DE2348753B2

DE2348753B2 - Fermentative Herstellung von Protein

Info

Publication number: DE2348753B2
Application number: DE2348753A
Authority: DE
Inventors: Paul Dr. 6232 Neuenhain Praeve; Fritz Dr. 4650 Gelsenkirchen Schindler; Dieter Dr. 6230 Frankfurt Sukatsch
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1973-09-28
Filing date: 1973-09-28
Publication date: 1979-04-12
Also published as: FI280774A; NO142086B; DE2348753C3; IL45716A; DD113927A5; CH606420A5; JPS5063185A; ATA779774A; SU560534A3; DK140216C; DK511074A; NL7412535A; AT344646B; BR7408047D0; BE820526A; EG11515A; ES430304A1; DE2348753A1; AU7374674A; IT1049312B

Description

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Es sind biosynthetische: Verfahren bekannt, in denen Mikroorganismen, z. B. bestimmte Hefestämme, in einem synthetischen Nälirmedium, welches als einzige Kohlenstoff-Quelle η-Paraffin enthält, fermentativ vermehrt werden. Solche Verfahren können sowohl diskontinuierlich als auch kontinuierlich durchgeführt werden. Die dabei verwendeten Paraffine haben im allgemeinen 8—23 Kohlenstoffatome. Die so gewönne- jo nen Hefezellen enthalten im sogenannten »Rohprotein« (errechnet durch Multiplizieren des elementaranalytisch gefundenen Wertes für Stickstoff mit dem empirischen Faktor 6,25) üblicherweise 60—80 Gewichts-% Aminosäuren und 8—12 Gewichts-% Nukleinsäuren. Ein so hoher Anteil an Nukleinsäuren ist jedoch unerwünscht, da aus ihnen insbesondere im menschlichen Organismus Harnsäure entsteht, die Gicht verursacht. Außerdem wird die Flora des Magen-Darm-Traktes ungünstig beeinflußt.

Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung von Hefe mit einem η-Paraffin mit 8—23 Kohlenstoffatomen als Kohlenstoff-Quelle und einer Stickstoffquelle unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert zwischen 2,0 und 6,8 gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Hefestämme der Arten Candida lipolytica, Candida viswanathii, Candida parapsilosis oder Candida guillermondii so fermentiert, daß die Konzentration an η-Paraffin in der Phase des logarithmischen Wachstums der Hefezellen zwischen to 0,04 und 0,12 Gewichts-%, bezogen auf die Kultursuspension, liegt.

Bevorzugt wird eine Konzentration der n-Paraffine, die zwischen 0,08 und 0,1 Gewichts-% liegt; zweckmäßig ist die Verwendung solcher η-Paraffine, die 10 bis 14 Kohlenstoffatome in der Kette aufweisen.

Das Verfahren wird zweckmäßig in Fermentationskesseln durchgeführt, welche ein Nährmedium enthalten, das neben dem erwähnten η-Paraffin als Stickstoffquelle Salze wie Kaliumnitrat, Ammonsulfat oder t>o Ammoniak, Harnstoff oder Sojamehl enthalten. Außerdem enthält es Phosphate wie Kaliumdihydrogenphosphat oder Dinatriumhydrogenphosphat sowie Magnesium- und Kalium-Salze und Spurenelemente, wie sie z. B. auch im Leitungswasser enthalten sind.

Es kann zweckmäßig sein, insbesondere den Vorkulturen Nährstoffe wie Hefeextrakt, Fleischextrakt, Glucose, Thiamin oder andere zuzusetzen.

Das Verfahren wird zweckmäßig bei Temperaturen zwischert20 und 35°C am besten zwischen 28 und 32° C, durchgeführt

Als Hefestämme werden solche der im Patentanspruch1 genannten Arten eingesetzt

Die Kultursuspension im Fermentationskessel wird mit 0,3 bis 131 Luft pro Liter Kulturlösung und Minute (wm), am besten mit 0,9 bis 1,1 vvm, belüftet Um eine gute Aufnahme des Sauerstoffs durch die Zellen zu gewährleisten, wird zweckmäßig intensiv gerührt; es können auch Emulgatoren zugesetzt werden. Um einen guten Austausch aller Komponenten in dem 4-Phasensystem Zelle-Salzlösung-Paraffin-Luft zu erreichen, hat es sich als günstig erwiesen, einen oder besser noch zwei oder mehrere Rührer in einem Fermentationskessel zu verwenden, deren Umdrehungszahlen zwischen 100 und 250 Upm, am besten zwischen 150 und 200 Upm liegen. Weiterhin ist es günstig, zwei Rührer, insbesondere Turbinenrührer, so im Fermentationskessel anzuordnen, daß die Rührerabstände etwa einen Rührerdurchmesser betragen. Das Verhältnis von Rührerdurchmesser zu Kesseldurchmesser liegt zweckmäßig zwischen 035 und 0,65, am besten zwischen 0,45 und 035. Die Umlaufgeschwindigkeit der Kultursuspension beträgt zweckmäßig mehr als 7 m/s.

Falls Schaumbildung eintritt, empfiehlt sich eine chemische oder mechanische Schaumbekämpfung, zum Beispiel durch Zusatz von 0,01 bis 0,1 Gewichts-% eines Entschäumers wie Octanol, Ester der ölsäure und Laurinsäure mit Glykol, Glycerin oder Sorbit, alkoholische Cholesterinlösung oder Silikone wie Polydimethylsiloxan.

Die n-Paraffin-Konzentration zwischen 0,04 und 0,12 Gewichts-%, vorzugsweise zwischen 0,08 und 0,1 Gewichts-%, kann kontinuierlich durch verschiedene Maßnahmen gesteuert werden, z. B. durch Messung des Stickstofiverbrauchs, des Zellmasseanteils oder am besten durch Messung des Kohlendioxidausstoßes. Hierbei ist eine feine Dosierung der Paraffinzugabe mit schneller Reaktion auf den bei Kohlenstoffmangel absinkenden Kohlendioxidausstoß möglich.

Wenn der pH-Wert der Kultursuspension unter den vorgeschriebenen Wert sinkt, wird er durch Zugabe von Alkali, z. B. Natronlauge oder Kalilauge, wieder auf den vorgeschriebenen Wert gebracht.

Zur Kontrolle des Verfahrens werden aus der Kultursuspension Proben entnommen, um das Trockengewicht und den Stickstoffgehalt in der Hefezellmasse zu bestimmen. Danach können die Wachstumsrate und die Verdopplungszeit der Zellmasse bestimmt werden. Wenn das Trockengewicht der Hefe bei aufeinanderfolgenden Probeentnahmen nicht mehr logarithmisch zunimmt, wird die Fermentation beendet.

Die Abtrennung der Hefemasse erfolgt in üblicher Weise durch Dekantieren oder zweckmäßig Zentrifugieren unter mehrmaligem Waschen mit Wasser. Man erhält so eine pastenartige Hefezellmasse, die noch 75 bis 90 Gewichts-% Wasser enthält. Die Trocknung kann auf verschiedene Weise erfolgen, z. B. durch Walzentrocknung, Wirbelbetttrocknung oder Sprühtrocknung. Das so getrocknete Produkt enthält lediglich 2—5 Gewichts-% Wasser und 45 bis 60 Gewichts-% Rohprotein. In diesem Rohprotein beträgt der Anteil an Aminosäuren 90 bis 95 Gewichts-%. Dabei ist bemerkenswert, daß nicht nur dieser Anteil an Aminosäuren allgemein, sondern insbesondere der Gehalt an essentiellen und semiessentiellen Aminosäuren höher als bei vergleichbaren Produkten nach dem Stand der Technik

0,53%	(NH₄J₂SO.	ι	12H₂O
0,4%	KH₂PO₄		H₂O
0,2%	Na₂HPO₄
0,02%	MgSO₄-7	und
0,02%	KCI	Spurenelemente
1,5%	η-Paraffin
0,1%

(pH 5,5).

1%

0,4%

0,2%

0,02%

(NH₄J₂SO₄
KH₂PO₄

NaHPO₄-12 H₂O
MgSO₄-7 H₂O
KCI.

Der pH-Wert der Nährlösung beträgt 4,2. Sie wird 45 Minuten lang bei 121°C sterilisiert. Außerdem werden 300 g (3 Gewichtsprozent) η-Paraffin mit 10—14 C-Atomen getrennt sterilisiert. Vor dem Beimpfen der Hauptkultur wird der Nährlösung 1 Gewichts-% η-Paraffin zugesetzt.

Zum Beimpfen der Nährlösung werden unter sterilen Bedingungen 2 χ 250 ml der Vorkultur, die 48-60 Stunden lang bei 28° C geschüttelt wurde, verwendet. Die beimpfte Nährlösung wird 48 Stunden lang bei 28°C unter Belüftung mit 1 vvm Luft mit einem Turbinenrührer gerührt.

Eine pH-Wert-Korrektur erfolgt nötigenfalls durch Zugabe von 2 η steriler NaOH. Während der logarithmischen Phase der Fermentation wird eine Konzentration von η-Paraffin zwischen 0,08 und 0,1 Gewichts-% eingehalten. Dazu werden bei einer Verminderung des CO₂-Ausstoßes der Zellen weitere Anteile n-Paraffin automatisch zudosiert, bis der CO₂-Ausstoß wieder ansteigt.

Das Fortschreiten des Verfahrens wird durch

liegen. Außerdem liegt der Rohaschegehalt der erfindungsgemäß erhaltenen getrockneten Zellmasse deutlich niedriger als der bekannter Produkte. Das erfindungsgemäß erhaltene Rohprotein enthält weiterhin nur 3 bis 6 Gewichts-% Nukleinsäuren, während bekannte Hefeprodukte 8 bis 12 Gewichts-% Nukleinsäuren enthalten.

Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltene trockene Hefemasse ist daher in besonderem Maße geeignet, als Eiweißquelle in Lebensmitteln und Tierfutter zu dienen.

Beispiel 1
(nachgereicht)

Der Stamm Candida lipolytica ATCC 8661, der auf Schrägagarröhrchen der Zusammensetzung

23% Fleischextrakt

5,0% Hefeextrakt
10,0% Fleischpepton
10,0% Glucose
10,0% NaCI

2,5% Agar

gehalten wird, wird mit 4 ml destilliertem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung abgeschwemmt und in einen 2-1-Erlenmeyerkolben steril überimpft, der 250 ml Vorkultur-Nährlösung folgender Zusammensetzung enthält:

JO

J5

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem 14 Liter fassenden Fermentationskessel ausgeführt, der mit 10 Litern der nachstehenden Nährlösung beschickt ist:

45 Probeentnahmen zur Bestimmung des Trockengewichts, des Aschewertes, des Rohfettgehaltes und des Stickstoffs der Hefezellmasse kontrolliert

Nach Beendigung der logarithmischen Wachstumsphase wird die Aufarbeitung in üblicher Weise durch Zentrifugieren, Waschen der Zellen mit Wasser und anschließender Sprühtrocknung vorgenommen. Das so erhaltene Produkt hat einen Rohproteingehalt von 58,0 Gewichts-%, einen Aminosäuregehalt von 543 Gewichts-% und einen Nukleinsäureanteil von 3,4 Gewichts-%. Die essentiellen und semiessentiellen Aminosäuren betragen 50,79 Gewichts-%. Ausführliche Angaben finden sich in der nachstehenden Tabelle.

Tabelle 1

Produkt

Candida lipolytica ATCC 8661

Rohprotein (N Χ 6,25), % 58,0

Wassergehalt, % 3,5

Rohasche, % 5,2

Rohfett, % 8,3

Rohfaser, % 3,2

Aminosäuregehalt, % 54,5 Aminosäuren g/16 g N

Asp 10,20

Thr 5,20

Ser 5,51

GIu 10,42

Pro 4,82

GIy 5,26

AIa 7,21

Cys 0,70

VaI 5,77

Met 2,05

He 6,33

Leu 7,56

Tyr ■ „ 3,74

Phe 4,66

His 4,91

Lys 9,48

Arg 5,09

Try 1,09

Nukleinsäuregehalt, % 3,4

Beispiele 2 bis 7 (nachgereicht)

Analog zu der im Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise wurden die nachstehend angegebenen Stämme bis 7 behandelt. Der Stamm des Beispiels 1 ist zum Vergleich noch einmal angeführt.

Stämme:

1 Candida lipolytica

2 Candida lipolytica

3 Candida parapsilosis

4 Candida parapsilosis

5 Candida guilliermondii

6 Candida guilliermondii 7 Candida viswanathii

ATCC 8661 ATCC 8662 ATCC 7333 ATCC 14054 ATCC 6260 ATCC 9390 ATCC 22981

Damit wurden die in Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse erhalten.

Tabelle 2 Produkt Stämme

\ 2

Rohprotein (N X 6,25) 58,0 53,5 53,0 54,5 57,5 56,2 55,0

Aminosäuregehalt 54,5 49,4 49,0 50,2 53,2 52,5 51,5

Nuldeinsauregehalt 3,4 2,8 3,8 3,2 3,1 2,9 3,2

Claims

23 48 !Patentansprüche:

1. Verfahren jzur Herstellung von Hefe mit einem η-Paraffin mit 8 bis 23 Kohlenstoffatomen als Kohlenstoff-Quelle und einer Stickstoffquelle unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert zwischen 2,0 und 6,8, dadurch gekennzeichnet, daß man Hefestämme der Arten Candida lipolytica, Candida viswanathii, Candida parapsilosis oder Candida guillermondii so fermentiert, daß die Konzentration an η-Paraffin in der Phase des logarithmischen Wachstums der Hefezellen zwischen 0,04 und 0,12 Gewichts-%, bezogen auf die Kultursuspension, liegt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an n-Paraffin zwischen 0,08 und 0,1 Gewichts-% liegt