DE2300474C3 - Biochemisches Verfahren zur Herstellung eines Milch zum Gerinnen bringenden Enzyms - Google Patents

Description

Lab ist ein Extrakt, welcher aus Magenschleimhäuten von Milchkälbem gewonnen wird und eine Koagulierungswirkung auf das Kasein von Milch aus- 3» übt. Diese Koagulierungswirkung hat ihren Grund in der Anwesenheit eines Enzyms, nämlich Renin, welches gegenüber kappa-Kapsein eine spezifische proteolytische Aktivität besitzt.

Auf Grund der Natur seines Ausgangsmaterials kann Lab nur in beschränkten Mengen und nur in unregelmäßiger Weise, insbesondere in Abhängigkeit von den Jahreszeiten, erhalten werden. Da dieses Produkt in beträchtlichen Mengen in der Käseindustrie verbraucht wird, ist man auf Grund dieses Man- 4» gels gezwungen, Ersatzprodukte aufzufinden. Durch zahlreiche Arbei.en, die insbesondere auf dem Gebiet der Biosynthese durchgeführt wurden, ist es möglich geworden, solche Enzyme aus Mikroben herzustellen.

Jedoch hat dieses »microbielie Lab« eine geringere proteolytische Aktivität, die für die Herstellung von Käse oftmals nicht ausreicht.

Es wurde nunmehr gefunden, daß ein bekannter Microorganismus ein Enzym zu liefern vermag, das 5" eine ähnliche Aktivität wie Renin aufweist.

Gegenstand der Erfindung ist also ein biochemisches Verfahren zur Herstellung eines Milch zum Gerinnen bringenden Enzyms, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Microorganismus Physa- 5;ϊ rum polycephalum, der vorn Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande, unter der Nummer 49161 erhältlich ist. aerob in einem wäßrigen Medium als Oberflachenkultur oder ak Submerskultur züchtet, bis eine beträchtliche Menge dieses Enzyms gebildet worden ist, und daß man das Enzym nach der Oberflächenkultur vom Microorganismus bzw. nach der Submerskultur aus der Fermentationsflüssigkeit abtrennt.

Dieser Microorganismus ist nicht nur beim Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn unter der Nummer 49161 niedergelegt und für die Öffentlichkeit zueänelich. sondern z. B. auch vom Institut

Suisse de Recherches sur le Cancer (Lausanne,

Schweiz) erhältlich. ·«·,,,,

Dieser Microorgamsmus tritt im Verlauf einer Phase seines Lebenszyklusses, nämlich in der Wachsumsphase, in einer Form auf, die für Myxomyceten charakteristisch ist und die als »Plasmodium« bezeichnet wird. Dieses Plasmodium ist eine unregelmäßige Protoplasmamasse, die zahlreiche Zellkerne enthält, nicht in Zellen unterteilt ist, eine gelbe Färbung zeigt und mehrere cm² bedecken kann. Wenn das Medium, in welchem sich das Plasmodium befindet für das Leben des Microorganismus günstig ist, dann entwickelt sich das Plasmodium an einer Stelle, wenn aber das Medium ungünstig wird oder sich an Nährstoffen erschöpft, dann wandert das Plasmodium. Wenn diese Wanderung des Plasmodiums keine Verschlechterungen der Lebnsbedinguneen von Physarum polycephalum mit sich bringt, dann nimmt der Microorganismus eine neue Form an, die mit Sclerotium bezeichnet wird, unter welcher Form es der Kälte und der Austrocknung widerstehen und 1 Jahr oder mehr überleben kann.

Das Wachstum des Plasmodiums von Physarum polycephalum kann unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 25^r C in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums, dessen pH vorzugsweise auf zwischen 4,5 und 4,6 eingestellt ist, durchgeführt werden. Der Ausdruck »wäßriges Nährmedium« bezeichnet ein wäßriges Kulturmedium, das die Stoffe enthält, die für das Leben des Microorganismus nötig sind und von ihm assimiliert werden können. Beispiele für solche Stoffe sind insbesondere Kohlenstoff- und Stickstoffquellen wie auch Mineralsalze. Das Nährmedium kann aber auch andere Stoffe enthalten, wie z. B. Vitamine, Wachsturnsfaktoren und Spurenelemente. Das wäßrige Nährmedium kann auch Kohlehydrate, wie z. B. Glukose, Proteinhydrolysate, Hefeextrakte, Hühnchenembryoextrakte und Mineralsalze enthalten. Die Proteinhydrolysate, die Hefeextrakte und die Hühnchenembryoextrakte können durch ein Aminosäuregemisch, durch Biotin oder durch Hematin ersetzt werden.

Das Wachstum von Physarum polycephalum kann als Oberflächenkultur auf einem festen Träger wie auch in einer Tauchkultur, beispielsweise in Schüttelflaschen oder in einem Fermentator, durchgeführt werden.

Beispielsweise kann man bei der Oberflächenkultivierung des Plasmodiums des Physarum polycephalum-Stamms ein geeignetes Kulturmedium dadurch herstellen, daß man Agar zu einem wäßrigen Nährmedium zugibt, das vorher sterilisiert worden ist und das Glukose, Hefeextrakt, ein Proteinhydrolysat, Mineralsalze und Hematin enthält, wobei der letztere Bestandteil nach eimer Sterilisation des wäßrigen Mediums zugegeben wird. Das Gemisch wird in Petri-Schalen gegossen, mit einem Plasmodium von Physarum polycephalum geimpft und auf Inkubationetemperatur, beispielsweise 25° C, gehalten. Die Kultur entwickelt sich rasch, bedeckt die Oberfläche der Petri-Schale in einigen Tagen und behält die Form des Plasmodiums noch eine weitere Woche bei, worauf dann das Sclerotium in Erscheinung tritt.

Die Oberflächenkultur kann auch auf einem Filterpapier durchgeführt werden, dps durch Kapilarität mit flüssigem Nährmedium versorgt wird.

Wenn das Wachstum des Mikroorganismus in einer Tauchkultur erfolgt, beispielsweise in Schüttel-

flaschen oder in einem Fermentator, dann erscheint Man kann eine konzentrierte Lösung des Enzyms Physaram polycephalum in Fenn eines in sehr feine durch Gefrierkonzentrierung der wäßrigen Lösung Partikelchen unterteilten Plasmodiums, welche als herstellen, die nach dem einen oder dem anderen Microplasmodia bezeichnet werden und welche im oben beschriebenen Verfahren gewonnen worden istflüssigen Nährmedium in Suspension vorliegen. 5 Hierzu unterwirft man die wäßrige Lösung einer

Wenn die Tauchkultur in Flaschen ausgeführt wird, langsamen Gefrierung, trennt die gefrorene und die dann bringt man das Nährmedium, das vorher sten- flüssige Phase und gewinnt die flüssige Phase, die lisiert worden ist, in Flaschen ein und impft dieses reicher an Proteinen ist als die gefrorene Phase. VorMedium mit Hilfe von Plasmodium, das von einer zugsweise gewinnt man diese flüssige Phase durch Oberflächenkultur oder von einer Tauchkultur io Mischen mit einer Pufferlösung, deren pH für die stammt Die Kultivierung wird bei einer geeigneten Aktivität des proteolytischen Enzyms günstig ist. Temperatur, beispielsweise 25° C, durchgeführt, wo- Wenn es erwünscht ist, ein reines Produkt herzubei die Flasche geschüttelt wird, um eine richtige stellen, dann kann man das proteolytische Enzym Sauerstoffzufuhr zum Microorganismus sicherzustel- von den anderen Stoffen abtrennen, die in der konlen Nach einer latenten Phase, die 12 h (wenn das 15 zentrierten enzymatisdien Lösung vorhanden sind. Inoculum von einer Tauchkultur kommt) bis 2 oder Hierzu kann man die Proteine von der konzentner-3 Tage (wenn das Inoculum von einer Oberflächen- ten Lösung beispielsweise durch Ausfallung abtrenkultur auf Agar kommt) dauern kann, nimmt das nen, eine neue wäßrige Lösung der Proteine herstel-Waciistum in 3 Tagen das Maximum an. len und diese Lösung durch em chromatographisches

Wenn die Tauchkultivierung in einem Fermentator ao Verfahren fraktionieren. Dabei isoliert man die elu-

auseeführt wird, dann wird das flüssige Nährmedium ierten Fraktionen, welchis die gewünschte optische

in den Fermentator eingebracht und sterilisiert. Vor- Dichte und die gewünschte proteolytische Aktivität

zugsweise werden als assimilierbare Kohlenstoff- und aufweisen, wobei ein praktisch reines Produkt ernal-

Stickstoffquellen Glukose, Hefeextrakt und ein Pro- ten wird.

teinhydrolysat verwendet, wobei die Glukose gemäß »5 Das Studium des auf diese Weise gereinigten bn-

einer bekannten Technik erst nach einer Sterilisation zyms zeigt, daß es insbesondere die Phenylalanin/

der anderen Bestandteile im Fermentator in das Methionin-Bindung der Peptidkette des kappa-Ka-

Nährmedium eingeführt wird. Das Inoculum, das seins aufbricht, d. h., daß es auf die Milch eine Koa-

vorzugsweise von einer Tauchkultur stammt, wird gulierungswirkung ausübt, die identisch mit derjeni-

dann in den Fermentator eingebracht, der auf einer 3° gen von Renin ist.

für das Wachstum des Microorganismus günstigen Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele

Temperatur gehalten wird, beispielsweise 25° C. Die näher erläutert. Kultivierung wird unter Rühren mit Hilfe eines sich

drehenden Rührers ausgeführt, der sich mit einer aus- . 11

reichenden Geschwindigkeit dreht, das eine richtige 35 Beispiel 1

Sauerstoffzufuhr zum Kulturmedium sichergestellt _{Eg wird dne Kultivierun}g _unter Tauchbedingungen

wird. _ei_nes Stamms von Physaram polycephalum, der vom

Eine Überprüfung des Kulturmediums hat gezeigt, ^^ _{Suisse de R}^_{tT±ts S}ur le Cancer (Lau-

daß unabhängig von der verwendeten Kultivierung?- Schweiz) erhalten worden ist und der mit dem

methode der Physarum polycephalum-Stamm auf ex- 40 _{im K(}!_{nnzeichen ang}egebenen Stamm identisch ist, in

tracellularem Wege ein proteolytisches Enzym er- ^_{n J5} , _{fassenden Ferme}ntator durchgeführt, der

zeugt, das Milch gerinnen laßt. Dieses Enzym, wel- _{em wäßri Nä}hrmedium enthält, dessen Zusam-

ches anschließend als wäßrige Losung gewonnen _menselzung ausgedrückt in Gewichtsprozent, wie

werden kann, kann in vorteilhafter Weise bei der _{fol ist}.

Koagulation von Milch als Ersatz für Lab verwendet 45 ^B

werden. _Λ

Wenn die Produktion des Enzyms in einer Ober- Glukose 1

flächsnkultur ausgeführt worden ist, dann kann das Hefeextrakt 0,15

Enzym dadurch gewonnen werden, daß man den Kaseinhydrolysat 1

Microorganismus mit einer Salzlösung wäscht, bei- 50 CaCh · 2H2O 0,06

spielsweise mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung. KH2PO4 0,2

die 9 0g NaCl/1 Wasser enthält, und daß man die MgSO₄ · 7H2O 0,0ö

Waschlösung auffängt, die das Enzym in Lösung ent- FeCU · 4H₂O 0,006

J₁^₁ MnCh · 4H2O 0,008d

Wenn die Kultivierung des Physarum polycepha- 55 ZnSO₄ · 7H₂O n'«³⁵

lum-Stamms unter Tauchbedingungen in Flaschen Zitronensäure 0,35

oder in einem Fermentator ausgeführt worden ist, Hematin . υ,υυι»

dann trennt man die Microplasmodien vom flüssigen destilliertes Wasser ad 100

Nährmedium ab, beispielsweise durch Dekantation,

Filtration oder Zentrifugen, und gewinnt das En- 60 Hierzu werden in den Fermentator 8 1 einer waß-

zym als Lösung in der wäßrigen Flüssigkeit. rigen Lösung eingebradit, welche d.ese Bestandteile

Die nach dem einen oder nach dem anderen Ver- außer der Glukose und dem Hematin enthalt, worauf

fahren gewonnene wäßrige Lösung zeigt eine proteo- die Lösung durch Erhitzen auf 121 C.unter^ Druck

Mische Aktivitä*. die leicht meßbar ist. während 15 min sterilisiert wird. Die Glukose wird

Der Koagulierungseffekt dieser wäßrigen Lösung 65 in Wasser, und zwar in einer Konzentration von

gegenüber Milch wurde an entrahmter Milch gezeigt, 50 g/l, aufgelöst und gesondert sterilisiert Dann w.rd

die verschiedene Gehalte an Feststoffkonzentrationen die im Fermentator enthaltene Losung auf 25 C ab-

23 zwar insbesondere 12 und 24«/₀. gekühlt und die wäßrige sterile Glukoselosung in den

23 OO 474

Fermentator eingeführt. Dann wird der pH des Gemisches mit Hilfe einer sterilen wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf 4,5 eingestellt, und dann wird das vorher während 15 min bei 121° C in einer wäßrigen alkalischen Lösung sterilisierte Hematin zugegeben.

Hierauf werden in das Nährmedium 2 1 eines Inoculums eingebracht, das durch Tauchkultivierung von Microplasmodien des Physarum polycephalum-Stamms in Flaschen während 2 Tagen erhalten worden ist.

Das Nährmedium wird mit Hilfe eines Rührers, der 150 U/min macht, gerührt, um eine ausreichende Sauerstoffzufuhr zum Medium sicherzustellen, wobei es auf 25° C gehalten wird. Die Kultivierung des Microorganismus wird 20 h durchgeführt, wobei eine Kulturbrühe erhalten wird, die 1 Gewichtsprozent Zellenmaterie, bezogen auf Trockensubstanz, enthält.

Hierauf werden die Microplasmodien des Stamms vom wäßrigen Nährmedium durch Zentrifugierung abgetrennt, wobei die überstehende Flüssigkeit gewonnen wird. Die proteolytische Aktivität dieser überstehenden Flüssigkeit wird nach dem Verfahren, das mit »Azocoll« bezeichnet wird, bestimmt. Dieses Verfahren besteht darin, daß man die Lösung, deren proteolyti^r ~he Aktivität man messen will, auf ein »Azocoll« gezeichnetes Substrat einwirken läßt, welches aus einem unlöslichen Pulver von Rindleder besteht, das einen stark roten Farbstoff enthält. Diese Substanz enthält zahllose übliche Peptidbindungen, die für Proteine charakteristisch sind. Wenn ein proteolytisches Enzym seine Wirkung auf diese Substanz ausübt, dann wird der rote Farbstoff in das Medium abgegeben. Die Färbung des Mediums gestattet dann die Messung der proteolytischen Aktivität des untersuchten Enzyms. Das Substrat »Azocoll« wird in einer 0,05 molaren Acetatpufferlösung mit einem pH von 4,5 susppndiert, und zwar in einer Konzentration von 25 mg Azocoll auf 5 ml Pufferlösung. Die überstehende Flüssigkeit wird zu einer bestimmten Menge dieser Suspension zugegeben, das Gemisch wird 15 min auf 37° C gehalten, und dann wird das Substrat durch Filtration entfernt. Hierauf wird die optische Dichte der erhaltenen Lösung bei einer Wellenlänge von 510 um gemessen. Eine Aktivitätseinheit, gemessen nach diesem Verfahren, wird als die Menge enzymatischem Produkt bezeichnet, d. h. als die Menge der überstehenden Flüssigkeit, die eine Zunahme der optischen Dichte um eine Einheit hervorruft. Die auf diese Weise gemessene proteolytische Aktivität der überstehenden Flüssigkeit ist 0,7 Einheiten/ml.

Das erhaltene Produkt mit der enzymatischen Aktivität besitzt die folgenden Eigenschaften:

Einfluß des pH auf die proteolytische Aktivität

Die Untersuchung der proteolytischen Aktivität in einer pH-Reihe, die sich von 3,0 bis 7,0 erstreckte, zeigte, daß diese Aktivität zwischen einem pH von 4,0 und 5,0 maximal ist und bei einem pH von 7,0 um mindestens 15% abnimmt.

Einfluß der Temperatur auf die Aktivität

Die proteolytische Aktivität ist zwischen 0 und 30° C konstant, nimmt über 30° C ab und wird dann über 60° C oraktisch Null.

Koagulierungswirkung auf Milch

Ein Gemisch aus gleichen Volumina der überstehenden Flüssigkeit und einer entrahmten Milch mit 12% Feststoffgehalt gerinnt bei 37° C in 10 min.

Das gleiche Gemisch »erinnt bei identischen Bedingungen, wenn die Milch einen Feststoffgehalt von 24% aufweist, in 4 min.

Beispiel ₂

Die in Beispiel 1 erhaltene überstehende Flüssigkeit wird durch Gefrierkonzentrierung konzentriert. Hierzu wird sie abgekühlt, um die Verfestigung einzuleiten. Die nicht-gefrorene Fraktion, deren Konzentration an Proteinstoffen sich in Abhängigkeit von der Menge der verfestigten Phase erhöht, wird gewonnen und mit einer 0,05 molaren Acetatpufferlösung mit einem pH von 4,5 gemischt. Auf diese Weise werden 1,5 1 einer konzentrierten Lösung erhalten.

ao Deren proteolytische Aktivität, die durch das oben in Beispiel 1 beschriebene »Azocoll«-Verfahren gemessen worden ist, beträgt 3,5 Einheiten/ml.

Hierauf werden die in der konzentrierten Lösung enthaltenen Proteine mit Hilfe von Ammoniumsulfat ausgefällt., worauf dann die gebildete Ausfällung durch Zentrifugierung gewonnen wird. Diese Ausfällung wird in einer 0,05 molaren Acetatpufferlösung mit einem pH von 4,5 aufgelöst, worauf dann diese Lösung während 24 h gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert wird.

Die erhaltene Lösung wird dann durch Chromatographie fraktioniert, indem sie durch eine Diäthylamino-Äthylcellulose-Kolonne hindurchgeführt wird, die mit Hilfe einer 0,05 molaren Acetatpufferlösung, welche in bezug auf Natriumchlorid V10 normal war, ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die Elution wird mit dieser Pufferlösung in einer Menge von 50 ml/h ausgeführt. Jede eluierte Fraktion wird einer optischen Dichtemessung bei einer Wellenlänge von

♦° 260 /<m, wie auch einer Bestimmung der proteolytischen Aktivität unterworfen. Die Elution des proteolytUrhen Enzyms ergibt 3 ausgeprägte proteolytische Aktivitätsspitzen. Es werden die 3 Fraktionen gewonnen, die diesen 3 Elutionsspitzen entsprechen.

Hierauf werden Vergleichsversuche hinsichtlich der Wirkungsweise von Renin und einer jeden der 3 durch Elution erhaltenen Fraktionen auf kappa-Kasein ausgeführt.

Es ist bekannt, daß Renin speziell die Phenylalanin/Methionin-Spitze der Peptidkette von kappa-Kasein spaltet. Wenn man ^ρΉη auf kappa-Kasein einwirken läßt und wenn man Carboxypeptidase A zufügt, dann wird das Phenylalanin in Freiheit gesetzt und kann analysiert werden. Der Zusatz von Carboxypeptidase allein ergibt keine in Freiheitsetzung von Phenylalanin.

Dagegen ergeben die Elutionsfraktionen, welche den 3 proteolytischen Aktivitälsspitzcn auf kappa-Kasein entsprechen, in einer Menge von 1 Gewichts-

teil enzymatisches Produkt auf 100 Gewichtsteile Substrat, und eine anschließende Einwirkung von Carboxypeptidase A eine in Freiheitsetzung von Phenylalanin. Dies zeigt die ähnliche Wirkungsweise von Renin und dem enzymatischen Produkt gegenüber

kappa-Kasein.

Claims (2)

Patentanspriidie:

1. Biochemisches Verfahren zur Herstellung

- eines Milch zum Gerinnen bringenden Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man

'■- den Microorganismus Physarum polycephalum, der vom Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande, unter der Nummer 49161 erhältlich ist, aerob in einem wäC.igen Medium w als Oberflächenkultur oder als Submerskultur züchtet, bis eine beträchtliche Menge dieses Enzyms gebildet worden ist, und daß man das Enzym nach der Oberflächenkultur vom Microorganismus bzw. nach der Submerskultur aus der »5 Fermentationsflüssigkeit abtrennt.

2. Verwendung des nach Anspruch 1 hergestellten Enzyms zum Gerinnen von Milch.