DE2262334A1 - Verfahren zur enzymisolierung - Google Patents

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FRANKFURT (MAINL19-12.1972

Ajinomotö Co* $ Inc. ' ^:" ■ ■ ^r ■ " ^t■■·■"■"- ■ No. 6, 1-chome, Eyobashi, öhuo-ku, Tokyo, Japan

Verfahren zur Enzymisolierung

Die Erfindung "bezieht sich auf die Isolierung von mikrobiellen ß-Amylasen aus mikrobiellen Kulturmedien, die ß-Amylase enthalten.

Es ist bekannt, dass ß-Amylasen von Stärke nicht adsorbiert werden, d.h. dass 0. Holmbergh in "Biochemische Zeitschrift" 266, 203 (1933) berichtet hat, dass von einer Mischung von a-Amylase und ß-Amylase, die durch Extraktion aus Pflanzengewebe erhalten und einer Stärkelösung zugesetzt worden war, nur die a-Amylase durch Adsorption an Stärke isoliert wurde, die ß-Amylase dagegen aus der erhaltenen Lösung durch Aussalzen oder Lösungsmittelfällung gewonnen wurde.

Die konventionellen Isolierungsverfahren für ß-Amylase sind nicht nur sehr schwierig und komplex, sie erfordern auch kostspielige Agenzien.

Es wurde gefunden, dass mikrobielle ß-Amylasen doch an Stärke adsorbiert und in einfacher Weise aus wässrigen Lösungen, die mikrobielle ß-Amylase enthalten, isoliert werden können.

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ORlGHNAL INSPECTED

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Gemäss Erfindung wird Stärke zu einer wässrigen mikrobiellen ß-AmylaselÖsung, wie ioikrobi el lern Kulturmedium, das^ ß-Attylas« enthält, und zellfreier Flüssigkeit, die aus dem Kulturmedium erhalten wird, zugesetzt und die erhaltene Mischung bei verminderter Temperatur, vorzugsweise bei O bis 5⁰C, gerührt. Die wässrige ß-Amylaselösung kann durch eine mit Stärke gefüllte Kolonne hindurchgeführt werden. Die Adsorption der ß-Amylase an Stärke kann durch die Anwesenheit von 5 bis'15 % (Gewicht pro Volumen), vorzugsweise 7 bis Ίο % Ammoniumsulfat beschleunigt werden.

Die an Stärke adsorbierte ß-Amylase kann durch konventionelle Methoden isoliert, mit kühlem Wasser gewaschen und dann getrocknet werden, wobei man das Enzympulver erhält. '

Als Stärke können gemäss Erfindung Reisstärke, Gerstenstärke, Maisstärke (corn) und Kartoffelstärke benutzt werden, wobei man der Rohstärke von Reis den Vorzug gibt.

Das Enzympulver kann für die Verzuckerung von Stärke mit oder ohne weitere Additive, wie Trägermaterialien (carreer) oder Stabilisatoren, durch Zusatz zur Stärkelösung, so wie sie ist, benutzt werden. Wird das Enzympulver in verdünnter wässriger Ammoniumsulf at lösung 5 "bis 6o Minuten auf M-o bis 6o°0 erwärmt, bevor man die Verzuckerung durchführt, ist die ß-Amylaseaktivität der so erhaltenen Lösung sehr hah. Das Ammoniumsulfat liegt vorzugsweise in einer Konzentration von o,5 "bis 2 % vor.

Zur Herstellung ieiner ß-Amylase aus dem Enzympulver suspendiert man das Enzympulver 1o bis 6o Minuten in Wasser, entfernt die Stärke durch Zentrifugieren, dialysiert die erhaltene» Amylaselösung und isoliert das reine Enzym mittels einer der konventionellen Methoden für die Gewinnung von Enzym, wie Gefriertrocknung, Lösungsmittelfällung oder Aussalzen. Die Entfernung der Stärke lässt sich mit grösserer Effektivität in Gegenwart von o,5 his 2 °/o Ammoniumsulfat in der Suspension durchführen.

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Das -Verfahren:,de^,Erfindung lässt: sich :.auf alle . ß-Amy-lasen·.: anwenden.. Beispiele für §*fAmjlasea Mikroorganismen.umfassen?; Bacillus- po.lymys-a,ATGO--8583$ Bacillus megateriuin.3?ΕΕΪί P. 1:2o^l. und.Bacillus-iaegateriumFERIf ly

Die- ß-Amylase:$ktivität .lässt, -sieh an, der Anzahl. Milligranim Halt öse, die innerhalb einer Stunde gebildet; wird,, ablesen* wenn das Enzym "t>.ei^; 4o^D>C in■-, einer._;M/2p^: Pnpspliatpufierlo.sung fiiit o,5>?Oj.löslicher Starke lDei:.p.H .7,o-der- InliUbation unterworfen' wird. Die gebildete Menge Maltose wird nacn der Methode bestimmt.

5ooo ecm Kulturmedium,- das Joo E/.ccm·.- ß-Amylase von Bacillus polymyxa AICG 852J enthielt, wurden schnell auf 2⁰O abgekühlt (chilled) und durch eine Kolonne (Höhe 5 cm» Durchmesser 8pm), die mit roller" Kartoffelstärke gefüllt war, hindiirchgeführt. Die Kolonne wurde dann, mit ^o ecm kaltem Wasser gewaschen. Das Kulturmedium wies nach dem Durchlauf durch die Koloanne 1 q-, E/ccm Enzymalitivität-auf ..Die. Stärke, an der das Enzym adsorbiert war, ergab nach dem Gefriertrocknen 5o g Ä?bloses Enzympulver. o,1 g des Pulvers suspendierte man in Io ecm 1 %iger Ammoniumsulfatlösung, die man auf 4o°C hielt. Nach 3o Minuten enthielt die Suspension, wie gefunden wurde, 23oo E/ ecm ß-Amylase. Die Isolierung des Enzyms betrug 80 %.

Beispiel 2 " . - . . ...... 3ooo ecm Kulturmedium mit ß-Arnj^lase von Bacillus megaterium FEBM P-12o1 wurden schnell auf 2⁰O abgekühlt.,, dann durch eine mit roher Reisstärke gefüllten Kolonne (5 cm Höhe, 1o cm Durchmesser) hindurchgeleitet. Die Kolonne wurde dann mit 5o ecm kaltem Wasser gewaschen. Die Eiizymaktivität des Kulturmediums betrug 25o E/ccm und die der austretenden Flüssigkeit 2 E/ccm., Nach Gefriertrocknung des an der Stärke adsorbierten Enzyms erhielt man 8o g eines weissen trockenen Pulvers. ο,Ί g dieses Pulvers suspendierte man in "i/^igea? Ammoniumsulf at lösung und . hielt sie bei 4o°0. Wach 3o Minuten betrug die Enzymaktivität der Suspension 8oo E/ccm.Die Isolierung dec Enzyms war 8§/oig.

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Beispiel 3

75 g Anunoniumsulfat wurden zu 15oo ecm Kulturmedium von Bacillus megaterium FEEM P-12o2 mit $2o E/ccm ß-Amylase gegeben, die erhaltene Lösung auf 2⁰O gekühlt und 4o g rohe Reisstärke zugesetzt. Die Mischung rührte man massig 3 Stunden, filtrierte die Stärke ab und wusch sie mit kaltem Wasser von O⁰C, Das Filtrat wies, wie gefunden wurde, 5,7 E/ccm Enzymaktivität auf. Die Stärke suspendierte man in 4oo ecm 1%iger Ammoniumsulfatlösung, rührte die Suspension 3o Minuten "bei A-O⁰O, filtrierte die Festsubstanzen ab und iialysierte das Filtrat, um das Ammoniumsulfat zu entfernen und zurückgebliebene Maltose in M/1oo Phosphatpufferlösung (pH 7)· Die dialysierte Lösung ergab nach Gefriertrocknung 1,3 g Enzympulver, das 1o1 ooo E/g ß-Amylase enthielt. Die Isolierung war 3o%ig.

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Claims (7)

1. Verfahren zur Isolierung von mikrobiellec ß-Amylase aus wässriger Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige, mikrobielle ß-Amylase enthaltende Lösung so lange mit Stärke in Berührung "bringt, bis die Adsorption von ß-Amylase an die Stärke beendet ist, und dann die an der Stärke adsorbierte ß-Amylase isoliert.
2. 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als wässrige mikrobielle ß-Amylaselösung ein Kulturmedium verwendet wird, das bei der Kultivierung eines Stammes des Genus Bacillus erhalten wird, der die Fähigkeit hat, ß-Amylase zu produzieren.
3. 3) Verfahren nach Anspruch Λ oder 2, dadurch gekennzeichnet,dass als wässrige mikrobielle ß-Amylaselösung ein. Kulturmedium verwendet wird, das bei der Kultivierung uer Stämme Bacillus polymyxa ATOC 8532, Bacillus megaterium I¹ERM P-1201 oder Bacillus megaterium IERH P-1202 erhalten worden ist.
4. 4) Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3» dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige mikrobielle ß-Amylaselösung mit Stärke in Gegenwart von 5 bis 15 % (Gew.pro Volumen) Ammoniumsulfat in Berührung gebracht wird.
5. 5) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die an Stärke adsorbierte ß-Amylase in Wasser, das gegebenenfalls 0,5 bis 2 °/o Ammoniumsulf at enthält, suspendiert und nach Entfernung der Stärke aus der Suspension die ß-Amylase isoliert wird.
6. 6) Verfahren zur Verzuckerung von Stärke mittels an Stärke adsorbierter ß-Amylase, dadurch gekennzeichnet, dass die an Stärke adsorbierte β—Amylase vor Gebrauch in verdünnter Ammoniumsulfatlösung erwärmt wird.
7. 7) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete verdünnte Ammoniumsulfatlösung eine Ammoniumsulfatkonzentration von 0,5 bis 2 % aufweist.

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