DE2339111A1 - Verfahren zur reinigung von proteinen - Google Patents

Verfahren zur reinigung von proteinen

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Description

387-71 - 26/73 31. Juli 1973
ASO/URE
Battelle - Institut e.V., Frankfurt/Main
Verfahren zur Reinigung von Proteinen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Proteinen und anderen biospezifisch adsorbierbaren Substanzen durch die Verwendung von Ultrafiltrations-Membranen als Träger für die biospezifische Adsorption, wobei nach der Adsorption die Desorption überaus schonend durch Umkehrung des Flußes erfolgen kann.
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Die hohen Kosten zur Herstellung von Proteinen, besonders Reinproteinen sind einerseits in der relativ geringen Konzentration des Proteins im biologischen Material, andererseits aber in der aufwendigen mehrstufigen Konzentrierung und Reinigung begründet.
Es sind mehrere Standardtechniken bekannt, die in wechselnder Aufeinanderfolge bei praktisch allen Verfahren der Proteingewinnung bisher Anwendung finden.
Nach mechanischem, chemischem, enzymatischem und/oder thermischem Aufschluß des Rohmaterials erfolgt die Klärung und Konzentrierung des Rohextrakts und danach die Anreicherung der Proteine durch Fällung mit Salzen, Säuren, Basen, Lösungsmitteln oder durch Adsorption, sowie durch Dialyse, Ultra- und Diafiltration.
Erst danach erfolgt die eigentliche Reinigung des Proteins, d.h. die Abtrennung des gesuchten Proteins von einer großen Anzahl unerwünschter Proteine. Folgende Reinigungsverfahren werden angewendet ;
Fraktionierte Fällung und Adsorption sowie Elution und Trennung nach dem Molekulargewicht durch Gelpermeation und Diafiltration.
Biospezifische Adsorption und Desorption (Affinitätschromatographie), Trennung nach Ladung, isoelektrischem Punkt und Ultrazentrifugation.
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Die zur Proteinanreicherung angewandte Dialyse, welche die Entfernung von niedermolekularen Substanzen, besonders Salzen, erlaubt, wird heute mehr und mehr durch Dia- und Ultrafiltration ersetzt, wobei bei höherer Trenngeschwindigkeit neben den gelösten niedermolekularen Substanzen auch Wasser entfernt werden kann.
Besonders vorteilhaft erscheint hier der Einsatz faserförmiger Membranen, die auf kleinem Raum eine hohe Membranfläche erlauben.
Eine Reihe von Charakteristika machen die Ultra- und Diafiltration zur idealen Reinigungsmethode für biologische Materialien?
- Unabhängig von der Temperatur; dadurch kann die thermische und autokatalytisehe Zerstörung reduziert werden.
- Milde, nicht destruktive Methode, es erfolgt kein Phasenwechsel.
- kein Einsatz von Chemikalien
- Konzentration des Biomaterials unter Abtrennung von niedermolekularen Substanzen und/oder Erhalt des pH-Wertes, SaIzkonzentration etc.
Zur Reinigung d.h. Abtrennung eines Proteins von unerwünschten anderen Proteinen und Biopolymeren werden das unterschiedliche Adsorptions- und Desorptionsverhalten, die unterschiedliche Löslichkeit, Molekulargröße, Ladung und Molekulargewicht ausgenützt.
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Die genannten Methoden erlauben generell anwendbare aber relativ unspezifische Verfahren, welche die hohe Spezifität und Sensitivität der Proteine gegenüber Effektoren, Substraten, Inhibitoren etc. nicht in Anspruch nehmen.
Als neue Methode wurde vor wenigen Jahren die biospezifische Adsorption (Affinitätschroraatographie) eingeführt, welche auf der Fähigkeit vieler Proteine beruht, gewisse Moleküle zu erkennen und stark zu adsorbieren. Die erkannten Moleküle können sehr verschieden sowohl in ihrer chemischen Struktur als auch in ihrem Molekulargewicht sein; so werden z.B. Aminosäuren oder Proteine ADP oder Nukleinsäuren und andere von den entsprechenden Proteinen spezifisch erkannt.
Diese starke Adsorption erlaubt es nun, sowohl Proteine, wie auch die von ihnen erkannten Substanzen durch biospezifische Adsorption zu reinigen. Dabei wird das Protein oder die von ihm erkannte Substanz an einen festen, chemisch inerten, nicht unspezifisch adsor-
/gebunden, bierenden wasserbenetzbaren Träger großer "Oberfläche1/die an den Träger kovalent gebundene Substanz soll im folgenden Affinor genannt werden.
Damit erfolgt die Isolation der erkannten Substanz oder des Proteins dergestalt, daß dessen Lösung über den affinor-substituierten Träger geleitet wird, wobei je nach Festigkeit der biospezifischen Bindung
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entweder starke Retardwirkung (daher Affinitätschromatographie) oder Adsorption (biospezifische Adsorption} dieser Begriff wurde als allgemeiner Oberbegriff eingeführt) erfolgt. Alle unerwünschten nieder- und hochmolekularen Nebenprodukte, welche den Träger ohne Verzögerung passieren, werden ausgewaschen. Das biospezifisch adsorbierte Produkte wird dann durch Änderung des pH-Wertes, der Salzkonzentration, Zugabe von Substrat, Inhibitor (kompetitive Verdrängung) Effektor etc. eluiert.
Die dabei anzuwendenden Bedingungen sind oft sehr derb, wobei nicht nur die die Adsorption bedingten nicht kovalenten Bedingungen zwischen der tragerfixierten Substanz und der zu isolierenden Substanz sondern auch die die Tertiär- und/oder Quartärstruktur des Proteins stabilisierenden Bindungen (ebenfalls nichtkovalente Bindungen) gespalten werden können. Da die Denaturierung von Proteinen ein oft langsamer Prozeß ist (hohe Aktivierungsenergie), ist der Anteil denaturierten Proteins stark von der Elutionszeit abhängi g.
Bei der Übertragung dieser Methode in den technischen Maßstab ergeben sich folgende Schwierigkeiten ι
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•ν*.
- Die bisher für die biospezifische Adsorption verwendeten Träger (Gele) sind äußerst teuer.
- Ihre chemischen, vor allem aber die physikalischen Eigenschaften sind nicht ausreichend für die technische Anwendung, weder die im Batchbetrieb durch Rechner auftretende Scherkräfte noch die in etwas größeren Säulen auftretenden Drücke können bewältigt werden.
- Das Protein ist den oft sehr derben Bedingungen der Desorption sowohl im Batch- besonders aber im Säulenverfahren relativ lange ausgesetzt.
Durch die Erfindung wird einerseits die Abwicklung der Diafiltration und der biospezifischen Adsorption in einem Schritt, sowie die Lösung der genannten Probleme der biospezifischen Adsorption ermöglicht.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Dia- oder Ultramembranen als Träger für die biospezifische Adsorption. Des weiteren soll der Affinor rohprpduktseitig an die Membrane kovalent gebunden werden. Zur V'ergößerung der Oberfläche kann die Membrane rohproduktseitig mit stark hydratisierten oligo- oder hochmolekularen Substituenten versehen werden, an welchen der Affinor gebunden wird. Als Substituenten eignen sich vorzugsweise Polysaccharide, Polyvinylpyrolidon, Polyacrylsäurederivate (-ester, -amid und Copolymere). Dadurch kann die biospezifische Adsorptionskapazität
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• r ·
(biospezifisch adsorbierte Substanz pro Flächeneinheit Membrane) der Membrane wesentlich erhöht werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Desorption des adsorbierten Produktes durch das eluierende Medium durch dessen dialysatseitige Aufgabe auf die Membrane - gegebenenfalls unter leichtem Überdruck gegenüber dem rohproduktseitigen Druck unter gleichzeitigem oder nachfolgendem Abtransport des desorbierten Produktes durch die rohproduktseitig zirkulierende Flüssigkeit, welche wesentlich milder als das zur Desorption benötigte Medium sein kann.
Diese Desorptionsmethode ist deshalb wesentlich schonender als die Desorption bei bisherigen Verfahren, weil nur in der dünnen Schicht an der Membranoberfläche des Protein dem Desorptionsmittel ausgesetzt ist und sehr rasch in die produktseitig zirkulierende Flüssigkeit gelangt. Die sonst dreidimensionale Verteilung des Proteins im Träger, ob nun als Affinor oder als adsorbiertes Produkt wird ersetzt durch eine quasi zweidimensionale, wobei die dritte Dimension (senkrecht zur Membranoberfläche) rasche Desorption und kurze Kontaktzeiten mit dem Desorbens ermöglicht.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
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-ο ·
1) Membranimmobilisierter Trypsininhibitor
Regenerierte-Cellulose-Ultrafilter (Sartorius SM 115 39) wurde in der Ultrafiltrationskammer über 10 Minuten mit einer Lösung von BrCN (25 mg/ml) bei 20 bis 250C aktiviert. Dabei wurde die umgepumpte BrCN Lösung kontinuierlich mit 2 η NaOH auf pH 11.0 gehalten. Nach Waschen mit Wasser wurde mit 6>Aminobuttersäure umgesetzt. Die Aktivierung der COOH-Funktiai erfolgte mit löslichem Cafoodiimid; danach wurde mit einer überschüssigen Lösung von Trypsininhibitor (Sojabohnen) umgesetzt. Die Membrane ent-
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hielt pro m ungefähr 100 mg Protein-inhibitor.
2) Hollow fiber Modul mit biospezifischer Aktivität gegenüber Guanindeaminase und Xanthinoxidase.
Ein Bio-Fiber-50-Beaker (Bio-Rad) wurde wie unter 1) beschrieben mit BrCN aktiviert und direkt mit einer Lösung von 9 (p-Aminoethoxy-phenyl) guanin umgesetzt (B.R. Baker, H.-U. Siebeneick, J. Med. Chem. 14 (1971) 799-801). Der so erhaltene biospezifische Membranmodul wurde mit dem entsprechenden Sepharose - 4 B Gel gegenüber Guanindeaminase und Xanthineoxidase verglichen.
Die Elution von Guanine Deaminase erfolgte durch eluatseitige Aufgabe von 1,0 mmolarem Guanin nach 5 Minuten Inkubation spontan.
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Xanthine Oxidase wurde mit 1 mmolaren Hypoxantine / - eluatseitig aufgegeben - / eluiert. Die wiedergewonnene Enzymaktivität lag über 90 %.
3) Biospezifische Adsorption von Ribonuklease an modifizierten Flachmembranen«
J* -Strahlen pfropfpolymerisierte Membranen (Ultrafiltrationsmembranen Daflo UM 2 und UM-IO von Amicon), nach der Literatur (A.G. Hoffmann, G. Schmer, C. Harris, W.G» Kraft, Trans. Amer. Soc. Actif Int. Org. _18 (1972) 10-16) herstellt, wurden im Filtrationsgerät bei 20° für 10 - 15 Minuten mit 10 % Bromcyan in 0,2 InNa2CO- aktiviert, wobei der pH-Wert auf 11,0 gehalten wurde.
a) Nach kurzem Auswaschen wurde mit einer 10 % Lösung von 5'-(4-Aminophenylphosphoryl)uridine 28 (39) phosphat in einer Carbonatpufferlösung von pH 9 versetzt und für 24 Stunden bei 40C gehalten.
b) Nach Auswachen wurde mit einer 15 % Lösung von E-Aminocapronsäure in einer Pufferlösung von pH 9 versetzt. Nach beendeter Reaktion (mehrere Stunden) wurde die Carboxylgruppe mit wasserlöslichen Carbodiimid aktiviert (30 Minuten) und mit 5"-(4 Äminophenylphosphoryi)-uridine 21(31)-phosphat umgesetzt.
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Die Kapazität der unter a) erhaltenen Membrane gegenüber Uibonuklease betrug 25 mg/cm Membranflache; die unter b) beschriebene Membrane hatte eine etwas geringere Kapazität, zeigte jedoch stärkere Adsorption der Ribonuklease.
4) Ribonukleaseinhibitor an oberflächenmodifizierten Hollow-Fiber- Membranen ,.,-,, ________
Durch Umsatz von Bio-Fiber 50 Beaker (Bio Rad) mit Metacrylsäurechlorid und nachfolgender Pfropfpolymerisation mit Hydroxyathylmetacrylat - durchgeführt analog zu in der Literatur beschriebenen Verfahren - wurde ein Produkt erhalten, welches um wenig veränderte Ultrafiltrationseigenschaften zeigte«
Es wurde nach der unter 3) beschriebenen Methode aktiviert und wie unter 3a) weiter umgesetzt. Der erhaltene Membranmodul hatte eine
—2
Bindekapazität von 10 g Ribonuklease. Die Elution erfolgte sehr rasch durch eluatseitige Aufgabe von 0,3 m Essigsäure und produkt seitiges Spülen mit 0,05 m Essigsäure.
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Claims (4)

1) Verfahren zur Reinigung von Proteinen und anderen biospezifisch adsorbierbaren Substanzen durch biospezifische Adsorption und durch Desorption, dadurch gekennzeichnet,.daß die Adsorption an Ultrafiltrationsmembranen erfolgt.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorption mittels biospezifisch adsorbierender Gruppen (Affinore) erfolgt, die kovalent an die produktseitige Oberfläche einer Ultrafiltrationsmembrane gebunden sind.
3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultrafiltrationsmembrane zur Erhöhung der Oberfläche mit hydrophilen stark hydratisierten organischen Polymeren substituiert ist und diese Polymeren mit den adsorbierenden Gruppen substituiert sind.
4) Verfahren nach Anspruch 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Desorption des biospezifisch adsorbierten Produkts durch umgekehrten Fluß des Desorberns erfolgen kann.
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DE19732339111 1973-08-02 Verfahren zur Reinigung von Proteinen und anderen biospezifisch adsorbierbaren Substanzen Expired DE2339111C3 (de)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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FR2430013A1 (fr) * 1978-06-27 1980-01-25 Sebia Sa Systeme physico-biochimique pour la detection des substances, a activite antigenique
DE102017206155A1 (de) 2017-04-11 2018-10-11 Robert Bosch Gmbh Desorption von Nukleinsäuren

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EP0008245A1 (de) * 1978-06-27 1980-02-20 Laboratoires Sebia Physisch-biochemisches System zum Nachweisen, Dosieren und Isolieren von Substanzen mit antigenischer Aktivität
DE102017206155A1 (de) 2017-04-11 2018-10-11 Robert Bosch Gmbh Desorption von Nukleinsäuren
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