische Erkrankungen führen bei chronischem
Verlauf zu schwerwiegender körperlicher Invalidität, zeB. zur Paralyse, und sogar zum Tod. Obwohl die Ursachen
für solche neurologische Erkrankungen nicht immer bekannt sind, sind zahlreiche derartige Erkrankungen das Ergebnis
bestimmter Infektionen, z.B. von Virusinfektioneno Vemutlich
kommt es zu einem Haftenbleiben der die speziellen neurologischen Erkrankungen hervorrufenden Viren an den
Nervenzellenrezeptoren der motorischen Zellen des Zentralnervensystems oder zu einem Zusammenwirken der betreffenden
Viren mit den Nervenzellenrezeptoren. Einige Fachleute auf dem einschlägigen Fachgebiet vermuten, daß diese Nervenzellenrezeptoren
einzelne anatomische Nervenzellenstrukturen darstellen» Andere Fachleute glauben, daß die Rezeptoren theoretische
biophysikalische Begriffe sind, die eine der Funktionen der Nervenzellen beschreiben,, Ungeachtet der Theorie ist es
jedoch bekannt, daß Nervenzellen in einer Weise wirken, als
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ob (in der Nervenzelle) physikalische Rezeptoren existieren würden,, Es wird von Fachleuten ferner vermutet, daß
durch virenbedingte neurologische Erkrankungen zumindest
teilweise auf eine virale Schädigung der Nervenzellenrezeptoren und eine mögliche Zerstörung der Nervenzelle
zurückzuführen sind. In Jedem Falle hören die angegriffenen Nervenzellen auf, wie gesunde Zellen zu arbeiten. Die angegriffenen Nervenzellen beinhalten vermutlich einen Bereich anormaler Zustände von einer teilweisen und folglich reversiblen Schädigung bis zu einer vollständigen Zerstörung oder Neurophagie.
durch virenbedingte neurologische Erkrankungen zumindest
teilweise auf eine virale Schädigung der Nervenzellenrezeptoren und eine mögliche Zerstörung der Nervenzelle
zurückzuführen sind. In Jedem Falle hören die angegriffenen Nervenzellen auf, wie gesunde Zellen zu arbeiten. Die angegriffenen Nervenzellen beinhalten vermutlich einen Bereich anormaler Zustände von einer teilweisen und folglich reversiblen Schädigung bis zu einer vollständigen Zerstörung oder Neurophagie.
Zahlreiche degenerative neurologische Erkrankungen schreiten in heimtückischer Weise fort und verursachen langsam eine
Schädigung des Opfers. So werden solche Erkrankungen oftmals im Frühstadium selbst von erfahrenen Klinikern übersehen, wobei die Erkrankung bis zu einem Punkt fortschreiten kann, an welchem eine schwache Paralyse, ein Zucken der
Muskeln oder andere für die betreffende Erkrankung spezifische Frühsymptome beobachtet werden können. Selbstverständlich sind zu diesem Zeitpunkt bereits zahlreiche Nervenzellen geschädigt und haben damit, wie bereits ausgeführt, aufgehört, normal zu arbeiten«, Obwohl zahlreiche Chemotherapeutica bei der Behandlung solcher Erkrankungen eine lindernde oder günstige Wirkung ausüben, führen diese Erkrankungen sehr oft über eine erhöhte Paralyse und eine Beeinträchtigung der Pyramidenbahnen, die einen Gleichgewichtsverlust und ähnliche Störungen hervorruft, sogar zu einer Bulbärparalyse und eventuell zum Tod. Für zahlreiche derartige Erkrankungen ist die Prognose in der Tat höchst ungünstig« Zu derartigen Erkrankungen des Zentralnervensystems gehören beispielsweise amyjbhrophische LateralSklerose, multiple Sklerose, Kuru, akute Poliomyelitis und dgl. Da bekannte Chemotherapeutica bestenfalls das Fortschreiten der Erkrankung verlangsamen, kann man mit Hilfe
Schädigung des Opfers. So werden solche Erkrankungen oftmals im Frühstadium selbst von erfahrenen Klinikern übersehen, wobei die Erkrankung bis zu einem Punkt fortschreiten kann, an welchem eine schwache Paralyse, ein Zucken der
Muskeln oder andere für die betreffende Erkrankung spezifische Frühsymptome beobachtet werden können. Selbstverständlich sind zu diesem Zeitpunkt bereits zahlreiche Nervenzellen geschädigt und haben damit, wie bereits ausgeführt, aufgehört, normal zu arbeiten«, Obwohl zahlreiche Chemotherapeutica bei der Behandlung solcher Erkrankungen eine lindernde oder günstige Wirkung ausüben, führen diese Erkrankungen sehr oft über eine erhöhte Paralyse und eine Beeinträchtigung der Pyramidenbahnen, die einen Gleichgewichtsverlust und ähnliche Störungen hervorruft, sogar zu einer Bulbärparalyse und eventuell zum Tod. Für zahlreiche derartige Erkrankungen ist die Prognose in der Tat höchst ungünstig« Zu derartigen Erkrankungen des Zentralnervensystems gehören beispielsweise amyjbhrophische LateralSklerose, multiple Sklerose, Kuru, akute Poliomyelitis und dgl. Da bekannte Chemotherapeutica bestenfalls das Fortschreiten der Erkrankung verlangsamen, kann man mit Hilfe
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einer Chemotherapie die Wirkungen der Erkrankung nicht heilen sondern im wesentlichen nur verlangsamen.
Es würde folglich einen riesigen Portschritt bedeuten, wenn man dem Fachmann eine Therapie an die Hand geben
könnte, mit deren Hilfe sich das Fortschreiten solcher degenerativer Erkrankungen des Zentralnervensystems anhalten
oder sogar umkehren ließe.
Unter Berücksichtigung der vorherigen Ausführungen lag der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Mittel zum Stoppen
oder sogar zum Umkehren des Fortschreitens progressiver degenerativer Erkrankungen des Nervensystems, die die
Funktion der motorischen Nervenzellen von ihrem Ursprung bis zur neuromuskulären Verbindung, wie Elemente des Zentralnervensystems,
nämlich Axone, Nervenmarkscheiden und dgl., beeinträchtigen, d.h. eine Möglichkeit zur Bekämpfung
der amyotrcpMsehen Lateralsklerose, multiplen Sklerose, Kuru,
Polymyositis, bestimmter Meningitiden, Muskeldystrophie, Polyomyelitis und dgl., zu schaffen. Das betreffende Mittel
sollte sicher und wirksam sein und über längere Zeit hinweg verabreicht werden können„ Ferner lag der Erfindung noch
die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Mittels zu schaffen.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß bestimmte
modifizierte Neurotoxine die Fähigkeit besitzen, scheinbar an den motorischen Nervenzellenrezeptoren zu haften oder
sich in sonstiger Weise den motorischen Nervenzellenrezeptoren zuzuordnen und diese Rezeptoren gegen ein Haftenbleiben
oder eine Zuordnung pathogener Organismen, von Viren oder von Proteinen mit möglicherweise schädlichen Wirkungen zu
maskieren oder zu blockieren. Die modifizierten Neurotoxine stammen aus den Giften bestimmter Schlangengattungen und werden
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durch Entgiftung der toxischen Teile der Gifte unter Aufrechterhaltung des neurotropischen Charakters des
erhaltenen entgifteten Teils der Gifte und der restlichen Giftanteile hergestellt. Üblicherweise wird das Gift durch
gesteuerte Behandlung mit Sauerstoff bzw. Oxidation entgiftet,
obwohl auch andere bekannte Entgiftungsverfahren mit Ausnahme bestimmter Verfahren zur Herstellung von
Schlangensera angewandt werden können. Das entgiftete Schlangengift wird dann zur Lagerung stabilisiert. Das
Mittel gemäß der Erfindung kann aus sämtlichen Schlangengiften,
die im wesentlichen als Neurotoxine und nicht im wesentlichen als Hämatoxine wirken, gewonnen werden. Wie
jedoch später noch eingehender erläutert wird, muß das Mittel aus einem Gift gewonnen werden, das mindestens teilweise
aus einem in breitem Ausmaß in das' Zentralnervensystem eindringenden Gift, wie es beispielsweise aus der Schlangengattung
Bungarus gewonnen wird, bestehen.
Das Mittel gemäß der Erfindung wird.durch gesteuerte Entgiftung
eines mindestens teilweise aus einem neurotoxischen Schlangengift hohen Eindringvermögens (in das Zentralnervensystem)
bestehenden Gifts hergestellt. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, daß das Gift der meisten Schlangen
etwas neurotoxische und etwas hämatoxische Komponenten enthält. Die verschiedenen Sehlangejngtffcirgn lassen sich jedoch
im wesentlichen in eine erste Gruppe, nämlich deren Gift hauptsächlich über eine Störung der Blutchemie wirkt, und
eine zweite Gruppe, deren Gift hauptsächlich über eine Zerstörung
der Nervenzellenbestandteile wirkt, einteilen. Erstere Gattung/ d.h. die hämatoxischien Giftschlangen, wird äuPch die
gemeinen nordamerikanischen Höhlenvipern, wie Klapperschlange, Kupferkopfschlange und Wassermoccasinschlange, repräsentiert.
Letztere Gruppe dieser Gatbungai,d.h. die neurotoxisohen Giftschlangen,
wird durch die Kobra, Paraguda und Korallenschlange,
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repräsentiert. Es existieren jedoch graduelle Unterschiede zwischen diesen Gruppen, So ist beispielsweise
das Gift der nordamerikanischen Klapperschlange nahezu vollständig hämatoxisch, während das Gift der zentralamerikanischen Klapperschlange hämatoxisch ist, jedoch
bedeutende neurotoxische Anteile enthält. Andererseits
besitzt eine bestimmte Art der südamerikanischen Klapperschlangen, nämlich die Crotalus terrificus terrificus,
ein Gift, das extrem neurotoxisch ist. Das Gift der Paraguda, beispielsweise der Blauen Krait, ist, als Extremfall,
ein Neurotoxin so breiter Durchdringkraft, daß das Zentralnervensystem
sehr stark betroffen wird und es kaum den Biß dieser Schlange Überlebende gibt. Der Ausdruck "neurotoxisches
Schlangengift" steht hier und im folgenden für ein Schlangengift,
das hauptsächlich, jedoch nicht ausschließlich, gegenüber Nervenzellen und untergeordneten Komponenten toxisch ist.
Das Gift von Schlangen enthält eine Vielzahl chemischer Verbindungen,
einschließlich verschiedener Enzyme« Die genaue Wirkung der Enzyme in dem Gift ist noch nicht vollständig
geklärt. In der Tat können die Enzyme keine direkte Funktion bei der toxischen Wirkung des Gifts ausüben«, Die Enzyme
können andere für die Schlange wertvolle Wirkungen bei der Ausnutzung des Opfers des Bisses zu Nahrungszwecken ausüben.
So ist es beispielsweise bekannt, daß sich der Körper eines durch Schlangenbiß getöteten Tieres rascher zersetzt als der
Körper eines durch eine andere Todesart umgekommenen Tieres. Es hat sich ferner gezeigt, daß die durch Chromatographie
abgetrennten höher-molekularen Verbindungen des Kobragifts
nicht nennenswert toxisch sind. Dagegen sind die niedermolekularen Verbindungen dieses Gifts stark toxische Ungeachtet
der speziellen Verbindungen in Schlangengift wird das Mittel gemäß der Erfindung vorzugsweise aus dem gesamten
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Gift, das selbstverständlich die Enzyme enthält, hergestellt. Andererseits wurde aber auch erkannt, daß
zahlreiche Bestandteile des Gifts für den im vorliegenden Falle beabsichtigten Verwendungszweck inert sind
und von den aktiven Anteilen des Gifts angetrennt werden
könnten. Unter dem Ausdruck "Schlangengift" ist hier und im folgenden vorzugsweise das gesamte Gift, aber auch (nur)
der toxische Anteil desselben zu verstehen,, Diese Definition
gilt auch in dem Ausdruck "Schlangengift Neurotoxin".
Ohne an einer bestimmten Theorie zu hängen, wirkt das Mittel gemäß der Erfindung vermutlich derart, daß es in einem solchen
Ausmaß an den Nervenzellenrezeptoren hängen bleibt (oder sich in einem solchen Ausmaß mit den Nervenzellenrezeptoren kombiniert),
daß die Rezeptoren für ein Haftenbleiben von oder einen Angriff durch neurologische(n) Bakterien, Viren oder
Proteine-mit möglicherweise schädlichen Punktionen, nicht
mehr zur Verfügung stehen«, Auf diese Weise wird das Fortschreiten
degenerativer Nervensystemerkrankungen gestoppt. Es sei jedoch klar darauf hingewiesen, daß das Mittel gemäß
der Erfindung nicht prophylaktisch wirkt und folglich eine Virusinfektion weder verhindern noch bekämpfen kann. Die
Wirkung des Mittels gemäß der Erfindung entspricht vermutlich der Wirkung eines die Zellrezeptoren blockierenden
Mittels mit Absorption und Ausscheidung durch die Zellen, weswegen eine Dosierung erforderlich ist, bis die eindringenden
verursachenden Mittel durch die Immunreaktion des Körpers verlorengehen oder durch natürliche Auslese infolge Fehlens
zellulärer Nährfaktoren, die für die Existenz der eingedrungenen Körper oder Substanzen von wesentlicher Bedeutung sind,
verschwinden«, Folglich kann eine fortgesetzte Behandlung mit dem Mittel gemäß der Erfindung über längere Zeit hinweg erforderlich
sein, um sicherzustellen, daß die Nervenzellenrezeptoren kontinuierlich gegen einen Angriff durch die
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krankiieitsverursachenden Körper oder Substanzen abgeblockt sind.
Die Untersuchungen von Lamb und Hunter (Lancet 1:20, 1904) zeigten aufgrund histopathologischer Versuche mit durch
das neurotoxische Gift der indischen Kobra getöteten Primaten, daß praktisch sämtliche motorischen Nervenzellen
im Zentralnervensystem durch das Gift angegriffen waren. Der Erfindung lag die Erkenntnis zugrunde, daß ein solches
neurotropisches Schlangengift in einer praktisch ungiftigen Form ebenfalls dasselbe breite Spektrum motorischer Nervenzellen
erreicht und die eindringenden pathogenen Bakterien, Viren oder Proteine mit möglicherweise schädlichen Eigenschaften
abblockt oder stört» Somit muß aus den geschilderten Gründen das zur Herstellung des Mittels gemäß der
Erfindung verwendete Schlangengift aus einem neurotoxischen Gift der geschilderten Art bestehen. Da die zum Blockieren
der Nervenzellenrezeptoren erforderl ichen Giftdosen weit
größer sind als sie zu einer raschen Tötung des Patienten ausreichen würden, ist es selbstverständlich unabdingbar,
daß das Gift entgiftet wurdeo Da andererseits die wesentlichen
Bestandteile des Gifts intakt bleiben müssen, damit es die angestrebte Wirkung auf die Nervenzellenrezeptoren'
ausüben und die Rezeptoren wirksam gegen einen Angriff durch Bakterien, Viren oder möglicherweise schädliches Protein
abblocken kann, ist es ebenso unabdingbar, daß die Bestandteile des Gifts bei der Entgiftung nicht denaturiert oder
in sonstiger Weise beeinträchtigt werden. Polglich muß also erfindungsgemäß ein nicht denaturiertes, jedoch entgiftetes
Gift verwendet werden,, Das nicht denaturierte Gift wird
als "neurotropisch" bezeichnete
Um unter den geschilderten zwingenden Bedingungen eine Entgiftung des Gifts herbeiführen zu können, wird das Gift vor-
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zugsweise in der mildesten und sanftesten Weise entgiftet. Obwohl verschiedene Entgiftungsverfahren,
z.B. Behandlung mit Formaldehyd, Fluorescein, Farbstoffen, UV-Licht und dgl«,, bekannt sind, besteht die
Entgiftung erfindungsgemäß, obwohl die speziellen Entgiftungsmaßnahmen nicht besonders kritisch sind, vorzugsweise
aus einer milden Oxidation bzw. Behandlung mit Sauerstoff bei relativ niedrigen Temperaturen. In
sehr vorteilhafter Weise kann man sich hierbei, wie näher ausgeführt wird, eines modifizierten Boquet-Entgiftungsverfahren
bedienen.
Die Brauchbarkeit eines speziellen Entgiftungsverfahrens
läßt sich auf höchst bequeme Weise nach dem klassischen Semliki-Forest-Virustest ermitteln. Die Durchführung dieses
Tests ist bekannt. Hierbei wird, kurz gesagt, eine Hühnerembryofibroblasten-Zellkultur
auf einer Glasplatte mit einer gelierten Nährlösung, z.B. Hank1scher Lösung, mit Lactalbumin
abgedeckt. Hierauf wird die Zellenlage mit dem Semliki-Forest-Virus
beimpft, wobei die Anzahl der gebildeten Flecken den Titer des Virus anzeigt,, Wenn sich das spezielle Entgiftungsverfahren
für das betreffende Gift eignet, können die Hühnerzellen mit dem entgifteten Gift vor dem Impfen mit dem Testvirus gewaschen werden, worauf die Zellen dann wenige oder
keine Flecken zeigen. Wenn Jedoch eine merkliche Zahl von Flecken feststellbar ist, ist das mit dem betreffenden Gift
durchgeführte Entgiftungsverfahren zu drastisch, wobei eine unannehmbar starke Denaturierung des Gifts stattgefunden hat.
Selbstverständlich sollten bei diesem Test nahezu oder überhaupt keine Flecken feststellbar sein. Trotzdem sind, wie
ohne weiteres einsehbar ist, wenige Flecken im Vergleich zur Anzahl der Flecken bei den nicht gewaschenen Hühnerzellen,
tolerierbar. Die mit dem entgifteten Gift gewaschenen Zellen sollten zumindest eine statistisch merkliche
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Inhibierung der Fleckenbildung durch den Virus, beispielsweise eine J5O, insbesondere 50, vorzugsweise
70 bis 75 #ige Inhibierung der Flecken, zeigen. Wie später noch näher erläutert wird, können mit demselben
Test geeignete Konzentrationen des erfindungsgemäß entgifteten Gifts ermittelt werden. In der Tat zeigt dieser
Test sehr schön die Fähigkeit des entgifteten Gifts zur Verhinderung der Proliferation der viralen Flecken,,
Zusätzlich zu dem Semliki-Forest-Virustest sollte eine Prüfung des entgifteten Gifts am lebenden Tier durchgeführt
werden, um die richtige Durchführung des Entgiftungsverfahrens sicherzustellen und die Stärke oder das
Fehlen einer Toxizität festzustellen. So kann die Toxizität des jeweiligen Mittels durch Impfen üblicher Versuchstiere,
wie Mäuse, Ratten und Meerschweinchen, getestet werden. Zu diesen Versuchen können gegebenenfalls
auch Hunde und Affen herangezogen werden. Bei den Versuchstieren
dürfen im wesentlichen keine Anzeichen einer Toxizität festgestellt werden.
Wenn das spezielle Entgiftungsverfahren dem geschilderten
Standard (Semliki-Forest-Virustest und Prüfung am lebenden Tier) genügt, ist es erfindungsgemäß brauchbar. Somit muß
es sich bei dem Mittel um ein entgiftetes, neurotropisch aktives Schlangengiftderivat handeln. Die neurotropische
Aktivität läßt sich nach dem geschilderten Semliki-Forest-Virusinhibierungstest festlegen. Die neurotrope Affinität
zeigt sich in der Ansprechbarkeit eines Patienten auf eine therapeutische Behandlung.
Wie bereits ausgeführt, läßt sich das Gift bequem nach einem modifizierten Boquet-Verfahren ("Ann. Inst. Pasteur",
66079-396, 1941) entgiften. Hierbei wird zunächst eine
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Lösung des Gifts in einem geeigneten Lösungsmittel, insbesondere Wasser, zubereitet. Obwohl die jeweilige
Konzentration des Gifts in der Lösung nicht kritisch ist, läßt sich bequem eine bis zu etwa 3 gew.-$ige
Lösung herstellen. Der Lösung kann ein schaumverhinderndes Mittel zugesetzt werden, da Schlangengifte in der Regel
in Form einer Lösung zur Schaumbildung neigen» Als schaumverhinderndes Mittel kam jedes nicht-toxische inerte Mittel
verwendet werden. Zahlreiche derartige Mittel sind bekannt. Insbesondere kann man hierbei für Nahrungsmittel zugelassene
Silikonverbindungen verwenden. Zu der erhaltenen Lösung des Schlangengifts wird dann eine sauerstoffbildende Verbindung
zugesetzt. Es kann aber auch ein sauerstoffhaltiges Gas, insbesondere ein naszierenden Sauastoff enthaltendes Gas,
einfach durch die Lösung perlen gelassen werden. Andererseits kann man sich bestimmter Mechanismen, die in situ
eine Sauerstoffbildung hervorrufen, z.B. UV-Licht oder
Pluoresceinfarbstoffe, zur Bildung von Sauerstoff aus einer wäßrigen Lösung bedienen. . Noch bequemer
ist es jedoch, der Lösung chemisch reines Wasserstoffperoxid in Form einer JO^igen Lösung zusammen mit einem
Katalysator zur Aktivierung des Wasserstoffperoxids, z.B. Kupfersulfat, zuzusetzen. Da die Entgiftung auf der basischen
Seite abläuft, wird der pH-Wert der Lösung mit einer geeigneten Base, z.B. einem Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxid,
-carbonat und dgl., z.B. Natriumhydroxid, auf über 7 und vorzugsweise unter 10 eingestellt. Ferner
kann man zur Einstellung des pH-Werts auch gasförmiges Ammoniak, Ammoniumhydroxid, ein nicht-toxisches Amin und
dgl. verwenden.
In geeigneter Weise wird die Lösung mit einem üblichen Puffer, z.B. einem Alkalimetallphosphat- oder -acetatpuffer
auf einen geeigneten pH-Wert gepuffert. Wenn kein Puffer
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verwendet wird oder bei längerem Stehenlassen selbst bei Verwendung eines Puffers kann der pH-Wert sinken.
In diesem Falle können weitere Mengen einer Base zur Aufrechterhaltung des geeigneten pH-Werts benötigt
werden.
werden.
Die Lösung wird bei mäßigen Temperaturen, beispielsweise bei Temperaturen zwischen etwa 15° und 40°C
gehalten. Der obere Teil dieses Temperaturbereichs, deho Temperaturen von etwa 20° bis 400C, werden bevorzugte
Temperaturen außerhalb dieses Bereichs können zwar eingehalten werden, wobei Jedoch niedrigere Temperaturen
die Entgiftungsdauer verlängern und höhere Temperaturen eine unannehmbar starke Denaturierung des
Gifts hervorrufen können. Gelegentlich oder gegebenenfalls kontinuierlich kann die Mischung gerührt werden,,
Je nach der Temperatur und dem Jeweiligen Gift ist die Entgiftung nach bis zu etwa 30 Tagen, insbesondere
zwischen 6 und 16 Tagen, beendet, wobei das Gift in der erfindungsgemäß notwendigen Weise modifiziert worden
sein wird. Kürzere oder längere Entgiftungszeiten können dann gewählt werden, sofern die Erfordernisse des Semliki-Porest-Virustests
und der Prüfung am lebenden Tier in geeigneter Weise erfüllt werden.
Die Entgiftungsreaktion kann durch Zugabe eines Katalysatordeaktivators,
der die weitere katalytische Wirkung des Katalysators auf das Wasserstoffperoxid verhindert, abgestoppt
werden. Es gibt zahlreiche geeignete Deaktivatoren, wobei zu diesem Zweck chemisch reine Katalase bevorzugt wird.
Da das aus dem Gift hergestellte modifizierte Neurotoxin während des Entgiftungsverfahrens gebildete Ionen enthält,
die im Hinblick auf den Verwendungszweck weder erwünscht
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noch wirksam sind, werden diese Ionen, insbesondere die Kupferionen des Kupfersulfats (die als solche etwas
toxisch sind) aus dem modifizierten Neurotoxinprodukt
entfernt. Die Ionen können nach beliebigen Verfahren entfernt werden. Besonders gut eignet sich hierzu eine
übliche Dialyse mit semipermeablen Membranen. Die entgiftete Lösung wird lediglich-in eine semipermeable Membran,
z.B. aus Zelluloseacetat, eingefüllt, worauf das Ganze in einen mi^einer Phosphatpuffer/Natriumchlörid-Lösung eines
pH-Werts von 6,8 gefüllten Tank eingetaucht wird. Hierbei kommt es zu einem Übergang der unerwünschten Ionen aus der
modifizierten Neurotoxinlösung in das Salzbad. In geeigneter
Weise wird eine solche Dialyse etwa einen Tag lang bei Raumtemperatur oder etwa 1 std bis 20 Tage bei Temperaturen von
50° bis 0°C durchgeführt.
Das modifizierte Neurotoxin wird vorzugsweise filtriert, beispielsweise durch eine Reihe von Membranen mit abgestuftem
förendurchmesser, insbesondere eine Reihe von Membranen mit
einer Endmembran mit sehr kleinem durchschnittlichen Porendurchmesser, beispielsweise von etwa 0,22 Mikron, um Sterilität
zu gewährleisten· Vor der endgültigen Filtration wird der Lösung vorzugsweise das handelsübliche Konservierungsmittel
Merthiolat in einer Konzentration von 1:10000 zugesetzt. Vor der endgültigen Filtration sollte vorzugsweise
ferner der pH-Wert des Produkts durch* Zusatz einer als
Lebensmittelzusatz geeigneten, nicht-toxischen Säure, z.B. einer Mineralsäure, Essigsäure, Milchsäure und dgl., auf
unter "J, beispielsweise 6,8, eingestellt werden. Hierbei kann ebenfalls ein geeigneter Puffer verwendet werden,
um den pH-Wert auf der sauren Seite zu halten. Der spezielle pH-Wert ist nicht kritisch; pH-Werte unter 4 sind jedoch
für bestimmte Verabreichungsformen, z.B. eine subkutane Injektion, unerwünscht. pH-Werte oberhalb 4 und unterhalb 7
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werden folglich bevorzugte
Die normale Dosierung des modifizierten Neurotoxins gemäß der Erfindung für einen männlichen Patienten
mittleren Alters von etwa 79,5 kg Körpergewicht beträgt 0,7 bis 2 ml des aus einer 1 gew.-#igen Lösung
des Schlangengifts hergestellten Mittels» Die Dosierung wird für jüngere oder ältere Patienten größeren
oder geringeren Körpergewichts entsprechend eingestellt. Allgemein gesagt, können Dosen von 0,05 bis
10 ml, vorzugsweise 0,4 bis J5 ml, des aus einer 1 gewo-#igen Lösung des Schlangengifts hergestellten
Mittels verabreicht werden. PUr auf anderen als 1 gewo-#igen
Lösungen des Gifts hergestellte Mittel werden die Dosierungen entsprechend eingestellt. Obwohl einem Patienten das modifizierte
Neurotoxin nur alle zwei Wochen verabreicht werden kann, wird es zweckmäßigerweise mindestens wöchentlich und
vorzugsweise jeden zweiten Tag oder täglich, beispielsweise j5x die Woche, verabreicht. Das Mittel gemäß der Erfindung
kann oral, subkutan, intramuskulär oder intravenös verabreicht werden. Offensichtlich verliert das Mittel bei oraler
Verabreichung etwas von seiner Wirksamkeit. Bei intravenöser Verabreichung scheint die Möglichkeit eines Schocks größer
zu sein. Somit werden eine subkutane oder intramuskuläre Verabreichung bevorzugt. Gegebenenfalls kann die Lösung
entsprechend der gewünschten Verabreichungsform in übliche Tabletten, Pulver, Elexiere und Lösungen überführt werden.
Hierbei können übliche Bindemittel, Streckmittel, Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel und dgl. verwendet
werden«. Zur Herstellung von Injektionen wird jedoch eine einfache physiologische Kochsalzlösung und dgl. bevorzugt.
Wie bereits ausgeführt, ist das Mittel gemäß der Erfindung nicht prophylaktisch und beseitigt oder verhindert eine
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Infektion rait pathogenen Viren nicht. Folglich muß die
Therapie über eine unbestimmte Zeit hinweg fortgesetzt werden. Eine fortgesetzte Behandlung bietet Jedoch keine
größeren Schwierigkeiten, da es keine Kontraindikation gibt und da kein anderes Arzneimittel, außer vielleicht
Vitamin B,p, mit verabreicht werden muß. Offensichtlich
stört jedoch das Vitamin B,g als nervenaktives Material
etwas die Wirkung des Mittels gemäß der Erfindung, weswegen das Vitamin B,2 vorzugsweise nicht in Verbindung
mit dem Mittel gemäß der Erfindung gegeben wird. Andererseits scheinen Corticosteroide bei gleichzeitiger Verabreichung
mit dem Mittel gemäß der Erfindung eine synergistische
Wirkung zu entfalten und die Wirkung des Mittels gemäß der Erfindung zu intensivieren» Bei gleichzeitiger Verabreichung
von Corticosteroiden, Z0B, von Cortison, kann die Dosis des Mittels gemäß der Erfindung erniedrigt werden.
Andererseits sollte giber der Patient auch gut überwacht werden, um eine unerwünschte Arzneimittelaktivität möglichst
schnell festzustellen.
Wie bereits ausgeführt, muß das Schlangengift, aus dem das Mittel gemäß der Erfindung gewonnen wird, aus einem neuDtoxischen
Schlangengift bestehen. Es wurde jedoch zusätzlich noch gefunden, daß ein Teil des neurotoxischen Schlangengifts
ein solches mit breitem Eindringvermögen in die Zellen des Zentralnervensystems, wie es beispielsweise aus der
Gattung Bungarus erhalten wird, sein muß. Der Rest des neurotoxisehen Gifts kann in geeigneter Weise aus einem
Gift einer spezielleren Eindringfähigkeit in die Zellen des Zentralnervensystems bestehen und beispielsweise aus
der Gattung Naja, Z0B. Naja naja, Naja haja, Naja flava,
Naja hannah und Naja tripudians, gewonnen werden. In diesem Zusammenhang können auch, wie bereits erwähnt, bestimmte
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neurotoxische Arten der Gattung Crotalus, z.B· Crotalus
terrificus terrificus, verwendet werden. Zur Gattung Bungarus gehören insbesondere Bungarus multicinctus
und faseiatus* Vom Gift der Gattung Bungarus wurde gefunden, daß es die Zellen des Zentralnervensystems breit
durchdringt, weswegen ein daraus gewonnenes Mittel gemäß der Erfindung auch gegenüber Nervenzellen aktiv sein kann,
die von Mitteln aus anderen neurotoxischen Giften,selbst
anderen neurotoxischen Giften von Schlangen derselben Familie, im wesentlichen nicht beeinflußt werden.
In letzterem Zusammenhang wurde gefunden, daß das Kobragift ein etwas selektives Neurotoxin darstellt« Ein daraus
gewonnenes Mittel vermag einige Zellen, insbesondere motorische Zellen, gegen einen Virusangriff zu schützen, andere
Zellen werden dagegen nicht so wirksam geschützt, so daß durch Viren oder andere Ursachen bedingte Erkrankungen,
obwohl mit stark erniedrigter Geschwindigkeit und Beeinträchtigung, fortschreiten können. Die günstigen Wirkungen von
aus Kobragift gewonnenen Mitteln wurden verschiedentlich beschrieben (vgl«, beispielsweise Sanders und Mitarbeiter
"Antipoliomyelitis Action of Certain Toxoids, Acta Neuroveg."
Springer-Verlag, Wien (veröffentlicht aufgrund von Ergebnissen, die auf dem 60 Symposium für Vegetative Neurologie
in Straßburg am 29· September 1955 vorgelegt wurden); Sanders und Mitarbeiter "Neurotoxoid Interference With Two
Human Strains of Poliomyelitis in Rhesus Monkeys" Ann. NY Acad. Sei 58, Seite 112, 1953; Sanders "Naja flava Neurotoxoid
Interference Late In Experimental Poliomyelitis" J· Path Bact 68, Seiten I267 - 1271, 1954; Sanders und Mitarbeiter
"The Role of Naja flava Toxoid and Toxin in Experimental Poliomyelitis, Acta Neurovegitativa" 8, Selten
362 - 371, 195^; Sanders und Mitarbeiter "Neurotoxoid Interference
in Macacus rhesus Infected Intramus-cularly with
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Poliovirus" Science 127, Seiten 594 - 596, 1958; Sanders
und Mitarbeiter "Neurotoxoid Interference Principle In Pseudorabies Infection, In Vivo, Inactivation of Aujeszky
virus, Proc. 7th Inter Cong, Microbiol.", Seite 293, 1958
und Sanders "Deceleration of Degeneration of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Eight Cases" Proc. Pan Am Med Cong.
I96O0 Sämtliche genannten Literaturstellen können zur Erläuterung
der Erfindung herangezogen werden. Siehe ferner WoBe Clark "Supplementary Treatment of Herpes Simplex Infections
of the Cornea by Neurotropic Toxoids" Preliminary Report, Concilium Ophthalmologicum Acta, XVIII Congress,
Brüssel 1958 und W.B» Clark "The Use of Sanders Neurotoxoid I (Modified Snake Venom) in the Treatment of Recurrent Herpes
Simplex of the Cornea" Progress Report, Southern Medical Journal, Band 55, Nr. 9, Seiten 94? - 951, September I962.
Auch diese beiden Literaturstellen können zum Verständnis der Erfindung herangezogen werden. Die modifizierten Heurotoxine
des Kobragifts brachten beträchtliche Vorteile, sie waren jedoch nicht fähig, das Portschreiten mancher neurologischer
Erkrankungen zu stoppen. Ferner konnten die aus dem Kobragift alleine hergestellten modifizierten Neurotoxine
nicht vollständig entgiftet werden, da hierbei die Stärke und der gewünschte Effekt verlorengingen. So konnte
der Versuch am lebenden Tier niemals eine vollständige Entgiftung zeigen. Selbstverständlich besteht bei Verabreichung
eines nicht vollständig entgifteten giftigen Schlangengifts eine mehr oder minder große Gefahr. Selbet bei solchen modifizierten
Neurotoxinen wurde die gesamte entgiftete Lösung verabreicht. Bestimmte Bestandteile derselben verursachten
jedoch andere unerwünschte toxische Nebenwirkungen als sie das Gift selbst hervorruft.
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Wie bereits ausgeführt, muß das Mittel gemäß der Erfindung aus einem Gift hergestellt werden, das
mindestens teilweise aus einem Gift mit breitem Eindringspektrum, d.h. aus einem Gift der Gattung
Bungarus, stammen. Obwohl das Bungarus-Gift dem Naja-Gift ähnelt, unterscheiden sich die beiden Gifte
hinsichtlich der Intensität der physiologischen Wirkung und der für die physiologische Wirkung erforderlichen
Zeit. Das Naja-Gift wirkt intensiver und rascher. Andererseits ist das Bungarus-Gift nicht so selektiv wie
das Kobra-Gift und gegenüber einem breiteren Bereich von Nervenzellen aktiv. Polglich erhält man durch Kombinieren
von Bungarus-Gift mit Naja-Gift bessere Ergebnisse als mit Naja-Gift alleine oder Bungarus-Gift alleine,
obwohl das Bungarus-Gift alleine im Gegensatz zum Bungarus-Gift alleine wirksam ausgenutzt werden kann.
Obwohl das Verhältnis Naja-Gift zu Bungarus-Gift nicht innerhalb enger Grenzen kritisch ist und in der Tat nur
Bungarus-Gift verwendet werden kann, soll man vorzugsweise mit einem Gemisch aus Naja-Gift und Bungarus-Gift im Gewichtsverhältnis
400:1 bis 8:1, vorzugsweise etwa 80:1 bis 40:1, arbeitenο
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.
Dieses Beispiel veranschaulicht die neurotropen Eigenschaften neurotoxischer Schlangengifte, die nach einem
modifizierten Boquet-Verfahren entgiftet wurden.
Im vorliegenden Falle wurden Poliomyelitisviren der Type I (Brunhilde) und Type II (Lansing) verwendet» Der Brunhilde-
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Virus wurde als 1:5-Emulsion in 20$ Kaninchenserum
in keimfreiem destillierten Wasser bei einer Temperatur von -5O°C gelagert. Die Emulsion stammte aus
vereinigten cervicalen und lumbalen Rückenmarksvergrößerungen intracerebral infizierter Rhesusaffen mit
ersten Anzeichen einer Paralyse, Der Lansing-Virus wurde ebenfalls bei einer Temperatur von -3O0C in
einer 2O56igen Mäusegehirnauf schwemmung gelagerte Die
intracerebrale LD,-0 bei Mäusen schwankte zwischen
10"*'2 und 1O"*'5 .
Als Versuchstiere wurden Macacusrhesusaffen und CPW-Mäuse
verwendet. Sämtliche Virusinjektionen erfolgten auf intracerebralem oder intrathUamischem Wege, Bei den Affen wurde
als Testvirus der Virus der Type I (Brunhilde-Virus) verwendet«
Bei der Cerebraltechnik wurden verdünnte Virusaufschwemmungen in die parietalen oder frontalen Gehirnbezirke
der Affen injiziert.
Die verwendeten Gifte stammten aus den Giften der südafrikanischen
Kobra Naja flava und der südamerikanischen Klapper schlange Crotalus terrificus terrificuse Die Gifte wurden
nach einem modifizierten Boquet-Verfahren entgiftet. Wegen der Erfordernisse der speziellen Neurotoxine waren hierbei
Änderungen erforderliche So hat es sich gezeigt, daß höhere Konzentrationen an Wasserstoffperoxid (in Form einer
Lösung) zweckmäßiger waren und daß sich bei Zugabe von Formalin eine bessere Entgiftungskurve erreichen ließ. Ferner
mußte, da ein stabiles Neurotoxin benötigt wurde, sicher gestellt werden, daß die Entgiftungsreaktion zum Abschluß
gebracht wurde. Dies wurde durch Zugabe von Katalase und durch Ändern des schwachalkalischen pH-Werts der Lösung auf
einen Wert von 6,8 zum Zeitpunkt der Katalasezugabe bewerkstelligt.
Die Änderung des pH-Werts war erforderlich, da die Entgiftung im alkalischen Bereich weitergeht.
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1K) g getrocknetes Naja f lava-Gift wurden in einen Kolben eingetragen
und schrittweise mit etwa 38OO mi einer wäßrigen
Phosphatpufferlösung eines pH-Werts von 1,6 bis 7,8 und
einer kleinen Menge eines handelsüblichen Antischaummittels
versetzt. Der Kolben wurde gelegentlich geschüttelt, bis das gesamte Gift in Lösung gegangen war. Zu diesem Zeitpunkt
wurden dann j$6 g NaCl zugegeben. Nach Zugabe von
2,0 ml einer frisch zubereiteten 1,Obigen CuSOw-Lösung
wurde der Kolben kräftig rotieren gelassen. Während der Kolben noch rotierte, wurden langsam 80 ml einer handelsüblichen
j30#igen HgOg-Lösung und dann 8 ml 28#igen Formalins
zugegeben. Der Kolbeninhalt wurde schließlich in einen 4l kolben überführt, worauf der Kolben mit der Pufferlösung auf
k 1 aufgefüllt wurde. Das Ganze wurde schließlich in einen 6 1 fassenden Florence-Kolben gegossen, worauf der Kolben
mit einem mit Wachspapier bedeckten, Gaze und Baumwollstopfen zugestopft und schließlich in einen yj°G warmen
Inkubator gestellt wurde.
Die Entgiftungsgeschwindigkeit war vorhersagbar, sie wurde jedoch täglich durch den Versuch am lebenden Tier überprüft.
Dies geschah durch intravenöses Indizieren verschiedener Mengen der mit 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung auf
ein konstantes Volumen gebrachten Testlösung in 20 g schwere CFW-Mäuse. Wenn 0,5 ml der unverdünnten Lösung zum Tode von
etwa 50$ der Mäuse führte, wurde die Lösung aus dem Inkubator
entnommen und das Entgiftungsverfahren durch Zugabe von handelsüblicher Katalase rasch abgestoppt. Um sicherzustellen,
daß genügend' Katalase zur Zerstörung von überschüssigem Peroxid zugegeben worden war, wurde ein glimmendes Holzstäbohen
in den Kolbenhals eingeführt. Sofern noch eine freie sauerstoffabgebende Reaktion ablief, begann das Holzstäbchen
zu brennen. Um den Abbruch der Entgiftungsreaktion noch weiter sicherzustellen, wurde der pH-Wert der Lösung, der während
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des Entgiftungsverfahrens auf etwa 7,6 gehalten worden war, auf etwa 6,8 erniedrigt. Es sei an dieser Stelle
darauf hingewiesen, daß es erforderlich sein kann, während der Inkubationsperiode NaOH-Pellets oder eine Natriumhydroxidlösung
zuzusetzen, da der pH-Wert gerne abfällt. Nach beendeter Entgiftung wurde Chlorotone zugesetzt, dann durch
ein K 2-aeitz-Klärfilter vorgefiltert und schließlich durch
Filtrieren der Lösung durch ein großes S 1-Seitz-Pilter
sterilisiert. Nun konnte das Mittel auf Flaschen gefüllt und ohne Änderung der Wirkungskraft in einem Kühlschrank
aufbewahrt werden. Bei der Durchführung der geschilderten Maßnahmen wurden folgende Substanzmengen verwendet;
Getrocknete Naja flava-Gift 40,0 g Wäßrige Phosphatpufferlösung
| (pH-Wert 7,6) | 5800 ml |
| Antischaummittel | Spuren |
| NaCl | 56 g |
| CuSOh (l,O#Lge Lösung) | 2 ml |
| H2O2 (30#ige Lösung) | 80 ml |
| Formalin (39#ige Lösung) | 8 ml |
| Wäßrige Phosphatpufferlösung | |
| zum Auffüllen auf | 4000 ml |
| Katalase | nach Bedarf |
| Chlorotone | 8 g |
Wurde das modifizierte Boquet-Verfahren mit Crotalus terrificus terrificus-Gift durchgeführt, verlief die
Entgiftungsreaktion rascher. Um ein den genannten Anforderungen genügendes Crotalus terrificus terrifious-Mittel
zu erhalten, wurde (im Vergleich zu den geschilderten Maßnahmen) mit dem halben Volumen Wasserstoffperoxid und Formalin
gearbeitet. Selbst bei dieser Modifizierung wurde die Peroxidteilentgiftungsphase in der Regel innerhalb
von 15 std zum Abschluß gebracht. Nach Zugabe von Katalase
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wurde dann die Crotalus terrificus terrificus-Lösung
bei einem pH-Wert von 7*6 wieder in den Inkubator überführt. Das Entgiftungsverfahren lief weit langsamer
weiter ab, wobei dessen Ergebnisse über den Mäusetest verfolgt werden konnten. Innerhalb von 2 bis 3 Tagen
wurde ein zufriedenstellendes Produkt erhalten. Die Reaktion ließ sich durch Ändern des pH-Werts auf 6,8,
Filtrieren und Lagern des Mittels bei einer Temperatur von 4°C beenden. Der Versuch am lebenden Tier zur Überprüfung
des Crotalus terrificus terrificus-Mittels entsprach dem Versuch am lebenden Tier, der mit dem Naja
flava-Mittel durchgeführt wurde.
6 Rhesusaffen wurden intracerebral mit etwa 50 0
(paralysierende Dosis bei 50# der Versuchstiere)
Brunhilde-Virus beimpft«, 24 std später erhielten 3 der
Versuchstiere eine einzige Injektion (3/8 ml/kg Körpergewicht) des von Naja flava stammenden Mittels, die restlichen
3 Versuchstiere wurden als Vergleichstiere behandelt und erhielten keine Injektionen. Am siebten Tag nach der
Infektion waren bei den 3 unbehandelten Versuchstieren entweder Tetraplegie oder schwere Paralyseerscheinungen feststellbar.
Die 3 behandelten Versuchstiere zeigten keine auch nur irgendwie gearteten Anzeichen von Erkrankung.
Am neunten Tag, an dem bei sämtlichen 3 nicht behandelten Versuchstieren Tetraplegie feststellbar war, begann die
Erkrankung bei den 3 behandelten Versuchstieren erst feststellbar zu werden. Bei der behandelten Gruppe waren am
neunten, elften und dreizehnten Tag Paralyseerscheinungen feststellbar. Dies bedeutete eine durchschnittliche Inkubationsdauer
von 11 Tagen im Vergleich zu einer durchschnittlichen Inkubation von 7 Tagen bei den nicht behandelten Versuchstieren.
Dies stellt für den Fachmann einen drastischen Immunitätstest dar, wobei die geschilderten Ergebnisse ohne
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weiteres die hervorragende Wirksamkeit des neurotropen Mittels erkennen lassen«
In ähnlicher Weise wurden 58 unbehandelte Vergleichsrhesusaffen einem Immunitätstest mit Poliomyelitis unterworfen,
wobei lediglich 1 Affe überlebte0 Im Gegensatz
dazu überlebten von 272 dem Immunitätstest unterworfenen
und behandelten Rhesusaffen 69, wobei 22 keine Krankheitszeichen zeigten und 1VJ in hauptsächlich leicht paralysiertem
Zustand überlebten«, Angesichts dieses drastischen Immunitätstests zeigte sich auch hier wieder die ausgeprägte
Wirksamkeit des neurotropen Mittels gemäß der Erfindung.
Die folgende Tabelle A zeigt die Ergebnisse ähnlicher Immunitätstests, wobei das Mittel auf therapeutischer
Grundlage verwendet wurdeβ Nachdem die Versuchstiere
infiziert und (daraus) willkürlich Gruppen ausgewählt worden waren, wurde kein Versuchstier behandelt bzw.
enthielt kein Versuchstier das Mittel, bis bei dem Versuch ein deutliches Auftreten von Paralyse feststellbar
war, d„ho bis ein oder mehrere Versuchstier(e) in jeder
Gruppe so weit paralysiert erschienen, daß dies ohne Manipulation durch den Käfig feststellbar war. An diesem
Tag, bei dem es sich um den 5· Tag nach der Infektion handelte, wurde die Behandlung auf festgelegte Weise
eingeleitet. Wie aus Tabelle A ersichtlich ist, zeigten nahezu 50$ der behandelten Versuchstiere keine stärkeren
Paralyseanzeichen, Ein Vergleich der 45,8# an gut überlebenden
Tieren in den behandelten Gruppen mit 0$ in den beiden Vergleichsgruppen zeigt die hervorragende Wirksamkeit
des neurotropen Mittels bei der betreffenden Erkrankung,
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Nr. Nr.
Mittel
Maus LD ml
Rv (ml Mittel pro Anzahl der infi- Gut überlebende
kg Körpergewicht
des Affenj++
des Affenj++
zierten Rhesusaffen
Affen+++
Anzahl
40 NP 40 NP 44 NP 44NP
0,6 0,6 0,3 0,3
(Vergleichstiere)
(Vergleichstiere)
0,4
0,4
0,1
0,2
0,4
0,1
0,2
6 6
6 6 6 6
0 0
3 2
0 0
) 45,8
++) Die für Jedes Mittel angezeigte Dosis wurde am 5«, 6., 7.,8. und 11„ Tag nach der Injektion
verabreicht.
+++) "Gut überlebend" heißt, daß der betreffende Affe kein Anzeichen von Poliomyelitis zeigte.
ro
CD
Bei einem ähnlichen Versuch mit 99 behandelten Tieren und 24 unbehandelten Vergleichstieren wurde mit der
Verabreichung des Mittels erst 6 Tage nach der intracerebralen Injektion begonnen. Keines der 24 unbehandelten
Vergleichstiere überlebte. Bei der behandelten Gruppe überlebten
17 Tiere entweder leicht paralysiert oder ohne Paralyse. Auf diese 125 Versuchstiere wird deshalb speziell
verwiesen, weil der Immunitätstest extrem hart war« Es wurden nämlich 50 PDc0 pro Versuchstier intracerebral injiziert.
Bei der behandelten Gruppe von Versuchstieren überlebten einige Versuchstiere trotz Verabreichung des
Mittels erst zu einem Zeitpunkt, an dem bereits eine Anzahl der Versuchstiere Paralyseerscheinungen zeigte.
Bei einer ähnlichen Versuchsreihe wurden 56IOO Mäuse intracerebral
mit Lansing-Virusaufschwömmungen injiziert. Eine Gruppe wurde mit dem Mittel gemäß der Erfindung behandelt,
die andere Gruppe diente nach Behandlung mit einem Placebo als Vergleich. Wenn die tägliche Paralyse- und Todesquote
sowohl für die Placebovergleichstiere als auch die mit dem Mittel behandelten Gruppen graphisch aufgetragen wurde,
folgten die Vergleichstiere innerhalb der erwarteten Grenzen einer Geraden. Bei den behandelten Gruppen war zwischen dem
4. und 7· Tag nach der Infektion eine Abweichung von bereits 50# weniger befallenen und sterbenden Tieren feststellbar. Die
beiden Kurven trafen sich jedoch entweder abrupt oder schrittweise« Bei den Überlebenden in sämtlichen Gruppen war am Ende
der 30-tägigen Versuche kein Unterschied feststellbar, was das Erfordernis für eine Dauerbehandlung veranschaulicht,
40 g getrocknetes Naja naja-und 0,5 g getrocknetes Bungarus
multicinctus-Gift wurden in j}600 ml einer wäßrigen Phosphates 409832/1005
pufferlösung eines pH-Werts von 7,5 eingetragen, worauf Spuren eines handelsüblichen Silikon-Antischaummittels
zugegeben und das Gemisch zur Lösung der Gifte gerührt wurde. Nun wurden unter Rühren 2 ml einer l#igen Lösung
von chemisch reinem Kupfersulfat zugesetzt» Nach der
Zugabe von 80 ml jJO^igen Wasserstoffperoxids wurde die
Lösung in einen geeichten Kolben gegossen und mit der wäßrigen Phosphatpüfferlösung auf 4000 ml aufgefüllt.
Unter überwachung des pH-Werts wurde die Lösung dann bei einer Temperatur von JfJ0C inkubiert. Der pH-Wert
wurde, falls erforderlich, durch Zugabe einer 1 η Hydroxidlösung auf etwa 7,5 gehalten. Aliquote Teile
der Lösung wurden täglich auf ihre Toxizität hin untersucht, indem jeweils 0,5 ml unverdünnte Lösung intraperitoneal
in 20 g schwere Muse eingeimpft wurde0 Nach
14-tägiger Entgiftung starben 20 derart beimpfte Mäuse
innerhalb von 24 std nicht. Die Entgiftung wurde ferner getestet, indem 350 g schwerenMeerschweinchen jeweils
5 ml der unverdünnten Lösung verabreicht wurden. Innerhalb von 24 std starb hierbei kein Meerschweinchen. Die Masse
der Lösung wurde nun mit 3mg Katalase pro ml Lösung gemischt
und in einen Celluloseacetatdialysiersack gegossen. Bei dem speziell verwendeten Dialysiersack handelte es sich
um einen solchen mit Poren von 0,22 Mikron Durchmesser. Der geschlossene Dialysiersack wurde in eine Dialysierflüssigkeit
aus 1 Gewichtsteil Sörenson-Puffer und 3 Gewichtsteilen 0,9# NaCl-Lösung? Ein Volumen der Lösung wurde gegen 9 Volumina
Dialysierflüssigkeit dialysiert. Hierauf wurde die Lösung durch Klärmembranen und endlich durch ein 0,22 Mikron-Filter
filtriert. Nach Zugabe von Natriumäthylmercurithiosalicylat in einer Konzentration von 1/10000 wurde der pH-Wert
der Lösung mit In Chlorwasserstoffsäure auf 6,8 eingestellt.
Der Semliki-Porest-Virustest zeigte eine gute Fleckeninhibierung« Das fertige Mittel wurde nun noch hin-
+) gelegt - 26 -
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sichtlich seiner Sterilität und durch einen Versuch am lebenden Tier auf seine Toxizität und Sicherheit
hin untersucht.
Es sei darauf hingewiesen, daß zwischen den Mitteln der Beispiele 1 und 2 mehrere wesentliche Unterschiede
bestehen. Aus dem Mittel des Beispiels 1 wurden das Formalin und Chlorotone entfernt, das Mittel des Beispiels
2 wurde dialysiert. Ferner wurde die endgültige Filtration des Mittels des Beispiels 2 über eine Reihe
von Membranen mit einer Endmembran eines Porendurchmessers von 0,22 Mikron bewerkstelligt. Schließlich wurde
hierbei noch Natriumäthylmercurithiosalycilat in einer Konzentration von 1/10000 Teilen zugegeben. Wesentlich
wichtiger ist jedoch, daß das Mittel des Beispiels 2 das entgiftete Bungarus-Gift enthält und im Vergleich
zum Mittel des Beispiels 1, das eine Resttoxizität aufweist, ungiftig ist,
Das Beispiel 2 wurde mit 1 g Bungarus multicinctus/wiederholt.
Die Mittel der Beispiele 1, 2 und 3 wurden zu klinischen
Untersuchungen herangezogen« Das Mittel des Beispiels 1 zeigte die allgemeinen Störeffekte des entgifteten neurotoxischen
Schlangengifts mit Naja-Gift alleine. Die Mittel der Beispiele 2 und 3 zeigten bessere Ergebnisse,
Zur Interpretation der mit den betreffenden Mitteln erreichten Therapieergebnisse war es notwendig, den klinischen Zustand
der Erkrankung der Patienten zu klassifizieren, da zum
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Zeitpunkt der Behandlung verschieden stark fortgeschrittene Stadien der amjdfcrophischen Lateral Sklerose
gegeben waren. Es sei darauf hingewiesen, daß das spezielle Krankheitsbild in seinem Verlauf bei den
verschiedenen Individuen abweichen konnte. Dies gilt auch bei einer Krankheit, deren Verlauf wie bei der
amyotrophischen LateralSklerose eigentlich vorhersehbar
ist. Die Einteilung in der Tabelle 1 gibt die Schwere der Erkrankung der untersuchten Patienten wieder.
In Tabelle 2 ist die therapeutische Ansprechbarkeit der gemäß Tabelle 1 klassifizierten Patienten aufgezeichnet.
Es wurde eine Gruppe von 4l Patienten mit amyotrophischer Lateralsklerose vorgestellt. In Jedem
Falle wurde die Diagnose "amyotrophische LateralSklerose"
von einem qualifizierten Neurologen gestellt und von einem zweiten Neurologen oder einer anerkannten Klinik bestätigt.
Die Ergebnisse, die ein brauchbares therapeutisches Verhalten andeuten, stammten von einer Anzahl/bis zu 12 Jahren
überlebenden Patienten. Bei der Bewertung des Überlebens des Patienten ist es selbstverständlich erforderlich, die
Schwere der Erkrankung zum Zeitpunkt des Beginns der Therapie in Rechnung zu stellen. Der Krankheitsverlauf während
der Therapie ist in Tabelle 2 beschrieben. Neben dem eigentlichen überleben wurden Besserungen der Muskelfunktion ohne
Umkehr der neurologischen Anzeichen erreicht. Eine Anzahl von Patienten haben nicht nur im Hinblick auf das Überleben
sondern auch im Hinblick auf ihr Befinden, auf die Erhaltung
bestimmter Punktionen und auf eine Minimierung von Bulbärsymptomen
angesprochen.
Aus Tabelle 2 geht ferner hervor, daß in fortgeschrittenen Fällen von amyotrophischer Lateralsklerose mit offensichtlich
- 28 409832/1005
irreversibler Histopathologie sowie in fortgeschrittenen Fällen, in denen zu Beginn der Behandlung Bulbärsymptome
vorherrschten, therapeutische Fehlschlage zu verzeichnen waren. Andererseits sei beispielsweise die Aufmerksamkeit
auf den Patienten Nr. 7 gelenkt, bei dem ein hohes therapeutisches
Ansprechen festzustellen war. In Tabelle 2 steht "M-N" für "modifiziertes Neurotoxin".
409832/1005
Tabelle 1
Einteilung der klinisch getesteten Patienten
Einteilung der klinisch getesteten Patienten
Klasse
I Begrenztes Betroffensein verschiedener Muskelgruppen; in der Regel keine
offensichtlichen oder frühzeitigen Pyramidenbahnanzeichen; keine bulbären Zeichen; möglicherweise stark ausgeprägtes Fasciculieren; geringe oder keine
Symptome des oberen motorischen Neurons; Paralyse begrenzt und schlaff;
II ein oder zwei Glied(er) gelähmt; keine bulbären Anzeichen; Pyramidenbahn +
J^. (in der Regel + Jedoch noch früh); geringfügig und unregelmäßig bis zahlreich
ο und häufig auftretendes Fasciculieren; geringfügige oder keine Symptome des
cd oberen motorischen Neurons;
oo
oo
ω III Betroffensein der Pyramidenbahn ; diffuse Erkrankung mit Paralyse bzwo Lähmung '
^ und Parese; Fasciculieren; obere Motorik schwankend, die Betz-Zellen sind jedoch ^ ro
_^ in der Regel geschädigt, in der Regel einige BulbärSymptome; Herumgehen ist unter j>. ^
ο Schwierigkeiten möglich; von alleine essen ist möglich; hierbei handelt es sich ο '
ο um ein explosives Potential mit nahezu sicherem, raschem Verfall; j>·
IV schwere, diffuse, schlaffe Paralyse mit etwas Spasmus; Pyramidenbahn- und Bulbär- —*
Symptome; Fasciculieren +; Herumgehen und Nahrungsaufnahme von alleine nicht mög- cd
lieh, bei Unterstützung und mit Hilfe einer Gehhilfe kann eine geringe Bewegung
möglich sein;
V a) klinisch nicht völlig terminal, kann Jedoch aufgrund des Erscheinungsbilds plus
der Dauer des Betroffenseins als terminal angesehen werden; BulbärSymptome schwankend,
in der Regel zumindest mäßig; Tetraplegie +;
b) extreme BulbärSymptome mit überraschend geringer Glied- oder Rumpfparalyse; explosiv
nahes Endstadium wegen des anatomischen Erscheinungsbilds.
Zusammenfassung der klinischen Tests mit an amyotrophischer Lateralsklerose^ /η / /-ίο
leidenden Patienten bei der Therapie mit modifizierten Neurotoxinen
(jeden zweiten Tag wurden 0,8 bis 1,2 ml des Mittels injiziert)
| Patient Nr, |
Erkrankung vor der Thera pie (Rx) |
Einteilung während der Therapie (Rx) |
verwendetes Mittel des Beispiels |
Dauer der The rapie (Rx) |
| 1 | 11 Monate | III Bulbärsymtome + |
1 & 2 | 11 Jahre & 9 Monate |
| 2 N |
50 Monate | III Bulbärsymtome - |
1 | 6+ Jahre |
24 Monate
IH-IV Bulbärsymtome ++
19 Monate
III-IV
Bulbärsymtome +
6 Jahre
Monate
Bemerkungen:
Minimale Pyramidenbahnsymtome; bleibt gehfähig und bulbärnegativ;
Kann noch arbeiten;
Beinfunktion ist gut. Die Punktion der Arme und Hände ist schlecht, sie
sind jedoch nicht völlig funktionslos. Es wurde Depomedrol verwendet
(einzige Ausnahme), Bulbärsymtome fraglich; Bilaterale Pyramidenbahn +; Tod infolge eines Kardiovasikulärleidens;
Rasches Fortschreiten der amyotro- **
phischen Lateralsklerose mit Bulbäysymtomen in 2 Jahren vor der Therapie
mit modifizierten Neurotoxlrieri; Die Bulbärparalyse schritt während
der Therapie sehr langsam fort. Tod infolge Bulbärparalyse;
Deutliche Pyramidenbahnschädigvug; Die ursprüngliche klinische Prognose
für die Lebensdauer betrug etwa 12 Monate; Lebte 52 Monate; Eindeutige,
jedoch zeitweilige funkt1onelIe 3es-
m D
TABELLE 2 (Fortsetzung)
12-24 Monate 111-17 ·
Bulbärsymtome +
16 Monate III-I7
Bulbärsymtome +
serung während der Therapie; Verbessertes Befinden; Friedlicher Tod
infolge Bulbarparalyse;
Monate Unregelmäßige Verabreichung von modifizierten Neurotoxih en; Der Neurologe
stellte eine zeitweilige Besserung fest, nach einem Jahr "status quo"; Kontakt verloren;
Nach 8 Mo- Unregelmäßige Dosierung und Verabnaten Kon- reichung; Zeitweiligerwiderwillen;
takt verloren Funktionelle Besserung während dreier Monate und "status quo" nach drei
Monaten; Nach δ Monaten wurde kein modifiziertes Neurotoxin mehr verabreicht;
12-24 Monate Vb
Jahr
5 Monate
Vb Monate
Extreme Bulbarparalyse zu Beginn der Therapie mit modifizierten Neurotoxinen;
Dies ist das einzige Beispi<ä eines funktionellen Ansprechend bei
einer derartigen Bulbarparalyse; Arme und Beine überraschend gut;; l
Gute Besserung während 6 Monatan v>J Geringfügige Skelettmuskeldegcneration;
etwa im 7· Monat der Txifc- '
rapie hörte die Besserung auf;
Tetfminale Bulbarparalyse; Die Arme
und Beine besaßen eine recht &utc
Funktion; Tod durch Bulbarparalyse; Therapeutischer Fehlschlag;
TABELLE 2 (PortSetzung)
1/2 Monate
Vb
10
Monate
III Bulbärsymtome -
| 409832/ | 11 | 12 | Monate | III Bulbärsymtome |
| 100 5 | ||||
| 12 | Monate | V a&b |
Monate Terminale Bulbärparalyse; Bilate-
• rale Pyramidenbahnschädigung; Mäßige Gliedmaßenfunktion; Tod durch BuI-bärparalyse;
Therapeutischer Fehlschlag;
Jahr & Diffus fortschreitende amytrophische Monate Lateralsklerose; Kurze Perioden deutlicher
funktioneller Besserung, dann Rückschritt; Einstellung der Therapie mit modifizierten Neurotoxinen
nach 1 Jahr und 8 Monaten. Tod etwa 6o Tage später; Vermutlich amyotrophische
Lateralsklerose, Ursache nicht bekannt;
Jahr Unregelmäßige Therapie mit modifizierten Neurotoxinen; Der Patient ι
folgte den Anweisungen nicht; Pyramidenbahnschädigung; In der Vergangenheit CVS/Herzlungenembolie/Prostata-Komplikationen;
Bulbärparalyse fraglich; Tod wahrscheinlich durch
Bronchiopneumonie; Kein post mortem;
Monate Weniger als einen Monat' nach Beginn der Behandlung mit modifizierten
Neurotoxinen bescheinigte der zugezogene Neurologe eine deutliche Besserung; Die Stimme war fester gevrorden;
Der Daumen, der etwa zwei Jahre lang nicht bewegt worden war, zeigte etwas Abduktion und Adduktion; Keine
Besserung der Lähmung der Füße; ■innerhalb von zwei Monaten war bei diesem Patienten eine Kräftigung,
240U16
4 Monate
III
Bulbärsymtome +
26 Monate
III
Bulbärsymtome -
O CO OO CO
Monate
III
Bulbärsymtome -
insbesondere im Quadricepsbereich und in den Händen feststellbar;
Monate Diffuse amyotrophische Lateralsklerose,
die vom Zeitpunkt der Frühdiagnose rasch fortschritt; Trotz kurzer sporadischer Perioden
funktionellerBesserung setzte sich bei diesem Patienten der unerbittliche
Verlauf der amyotrophischen Lateralsklerose fort;
Jahr Relativ langsamer Krankheitsverlauf j Der Patient wurde nach etwa
siebenmonatiger Therapie mit Isoprinosine vorgestellt; Unter dem
Einfluß von Isoprinosine waren deutliche Degenerationserschei- ,
nungen feststellbar. Bei der Therapie mit modifizierten Neuroto- \jj
xinen war eine temporäre Besserung t und/oder ein status quo feststellbar.
Nach dem Absetzen der modifizierten
Neurotoxine. schritt die Degeneration rasch fort; 2 Monate
später Tod durch amyotrophische Lateralsklerose;
Jahr Der Patient sprach auf die modifizierten Neurotoxine gut an. Bei
mehr als einjähriger Therapie eine, wenn überhaupt,+geringfügige Degeneration.
Komplikationen: Prostataentzündung (alt) und Bruch des Scnenkelhalses; Pyramidenbahnschädigung;
Todesursache: Kardiovasikuläres Leiden;
+höchstens
TABELLE 2 (Fortsetzung)
16
Monate
II - III Bulbärsymtome -
1 & 2
21 Monate
17
Jahre
IV-V Bulbärsymtome
2 1/2 Monate
18
Jahre
Va & Vb
1 Monat
19
Jahr
II Bulbärsymtome -
5-6 Monate
Diffuse, rasch fortschreitende amyotrophische Lateralsklerosej
Der Patient war zum Aufzeichnungszeitpunkt
halbgehfähig und zeigte keine Anzeichen einer Bulbärparalyse;
Verlangsamung unter der Therapie mit modifizierten Neurotoxinenj
Reagierte während der ersten drei Wochen gut auf die Gaben an modifizierten
Neurotoxinen, dann status quo. Nach Beginn der Neurotoxintherapie diffuser und ernster Verlauf
ι
Terminale amyotrophische Lateral- x
Sklerose, die mehr als 5 Jahre vorher diagnostiziert worden war; Band- 4=·
aufzeichnungen zeigen eine funktio- ,
nelle Besserung bei der Behandlung (der Patient bewegte sich besser
und vermochte, Gespräche zu verstehen). Nach dem Absetzen der modifizierten Neurotoxine starb der patient 41
Tage später im Krankenhaus wahrscheinlich an bulbärer amyotrophisoiier
Lateralsklerose;
Bei Beginn der Verabreichung modifizierter Neurotxine verschlechterte
sich das Befinden des Patienten rasch, wobei die parese eines Beins
durch eine nahezu vollständige Lähmung beider Beine (neurologisch) abgelöst wurde. Seit Beginn der Therapie
mit den modifizierten Neurotoxinen war die Degeneration fraglich.
TABELIiE 2 (Portsetzung)
20
2 Jahre
IH-IV
| 0983 | 21 | 4 | bis 5 |
| 1005 | 22 | 6 | Monate |
Jahre III - IV
II - III
Die Geschwindigkeit der Degeneration bei der arayotrophischen Lateralsklerose vor und nach der
Verabreichung modifizierter Neurotoxine ist von wesentlicher Bedeutung.
Monate Anfängliche Proximation: O, Pasci-
kulieren der rechten und linken Hand: 4+; Nahezu sämtliche Bulbärsymtome;
Die Zunge;zeigte eine vollständige Atrophie. Innerhalb siebentägiger
Behandlung war bei beiden Händen die Proximation gut. Der Patient konnte zu diesem Zeitpunkt Knöpfe
auf- und zuknöpfen; Nach 12-tägiger Behandlung vollständiger Gebrauch
der Zunge, kein Würgen;
Monate Die Behandlung besserte das Sprech-
und Schluckvermögen und kräftigte , die Knie. Das Schluckvermögen besserte
sich weiter. Nach der ersten ui Behandlungswoche konnte das Pasci- ,
kulieren zunVerschwinden gebracht werden;
Monate Bei der Behandlung kam es zu einer
deutlichen Abnahme der Bein(muskel)-krämpfe, so daß der Patient ohne
Hilfe gehen konnte. Der Patient konnte sich ohne Hilfe an- und ausziehen. Die Behandlung besserte die
Peinbewegung der Hände. Die Proximation ist zum Vergleich zu 2+ vcr
der Behandlung nunmehr in Ordnung;
TABELLE 2 (Portsetzung)
| 23 | 2 | Jahre | II - III Bulbärsymtome + |
|
| 24 | 3 | 1/2 Jahre | II | |
| 25 | 8 | Monate | II | |
| O | 26 | 2 | Jahre | Va & Vb |
| 9832/ | ||||
| 1005 |
2-4 Wochen
1 Monat
1 Monat
2 Monate
3 Jahre
rv - v
2 Monate
Besserung des Schluckvertnögens nach 3-tägiger Behandlung, Der
Patient geht nun besser, ohne zu schlurfen.
Bei der Behandlung kam es zu einer Besserung des Fascikullerens und
der Peinbewegung der Hände.
■Rasche Verbesserung im rechten Vorderarm und Triceps nach 7-tägiger
Behandlung.
Die Funktion des Sternocleidomastoldens
war anfangs mit Null zu bewerten. Die Funktion anderer Nackenmuskeln
war anfangs ebenfalls mit Null zu bewerten. Der Patient zeigte Tetraplegie und Aphonie, seine
Zunge war atrophisch. Nach j5-wöchlger
Behandlung konnte der , Patient Töne von sich geben. Er hielt den Hals in aufrechter Stellung.
,
Nach einmonatiger Behandlung waren die Atmung, die Bewegung der Hantle
und dae Pascikulieren des Patienten besser geworden.
TABELLE 2 (Fortsetzung)
28
2 1/2 Jahre Va Monat
29
3 Jahre
1 Jahr
Va & Vb
II
CD OO CO
O O Ol
31
2 Jahre
II - III
52
33
2 1/2 Jahre Vb
7-10 Monate I Monate
Monate
1/2 Monate
1/2 Monate
Monate
Nach der Behandlung waren die Atmung, die Bewegung der Zunge und das Schluckvermögen des Patienten
gebessert. Es war auch eine geringfügige Besserung der Bewegungsfahigkeit der Beine
feststellbar.
Nach der Behandlung war das Schluckvermögen des Patienten gebessert»
Nach der Behandlung waren das Greifvermögen der rechten Hand und das Streckvermögen der Pinger
verbessert. Die Proximation besserte sich von 2+ nach gut«,
Zunächst konnte die Verschlechterung des Zustandes zum Stillstand gebracht werden, dann trat
keine weitere Verschlechterung dieses Zustandes mehr ein.
Bei der Behandlung besserten sich die Bulbärsyrntome.
Nach der Behandlung besserten sich die Abwärtsbewegung des rechten Fußes und das Fascikulieren
von 4+ nach 2+„
1 1/2 Jahre
Vb
1 1/2 Monate
| 35 | 7 Monate | I - | II | 3 | 2 Monate |
| 36 | 3 Jahre | II | 3 | 2 Monate |
| 09832- | 37 | 3 1/2 Jahre | II - III | 3 | 1 Monat |
| Q | 38 | 1 Jahr | III | 3 | 2 Monate |
| O cn |
Bei der Behandlung kam es zu einer Besserung der Schluckfähigkeit;
Der zunächst Aphonie zeigende Patient konnte nach der Behandlung etwas sprechen.
Geringe Kräftigung der Beine nach der Behandlung.
Bei der Behandlung besserte sich die Feinbewegung der Hände. Die Proximation besserte sich von
5O# auf 1005έ. Ferner kräftigten
sich beide Arme. Schließlich war auch noch eine Abnahme des Fascikulierens feststellbar.
Bei der Behandlung besserte sich die Gehfähigkeit des Patienten. «
Nach der Behandlung war die Schluckfähigkeit des Patienten stark verbessert.
Vor der Behandlung konnte der Patient lediglich pürierte Nahrung zu sich nehmen^
nach der Behandlung konnte er sogar feste Nahrungsmittel zu sich nehmen. Die Gehfähigkeit
des Patienten änderte sich von Schlurfen bis zum Anheben seiner Füße. Das Fascikulieren wurde
ebenfalls deutlich verbessert.
TABELLE 2 (Portsetzung)
6 1/2 Jahre
III
4 Jahre
III - IV
1/2 Jahre Va
CD OO CO IO
Monate Die Schwäche der Beine machte ein Gehen ohne Hilfe unmöglich.
Nach einmonatiger Behandlung konnte der Patient ohne Hilfe das Bett verlassen und das Bad
aufsuchen,
Monate Geringe Besserung bei der Behand
lung, zumindest jedoch keine weitere Verschlechterung
Monate Geringe Besserung bei der Behand
lung, zumindest jedoch keine weitere Verschlechterung
Claims (1)
- 4« Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es beim Semliki-Forest-Virustest eine mindestens j5O$ige Inhibierung der Flecken bewirkt.5. Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es beim Semliki-Forest-Virustest eine mindestens 75#ige Inhibierung der Flecken bewirkt,6. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ungiftig ist.7. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil des Gifts von Naja Naja und Bungarus multicinctus stammt.8. Mittel nach.Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis Naja-Schlangengift zu Bungarus-Schlangengift 400:1 bis 8:1 beträgt.9. Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis Naja-Schlangengift zu Bungarus-Schlangengift 80:1 bis 40:1 beträgt.10. Verfahren zur Herstellung eines Mittels nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Schlangengift so lange bei einem pH-Wert oberhalb 7 und einer Temperatur von409832/1006bis 4o°C oxidiert, bis es ungiftig geworden ist und daß man das erhaltene Produkt dialysiert.409832/1005
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| DE2404416A1 true DE2404416A1 (de) | 1974-08-08 |
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ID=23282151
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