DE2331095C3 - Verfahren zur Herstellung des biologisch reinen, die Bildung und Ausschüttung von Gonadotropin anregenden Hormons - Google Patents

Description

1000 bis 2000 entfernt Anschließend wird eine zweite von 5 χ 75 cm, die mit Kieselgel einer Teilchengröße Gelfiltration durch eine Säule vorgenommen, die von 0,05 bis 0,2 mm gefüllt war, wurde unter Ver-Pepüde mit Molekulargewichten unter 1500 entfernt Wendung von Chloroform-Methanol (19:1) als Pak-Nach der Abtrennung des Decapeptids vom Elutions- kungsmedium hergestellt. Die in der beschriebenen mittel ist es praktisch rein. Auf Dünnscnichtchromato- 5 Weise hergestellte Lösung des dreifach geschützten graphieplatten zeigt es nur einen einzelnen Flecken. Decapeptids in Essigsäure wurde auf diese Säule auf-AIs Gelfiltraüonspackung für das von Schutzgruppen gegeben, die dann mit 2000 ml eines Chloroformbefreite Decapeptid wird ein teilweise vernetztes Methanol-Gemisches (19:1) gewaschen wurde. Das Dextrangel verwendet Gele dieses Typs sind im Handel Peptid wurde dann mit Chloroform-Methanol (2:1) von verschiedenen Quellen erhältlich. Besonders io eluiert. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels geeignet sind die »Sephadex®«-gele (Hersteller Phar- aus den das Decapeptid enthaltenden vereinigten macia, Upsala, Schweden), die in verschiedenen Fraktionen wurde die vorstehend beschriebene Be-Körnungen und mit verschiedenen Eigenschaften, die Handlung an einer Kieselgelsäure von ungefähr der so ausgebildet sind, daß bestimmte Molekular- halben angegebenen Größe wiederholt. Das erhaltene gewichtsbeieiche getrennt werden können, erhältlich 15 Material wurde dann kristallisiert, indem der Feststoff sind. Das »Sephadex®«-gel mit der geeigneten Affinität in der Mindestmenge heißem Methanol gelöst und die für die erste der obengenannten Säulen ist unter der Lösung gekühlt wurd;. Hierbei wurden 8,2924 g des Bezeichnung »Sephadex® G-25« im Handel. Ein reinen dreifach geschützten Dscapsptids erhalten, »Sephadex®«-gel, das die Voraussetzungen für die das eine spezifische Drehung [*]? —23,7° (c = 1, zweite Säule erfüllt, ist unter der Bezeichnung »Sepha- 20 l°/_oigc Essigsäure) hat. Eine zweite Ausbeute von dex® G-15« erhältlich. Die Perlgröße der Dextrangel- 0,3347 g wurde aus dem Methanolnitrat erhalten, teilchen kann in allen Fällen zwischen 10 und 300 μ Das gereinigte dreifach geschützte Decapeptid

liegen und liegt vorzugsweise im Bereich von 20 bis wurde in einer gegen Fluorwasserstoff beständigen 150 μ. Bei kleineren Perlgrößen fließt die Lösung Apparatur behandelt, die aus drei hintereinanderübermäßig langsam durch die Säule, während bei 35 geschalteten Gefäßen bestand. Das erste Gefäß war einer Perlgröße über 150 μ die Abtrennung des spe- ein Auffanggefäß, das Kobaltfluorid enthielt. Es war ziellen Molekulargewichtsbereichs nicht wirksam genug mit einem Reaktionsgefäß verbunden, das außerdem ist, um reproduzierbare Ergebnisse bei einem einzigen mit einem Eintrittsrohr für das Peptid, dessen Schutz-Durchgang der Lösung durch jede der speziellen gruppen entfernt werden sollen, versehen war. Das Säulen zu erhalten. 30 Austrittsrohr führte zu einem Wasserabscheider, dessen

Zweckmäßig verwendet man als Lösung des rohen Austritt zum Ausguß führte. Die ganze Reihe von Decapeptids eine Essigsäurelösung, die 0,02- bis Gefäßen ist verschlossen mit Ausnahme des in das l,0molar, vorzugsweise O.lmolar an Essigsäure ist. Auffanggefäß führenden Eintritts und natürlich des Mit Epichlorhydrin vernetzte Dextrangele werden Austritts am Ende der Apparatur, vorzugsweise beim erfindungsgemäßen Verfahren als 35 Das System wurde zuerst mit trockenem Stickstoff teilweise vernetzte Dextrangele eingesetzt. gespült, worauf Fluorwasserstoff eingeführt wurde,

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durch das bis sich 12 ml in dem mit einem Trockeneis-Aceton-Bad folgende Beispiel weiter erläutert gekühlten Auffanggefäß gesammelt hatten. Das Kühlbad wurde dann auf das Reaktionsgefäß umgeschaltet, Beispiel 40 in das dann 500 mg der in der oben beschriebenen

tv r» tiAv t* Weise erhaltenen ersten Ausbeute von dreifach ge-

uie uecapepnaicene schütztem Decapeptid in 1,0 ml Anisol gegeben

p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NHj, wurden. Ein heißes Wasserbad wurde unter das

Auffanggefäß gestellt und der Fluorwasserstoff von

die eine Benzylgruppe an jeder der Ser- und Tyr 45 dort in das Reaktionsgefäß destilliert. Nachdem 0-Funktionen und eine Nitrogruppe bei Ν^ω von Arg 10 ml Fluorwasserstoff in das Reaktionsgefäß überenthält, wurde nach dem Verfahren der schrittweisen gegangen waren, wurde das Trockeneis-Aceton-Kühl-Aminosäureaddition hergestellt, das von Merri- bad durch ein Eisbad ersetzt und das Gemisch 1 Stunde field beschrieben wird (Stuart & Young, Solid mit dem Magnetrührer gerührt. Das Eisbad wurde Phase Peptide Synthesis, herausgegeben von W. H. 50 entfernt und das System erneut mit Stickstoff gespült, Freeman & Co. 1969). Das Decapeptid wurde bis der gesamte Fluorwasserstoff entfernt war. dann nach dem üblichen Verfahren wie folgt vom Das von Schutzgruppen befreite Decapeptid im

Harzsubstrat abgetrennt: Reaktionsgefäß wurde durch Zusatz von 15 ml

Der dreifach geschützte Decapeptidharzester wurde trockenem Äther ausgefällt. Der isolierte Feststoff in 1200 ml Dimethylformamid-Methanol (1:1) aufge- 55 wurde in einem Wasser-Essigsäure-Gemisch (9:1) schlämmt und während die Suspension in einem Eisbad gelöst. Die Lösung wurde mit Äther gewaschen und gekühlt wurde, mit gasförmigem Ammoniak gesättigt. dann gefriergetrocknet und über Nacht über P₂O₅/K.OH Die Suspension wurde dann 24 Stunden bei Raum- bei einem Druck von 0,2 mm Hg getrocknet. Eine temperatur gerührt, erneut mit Ammoniak unter Lösung dieses Materials in wäßriger 0,1 N Essigsäure Kühlen gesättigt und weitere 4 Stunden gerührt. Die 60 wurde durch ein Milliporenfilter (0,6 μ; 47 mm) Aufschlämmung wurde filtriert und mit Dimethyl- filtriert und erneut gefriergetrocknet, wobei 0,443 g formamid gewaschen. Das Filtrat wurde unter ver- des rohen Hormons Gn-RH erhalten wurden, mindertem Druck bei einer Badtemperatur unter Eine Lösung von 1,9 g des in dieser Weise erhaltenen

45°C eingeengt. Hierbei wurden etwa 30 g eines rohen Hormons in 40 ml O.lmolarer Essigsäure wurde auf Öls erhalten, das in Eisessig in einer solchen Menge 65 eine Chromatographiesäule aufgegeben, die einen gelöst wurde, daß die Viskosität von Wasser erhalten Innendurchmesser von 8,9 cm hatte und bis zu einer wurde. Höhe von 110 cm mit dem Dextrangel »Sephadex®

Eine Chromatographiesäule mit einer Bettgröße G-25« gefüllt war. Die Durchflußmenge durch diese

Säule wurde auf 750 ml/Stunde eingestellt. Die Elution wurde mit 0,lmolarer Essigsäure durchgeführt. Die ersten 4000 ml Eluat enthielten keine meßbare Menge des gewünschten Decapeptid?. Anschließend wurde in Fraktionen von je 20 ml weiter eluiert. Die zusammengegossenen Fraktionen, die das gewünschte Hormon enthielten, wurden in der oben beschriebenen Weise unter Verwendung des Dextrangels »Sephadex® G-15« als Füllung erneut chromatographiert.

Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels von den zusammengegossenen Fraktionen, die Gn-RH enthielten, wurde der Rückstand aus einer verdünnten Essigsäurelösung gefriergetrocknet. Das hierbei erhaltene Material bestand aus dem gewünschten Decapeptid Gn-RH in einer Reinheit von 98%, bestimmt durch biologische Testung. Die chemische Analyse bestätigte, daß das Decapeptid 2 Mol Essigsäure und 4 Mol Wasser pro Mol Gn-RH enthielt. Die Elementaranalyse ergab 51,68% C, 6,25% H, 17,00% N und 25,25% O (berechnete Werte für das ao Diacetattetrahydrat: 51,56% C, 6,67% H, 17,32% N, 24,44% O). Optische Drehung: [α]? -50,5° (c = 1; 1 % Essigsäure).

Die Bedeutung des vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahrens kann in drastischer Weise durch Betrachtung der Ausbeuten in den verschiedenen Stufen des neuen Verfahrens veranschaulicht werden. Die nachstehend genannten Ausbeuten sind in g Produkt pro Millimol des als Ausgangsmaterial dienenden Glycinharzesters (Glycin auf Basis der Aminosäureanalyse nach der Hydrolyse) ausgedrückt. Die Ausbeute an rohem, gespaltenem, dreifach geschütztem Decapeptid betrug 1,69 g/Millimol. Durch die Reinigung mit Kieselgel wurde dieser Wert auf 0,49 g/Millimol herabgesetzt. Nach Entfernung der Schutzgruppen betrug die Ausbeute an rohem Produkt 0,44 g/Millimol. Durch die Behandlung in der ersten Dextrangelsäule wurde dieser Wert auf 0,22 g/Millimol und durch die Endstufe weiter auf 0,14 g/Millimol erniedrigt. Zwar basieren diese Zahlen auf g Glycinharz/Millimol, das nach Entfernung der Peptidkette vom Harz ohne Bedeutung ist, jedoch veranschaulichen die Zahlen deutlich den mit der neuen Reinigungsmethode erzielten Fortschritt.

Wie bereits erwähnt, sind eine teilweise Vorreinigung und die zweistufige chromatographische Reinigung nach der die Schutzgruppen entfernenden Reaktion absolut wesentlich, um ein biologisch brauchbares Material aus mehrfach geschütztem Gn-RH zu erhalten. Diese Notwendigkeit ergibt sich aus der Verunreinigung der aufgebauten Decapeptidkette mit anderen Peptiden als Folge unvollständiger Kupplungsreaktionen während der Ketfenaufbausequenz und der Labilität der Histidinkomponente, die ein Teil dieser Sequenz ist. Diese Verunreinigungen treten ohne Rücksicht darauf auf, ob die Peptidkette nach dem Lösungsverfahren oder nach dem Festphasenverfahren aufgebaut wird.

Die Wirksamkeit des neuen Verfahrens wurde voi stehend im Zusammenhang mit einem dreifach geschützten Decapeptid beschrieben, jedoch werden die gleichen Ergebnisse erhalten, wenn das Decapeptid außerdem eine Schutzgruppe an der N^Im -Stellung von His enthält. Beliebige Schutzgruppen, über die bereits von Schröder und Mitarbeitern (The Peptides I, Academic Press 1965, S. 167 bis 174, 210 bis 212 und 222 bis 225) berichtet wurde, können Teil des als Ausgangsmaterial für das neue Reinigungsverfahren verwendeten Decapeptids sein, vorausgesetzt, daß die Schutzgruppen nach der oben beschriebenen üblichen Behandlung mit Fluorwasserstoff abgespalten werden.

Zwar wurden bereits andere Gelfiltrationsverfahren bei Peptidreinigungen angewandt, jedoch ist das neue Verfahren in der besonderen Wahl der oben beschriebenen Füllmaterialien außergewöhnlich. Nur die Verwendung von zwei Kolonnen mit verschiedenen Füllungen, die beschriebene Aufeinanderfolge der Kolonnen und dis Verwendung einer vor gereinigten, mehrfach geschützten Vorstufe gewährleisten ei^ biologisch einwandfreies Endprodukt. Das neue Verfahren ist nicht nur einfach, zweckmäßig und auf Grund der Wiederverwendbarkeit der Dextransäulen billig, sondern auch mit hohem Genauigkeitsgrad reproduzierbar. Die bisher vorgeschlagenen anderen Verfahren sind gewöhnlich sehr kompliziert und/oder für die Großherstellung ungeeignet und ergeben außerdem ein Produkt mit einer für nedizinische Zwecke ungenügenden Reinheit und/oder ein Endprodukt, das in der Reinheit von Charge zu Charge stark schwankt.

Die verwendeten Dextransäulen sind dreidimensionale Raumnetze von Polysaccharidketten mit verschiedenen Vernetzungsgraden. Das Raumnetz hat nichtionische Charakteristiken, und die polaren Eigenschaften sind fast ausschließlich auf den hohen Gehalt an Hydroxylgruppen zurückzuführen. Ein hoher Vernetzungsgrad ergibt eine kompaktere Struktur, während sich bei niedrigeren Vernetzungsgraden eine stärker poröse Struktur ergibt. Das Gel quillt in allen wäßrigen Lösungen mit unterschiedlicher Wasseraufnahme. Die erste Dextrangelsäule ist bis zu einer Wasseraufnahme von 2,5 ml/g vernetzt, während die zweite Säule ein Gel enthält, das bis zu einer Wasseraufnahme von 1,5 ml/g vernetzt ist. Für das Verfahren gemäß der Erfindung werden Dextrangele bevorzugt, die mit Epichlorhydrin vernetzt sind, jedoch können auch andere vernetzte Gele des in der USA.-Patentschrift 30 42 667 beschriebenen Typs vorteilhaft mit guten Ergebnissen verwendet werden.

Als Lösungsmittel für die Durchleitung des Gn-RH durch die Dextrangelsäulen wird vorzugsweise verdünnte Essigsäure verwendet, jedoch können auch andere wäßrige Säuren verwendet werden. Essigsäure hat den Vorteil, daß sie flüchtig ist und ein etwaiger Überschuß leicht entfernbar ist. Ein brauchbarer Bereich für die Konzentration der Essigsäure ist 0,02- bis l.Omolar, während eine Konzentration von etwa O.lmolar bevorzugt wird. Die Konzentration des Peptids für die Durchleitung durch die Gelfiltrationssäulen liegt zweckmäßig zwischen 2 und 10 % (g/100 ml), wobei ein Bereich von 4 bis 6 g/100 ml optimal ist. Auf die Entfernung der Schutzgruppen folgt bei dem im Beispiel beschriebenen Versuch die Gefriertrocknung, eine Stufe, die nach dem ersten Durchgang durch die Gelsäule wiederholt wurde. Diese Stufen dienen nur zur Entfernung des Lösungsmittels und sind für die Gewinnung eines Produkts von höherer Reinheit bedeutungslos. Anstatt durch Gefriertrocknung kann das Lösungsmittel auch nach anderen Verfahren, z. B. durch Abdampfen, entfernt werden.

Claims (1)

1 2

Reinigungsverfahren für Gn-RH, insbesondere ein

Patentanspruch: einfaches, großtechnisch durchführbares Verfahren

für die Herstellung von reinem Gn-RH, dessen

Verfahren zur Herstellung von biologisch reinem Reinheit wenigstens 95% beträgt, aus der rohen Gn-RH, dadurch gekennzeichnet, daß 5 mehrfach geschützten Dscapeptid Vorstufe verfügbar man eine Lösung des rohen Decapeptids zu machen.

p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NHä, Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung

das durch Entfernung der Schutzgruppen vom von biologisch reinem Gn-RH ist dadurch gekenngereinigten mehrfach geschützten Decapeptid mit zeichnet, daß man eine Lösung des rohen D;cap;ptids Fluorwasserstoff erhalten worden ist — die Reini- io p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NHj, gung wurde durch Durchleitung einer Lösung des das durch Entfernung der Schutzgruppsn vom gegeschützten Decapeptids durch eine Kieselgelsäule reinigten mehrfach geschützten Dscapsptid mit Fluorvor der Entfernung der Schutzgruppen mit Fluor- wasserstoff erhalten worden ist — die Reinigung wurde wasserstoff durchgeführt —, zuerst durch eine durch Durchleitung einer Lösung des geschützten Säule, die mit einem teilweise vernetzten Dextrangel 15 Decapeptids durch eine Kieselgelsäule vor der Entmit Affinität zu Molekulargewichten von 1000 bis fernung der Schutzgruppsn mit Fluorwasserstoff 2000 gefüllt ist, und anschließend durch eine zweite durchgeführt —, zuerst durch eine Säule, die mit Kolonne, die mit einem ähnlichen teilweise einem teilweise vernetzten Dextrangel mit Affinität vernetzten Dextrangel mit Affinität zu| Molekular- zu Molekulargewichten von 1000 bis 2000 gefüllt ist, gewichten unter 1500 gefüllt ist, leitet. ao und anschließend durch eine zweite Kolonne, die mit

einem ähnlichen teilweise vernetzten Dextrangel mit Affinität zu Molekulargewichten unter 1500 gefüllt ist,

leitet.

Es wurde gefunden, daß zur Herstellung von biolo- »5 gisch reinem Gn-RH aus der entsprechenden mehrfach

In einer Reihe von Veröffentlichungen werden geschützten Decapeptidvorstufe der Durchgang durch allgemeine Verfahren zur Herstellung des die Bildung zwei Dextransäulen sowie die Vorreinigung der und Ausschüttung von Gonadotropin anregenden Vorstufe notwendig sind. Wenn eine der Stufen Hormons oder Gonadotropinreleasing hormone weggelassen wird, wird ein Peptid erhalten, das nur (Gn-RH) beschrieben. Diese Veröffentlichungen be- 30 einen ungenügenden biologischen Titer für die medihandeln im wesentlichen den schrittweisen Aufbau zinische Anwendung des erhaltenen Materials hat. der Decapeptidkette nach dem klassischen Lösungs- Wenn beispielsweise die rohe mehrfach geschützte verfahren oder nach dem Feststoffphasen-Verfahren Vorstufe ohne jede Vorreinigung mit Fluorwasserstoff oder Merrifield-Verfahren. In allen Fällen müssen behandelt und keine weitere chromatographische einige der zur Kette gehörenden Aminosäuren an 35 Reinigung vorgenommen wird, hat das erhaltene den potentiell reaktionsfähigen Stellen außer der Gn-RH nur 12 bis 20% der Wirksamkeit eines oi-Aminogruppe geschützt werden. Dies führt zur chemisch reinen Materials. Wenn die erste der oben-Bildung einer Decapeptidkette mit der gewünschten geuannten Dextrangelsäulen aus dem vorstehend Aminosäuresequenz, die noch verschiedene Schutz- beschriebenen Reinigungsverfahren weggelassen wird, gruppen und häufig auf Grund unvollständiger Kupp- 40 wird nur eine Wirksamkeit von 90 % erzielt, während lungsreaktionen verschiedene andere Peptidketten das beste erhältliche Gn-RH-Material, das durch enthält. Diese letztgenannten Peptide haben keine andere Reinigungsstufen als die Behandlung mit den Gn-RH-Aktivität, aber ähnliche physücalisch-che- vorstehend genannten Dextrangelsäulen erhalten wird, mische Eigenschaften wie Gn-RH, so daß ihre Elimi- eine Reinheit von nur 82 bis 85 % hat. Nach dem Vernierung äußerst schwierig ist. 45 fahren gemäß der Erfindung wird stets Gn-RH mit der

Die vorstehend genannten Schutzgruppen lassen Reinheit von 95% erhalten.

sich durch eine einfache chemische Behandlung, z. B. Bei einer allgemeinen Ausführungsform des Ver-

die Raumtemperaturbehandlung des mehrfach ge- fahrens gemäß der Erfindung wird ein mshrfach schützten Decapeptids mit Fluorwasserstoff, z. B. geschütztes Decapeptid, das die Aminosäuresequenz nach dem Verfahren, das von Sakakibara 50 von Gn-RH aufweist und mit Fluorwasserstoff und Mitarbeitern in Bull. Chem. Soc. Japan 38, entfernbare Schutzgruppen bei Arg, Ser, Tyr und 141 (1965), beschrieben wird, entfernen. Durch gegebenenfalls bei His enthält, durch Auflösen in Entfernung von überschüssigem Fluorwasserstoff wird einem geeigneten nicht wäßrigen Lösungsmittel oder das gewünschte ungeschützte Decapeptid gebildet. Lösungsmittelgemisch vorgereinigt und zur Abtren-Leider wird dieses Material auf Grund der vorstehend 55 nung einiger der in der Lösung enthaltenden Verungenannten anderen (kürzeren) Peptide von sonst gleicher reinigungen durch eine Kieselgelsäure geleitet. Nach chemischer Struktur gewöhnlich in einer Reinheit dem Abdampfen des Lösungsmittels wird dann das von nur etwa 20 % oder weniger erhalten. Ein Material gereinigte mehrfach geschützte Decapeptid in ein dieser Art ist auf Grund der Natur der Verunreini- gegen Fluorwasserstoff beständiges Reaktionsgefäß gungen äußerst schwierig zu reinigen. Nach den bisher 60 gegeben und mit Fluorwasserstoff in Gegenwart einer entwickelten besten Verfahren wird nur ein Teil der aromatischen Flüssigkeit behandelt, die als Absorber Verunreinigungen entfernt, wobei ein Gn-RH-Material für die Schutzgruppen dient, die in dieser Stufe vom erhalten wird, das nur 60 bis 80% der Wirksamkeit Decapeptid abgespalten werden. Das Decapeptid, eines biologisch reinen Materials hat, auch wenn die von dem die Schutzgruppen entfernt sind, wird dann Reinigung durch zahlreiche Durchgänge einer Lösung 65 aus der Flüssigphase entfernt, in ein geeignetes der Verbindung durch Chromatographiesäulen vor- Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch gegeben und genommen wird. auf eine Gelfiltrationssäule aufgegeben, die Peptide

Die Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein mit Molekulargewichten außerhalb des Bereichs von