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2.2'-Cyclocyt.idin-3',5'-diphosphorsäure-Ierivate.
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Die Erfindung betrifft neue 2,2'-Cyclocytidinderivate und neue Verfahren
zu ihrer Herstellung und bezieht sich insbesondere auf neue 2,2'-Cyclocytidin-3',5'-diphosphorsäure-Derivate
der Formel
in der X ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom oder eine Methylgruppe bedeutet.
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In den angegebenen Formeln, wie auch in Formel I, werden die erfindungsgemäßen
2,2'-Cyclocytidinderivate in Form der freien Base gezeigt, da jedoch die meisten
Verbindungen dieser Gruppe in Form der freien Base instabil sind, wird bevorzugt,
diese Produkte in Form von Salzen mit pharmazeutisch geeigneten Säuren berzustellen.
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Im Einzelfall kann frei gewählt werden, welche Form jeweils in dem
betreffenden Fall geeignet ist. Die Erfindung umfaßt daher sowohl die freie Base,
als auch die Salze dieser Base, zu denen auch intramolekulare Salze gehUren.Als
Säuren können pharmazeutisch
geeignete anorganische Säuren , wie
Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure und dergleichen, oder organische Säuren, wie
Ameisensäure und dergleichen gewählt werden.
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Diese Verbindungen haben biologische Eigenschaften, die sie als Antivirusmittel,
Antitumor- und Antikrebsmittel geeignet machen.
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Sie sind daher nicht nur in Form therapeutischer Zubereitungen, sondern
auch als Zwischenprodukte für therapeutische Zubereitunngen wichtig.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach folgendem Verfahren
hergestellt werden.
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2,2'-Cyclocytidin-3,5'-diphosphorsäure-Derivate der allgemeinen Formel
worin X für Wasserstoff, Methyl oder Halogen steht, können durch Erhitzen eines
entsprechenden Cytidin-Derivats mit der allgemeinen Formel
worin X die- angegebene Bedeutung hat, mit einer Chlorphosphorsaure
erhaltene werden.
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Die 2,2'-Cyclocytidin-3t,5t-diphosporsäure-Derivate sind eine Verbindungsgrùppe,
die krebshemmende Wirksamkeit besitzt; sie werden daher als vielversprechende Arzneimittel
angesehen.
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Als synthetisches Verfahren zur Herstellung von 2,2'-Cyclocytidin-3',5'-diphosphorsäure
ist die Umsetzung nach E.R. Walwick et al bekannt (Proceeding of Chemical Society,
Seite 84, 1969).
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Bei diesem Verfahren setzt man Cytidin unter Erhitzen mit einer Polyphosphorsäure
zu der 2,2'-Cyclocytidin-3',5"-diphosphorsäure um. Dieses Verfahren hat jedoch den
Nachteil, daß die fraktionierte Reinigung des Produkts nur schwierig durchzuführen
ist und daß auch die Ausbeuten gering sind.
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Von den Erfindern wurde versucht, Phosphorsäure direkt mit den 2,2'-Cyclocytidin-Derivaten
zu kombinieren, um zu den 2,2'-Cyclocytidin-3',5'-diphosphorsäure-Derivaten zu kommen.
Dieses Ziel konnte jedoch nicht erreicht werden, da die als Ausgangsstoffe verwendeten
2,2'-Cyclocytidin-Derivate in organischen Lösungsmitteln kaum löslich sind.
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Nach ausführlichen Untersuchungen über die vorteilhafte Herstellung
von 2,2'-Cyclocytidin-3',5'-diphosphorsäure-Derivaten wurde das oben beschriebene
Verfahren vervollständigt.
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Da die oben genannten Cytidine Verbindungen sind,die in der Natur
verbreitet vorkommen oder leicht aus solchen hergestellt werden können, sind sie
als Ausgangsmaterialien sehr vorteilhaft.
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Bei dem Verfahren der v-orliegenden Erfindung können 2,2'-Cyclodytidin-3',5'-diphoephorsaure-Derivate
leicht hergestellt werden, indem man Cytidin-Derivate der allgemeinen Formel II
bei 50 bis 800C über einen Zeitraum von 20 bis 48 Stunden, vorzugsweise bei 7000
über einen Zeitraum von 20 bis 30 Stunden, mit einer Ghlorphosphorsäure umsetzt.
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Beispiele für Chlorphosphorsäuren, die bei dieser Reaktion verwendet
werden können, sind die Verbindungen, die gebildet werden, wenn eine oder mehrere
Hydroxylgruppen der Phosphorsäure oder der Pyrophosphorsäure durch Chlor ersetzt
werden. Beispiele hierfür sind Dichlorphosphorsäure, pyrophosphorylchlorid etc.
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sowie deren Ester tnd Gemische dieser Stoffe. Vom Standpunkt der Handhabbarkeit
ist es besonders zweckmäßig, ein Hydrolysat oder Alkoholysat zu verwenden, das durch
Zugabe von Wasser oder einem niedrigen aliphatischen Alkohol mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen
wie n-Butanol, tert.-Butanol etc. oder Phenol in einem Molverhältnis von o,5 bis
2,o zu Phosphoroxychlorid oder Pyrophosphorylchlorid erhalten worden ist. Bei der
vorliegenden Erfindung ist es nicht immer notwendig, die wie oben hergestellten
Chlorphosphorsäuren zu reinigen, sondern man kann auch ein Reaktionsgemisch verwenden,
das die Chlorphosphorsäuren enthält. In diesem Falle werden die Chlorphosphorsäuren
im allgemeinen in einer Menge von etwa 5 bis 25 Mol Je i-Iol der als Ausgangsmaterialien
verwendeten Cytidin-Derivate eingesetzt.
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Vom Standpunkt der Ausbeute aus ist es aber vorteilhaft, etwa 2O Mol'dieser
Chlcrphosphorsäuren zu verwenden.
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Die 2s 2ß-Cyclocytidin-3',5t-diphosphorsäure-Derivate können z.B.
soaus dem resultierenden Reaktionsgemisch gewonnen werden, daß ein konzentriertes,
Gemisch dieses Reaktionsgernisches in Eiswasser eingegossen wird und daß hieraur
eine Entsalzungsbehandlung unter Verwendung von Aktivkohle durchgeführt wird.
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Man kann auch so vorgehen, daß man eine UberschUssige Menge Xtbylalkohol
zusetzt, um die anorganische Phosphorsäure zu entfernen und hierauf die entsalzte
Flüssigkeit einer Säulenchromatographie unter Verwendung von Anionenaustauscher-Harzen
unterwirft, wodurch die reinen 2,2'-Cyclocytidin-3",5'-diphosphorsäure-Derivate
erhalten werden.
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Beispiel 1 2 g Cytidin wurden zu einer Lösung gegeben, die durch
teilweise Hydrolyse von 15,1 ml Phosphoroxychlorid mit 2,96 ml Wasser erhalten worden
war und das Gemisch wurde 22 Stunden auf 600C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die
resultierende Reaktionslö-Lösung unter vermindertem Druck konzentriert. Der erhaltene
Rückstand wurde in 5 ml Wasser aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde unter Rühren
in 150 ml Äthylalkohol gegossen, wodurch sich ein weißer Niederschlag abschied.
Die Lösung wurde in einem Kühlschrank über Nacht stehen gelassen. Sodann wurde der
Niederschlag abfiltriert. Nach dem Waschen mit Äthylalkohol wurden die Filterkuchen
in 40 ml Wasser aufgelöst und die resultierende Lösung wurde durch eine Säule geleitet,
die mit 100 ml Diaion SA-11B (in der Ameisensäure-Form, Warenzeichen für einen Ionenaustauscher
von Nitsubishi Chemical Industries, Led., Japan) gefüllt war, um eine Adsorption
vorzunehmen. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Harz nach der Gleichgewichtsgradient-Eluierungsmethode
chromatographiert, wobei 2 1 Wasser und 2 1 0,1 m Ameisensäurelösung verwendet wurden.
Alle 15 ml wurden Fraktionen gesammelt.
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Die auf diese Weise eluierten 107-ten bis 130-ten Fraktionen wurden
konzentriert. Der resultierende Rückstand wurde in einer geringen Wassermenge aufgelöst.
Die resultierende Lösung wurde über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Auf
diese Weise wurden 1,41 g Kristalle von 2,2'-Cyclocytidin-3',5'-diphosphorsäure
erhalten (Ausbeute 44,4 %). Diese Substanz hatte die folgenden Eigenschaften: Schmelzpunkt:
194 bis 198°C (nicht korrigiert) Optische Drehung: [OL 25 - 36,50 (C:0,1, Wasser)
Ultraviolett-Absorption: A, K20,H 233, 263 mji AM:9.000; 10.200) Diese Werte entsprechen
den Literaturwerten.
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Papierchromatographie: (Lösungsmittel: Isopropylalkohol: konzentrierte
Salzsäure: Wasser = 34:8,2:7,8): Rf-Wert= 0,57
Papierelektrophorese
(Phosphat-Pufferlösung, pH-Wert 7,5, 700 Volt 2 Stunden): Anodenwanderung 11,8 cm
Beispiel 2 2,64 g 5-Brom-cytidin wurden zu einer Lösung gegeben, die durch teilweise
Hydrolyse von 15,1 ml Phosphoroxychlorid mit 2,96 ml Wasser erhalten worden war.
Das Gemisch wurde 22 Stunden auf 60 0C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Lösung
bei vermindertem Druck konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde in 100 ml Wasser
aufgelöst, die resultierende Lösung wurde durch eine Säule geleitet, die mit 83
g Aktivkohle gefüllt war, um die angestrebte Substanz zu adsorbieren. Nach dem Waschen
mit Wasser wurde die durch 5 1 eines Gemisches von Wasser-Methylalkohol-Salzsäure
(2:4:1) eluierte Fraktion auf 4 ml eingeengt.
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Zu dem resultierenden Konzentrat wurden 100 ml Aceton gegeben.
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Der erhaltene Niederschig wurde abfiltriert. Der Filterkuchen wurden
40 ml Wasser aufgelöst und die erhaltene Lösung wurde durch eine Säule geleitet,
die mit 80ml Diaion SA-11B (des Ameisensäure-Typs, Warenzeichen für einen Ionenaustauscher
von Kitsubishi Chemichal Industries, Ltd., Japan) gefüllt war, um eine Adsorption
vorzunehmen. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Harz nach der Gleichgewichtsgradient-Eluierungsme
thode Säulen chromatographiert, wobei 2 1 Wasser und 2 1 o,1 m Ameisensäurelösung
verwendet wurden. Alle 15 ml wurden Fraktionen gesammelt. Die auf diese Weise eluierten
loo. bis 125. Fraktionen wurden konzentriert, wodurch o,94 g glasartige 5-Brom-2,2'-cyclocytidin-3',5'-phosphorsäure
erhalten wurden (Ausbeute: 24,67ç). Die auf diese Weise erhaltene Verbindung hatte
die folgenden Eigenschaften: Ultraviolett-Absorption: X H,O,H+ 235, 282 Papierelektrophorese
(Phosphat-Pufferlösung, pH 7,5, 700 Volt, 2 Stunden): Anodenwanderung 11,2 cm Bew
einer katalytischen Reduktion durch Palladium.-Kohlenstof^ wurde gefunden, daß die
auf diese Weise erhaltene Verbind1wnmit
der in Beispiel 1 erhaltenen
2,2'-Cyclocytidin-3',5'-diphosphorsäure Identisch war.
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Nach dcr Arbeitsweise des Beispiels 2 wurden 5-Jod-2,2'-cyclocytidin-3',5'-diphosphorsäure,
5-Chlor-2,2'-cyclocytidin-)',5'-diphosphorsaure, 5-Fluor-2,2'-cyolocytidin,3',5'-diphosphorsäure
und 5-Methyl-2,2'-cyclocytidin-3',5'-diphosphorsäure aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen:
5-Jodcytidin, 5-Chlorcytidin, 5-Fluorcytidin und 5-Methbrlcytidin erhalten.
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Beispiel 3 2,14 g 5-Fluorcytidin wurden zu eine Lösung gegeben, die
durch teilweise Hydrolyse von 15,1 ml Phosphoroxychlorid mit 2,96 ml Wasser hergestellt
worden war, und dann 22 Stunden auf 60°C erhitzt. Der erhaltene Rückstand wurde
in 100 ml Wasser aufgelöst.
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Die resultierende Lösung wurde durch eine Säule geleitet, die mit
83 g Aktivkohle gefüllt war, um die gewünschte Substanz zu adsorbieren. Nach dem
Waschen mit Wasser wurde eine mit 5 1 eines Wasser-Methylalkohols-Chlorwasserstoffsäure-Gemisches
(2:4:1) eluierte Fraktion auf 4 ml eingeengt.
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Zu dem resultierenden Konzentrat wurden 100 ml Aceton gegeben.
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Der erhaltenen Niederschlag wurde abfiltriert. Der Filterkuchen wurde
in 40 ml Wasser gelöst und die erhaltene Lösung wurde durch eine Säule geleitet,
die mit 80 ml Diaion SA-11B (Ameisensäure-Typ, Warenzeichen für ein Ionenaustauscherharz
von Mitsubishi Chemical Industries. Ltd., Japan) gefüllt war, um die Adsorption
vorzunehmen. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Harz nach der Gleichgewichtsgradient-Elutionsmethode
der Säulenchromatographie
unterworfen,wobei 2 1 Wasser und 2 1 0,1
m Ameisensäurelösung verwendet wurden. Alle 15 ml wurden Fraktionen aufgefangen.
Die auf diese Weise eluierte 105-te bis 130-te Fraktion wurde konzentriert, wobei
172 g kristalline pulverförmige 5-Fluor-2,2'-cyclocytidin-3',5'-diphosphorsäure
erhalten wurden (46,2 ). Die so erhaltene Verbindung hatte folgende Eigenschaften:
Ultraviolett-Adsorption: X H 0,H 230;269 44 mix Papierelektrophorese (Phosphat-Pufferlösung,
pH 7,5, 700 Volt, 2 Stunden): Anodenwanderung 11,5 cm Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen
Verbindungen gegenüber Leukämie wurde mit der von Arabinosylcytosin verglichen,
das als übliches gut wirksames Arzneimittel gegen Leukämie angesehen wird.
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Die Ergebnisse sind nachstehend im Hinblick auf L 1210-Leukimie der
Maus gezeigt.
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Gruppen von 6 männlichen und weiblichen BDF-Näusen mit enem Gewicht
von 20+2g wurden als Versuchstiere verwendet. Den Mäusen wurden 1 x 105 der 1 1210-Leukäinie
intraperitoneal implantiert. Die zu prüfende Verbindung wurde einmal täglich während
5 Tagen intraperitoneal injiziert, womit 24 Stunden nach der Transplantation begonnen
wurde. Die Antitumorwirksamkeit wurde durch die prozentuale Erhöhung der Uberlebendzeit
(ILLS) bewertet.
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Dosis Verbindung mg/kg/Tag ILLS% Arabinosylcytosin 50 70 (Vergleichsversuch)
100 50 2,2'-Cyclocytidin- 100 70 3'5'-diphosphat 300 150 5-Br-2,2'-Cyclocytidin-
100 60 3'5'-diphosphat 300 120 5-F-2,2'Cyclocytidin 100 80 3'5'-diphosphat 300 180