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Arzneimittel mit koronarerweiternder Wirkung und Verfahren z.vm Isolieren
des als Wirkstoff vorliagenden Meurchormons, Die vorliegende Erfindung bezieht sich
auf ein Arzneimittel mit koronarerweiternder Wirkung und ein Verfahren zur Isolierung
eines Neurohormons aus dem Rindehypothalamus.
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Es ist bekannt, dass der Hypothalamus von Rindern bio ligische Wirkstoffe
von hormoneller Natur, wie Oxytozin, Vase pressin, die sogenannten hypophysotropen
Hormone, sowie Neu.ro hormone enthält welche zwei niedermolekulare, thermostabile
Verbindungen darstellen, die von neurosekretorischen Hypothalamuskernen erzeugt
werden und die aus dem Hypothalamus auf dem parhypophysären Weg in den Kreislauf
gelangen, ohne die Adenohypophyse zu passieren.
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Eine dieser Verbindungen, die Neurohermen "K" genannt wurde, enthält
Aminosäuren - Glycin, Serin, Asparagin- tmd Glutaminsäure und eine im Ultraviolett
absorbierende Verbindung mit Nukleotid-Charakter, hat eine kennzeichnende Spektralabsorption
im Ultraviolettbereich, besitzt saure Eigenschaften, bewegt sich bei der Papierelektrophorese
bei 3.000 Volt im Citratpuffer bei pH von 3,8 in Richtung der Anode, wird
durch
semipermeable Membranen dialysiert, verliert die biologische Wirksamkeit bei alkalischer
Behandlung und Hydrolyse in 6n HCl während 24 Stunden bei einer Temperatur von 1050
C, zeigt einen bedeutenden Verlust der biologischen Wirksamkeit bei der Behandlung
mit Pepsin und Trypsin. Diese Verbindung tritt bei Gelfiltration an Sephadex G-10
und G-25 nach allen bekannten niedermolekularen Verbindungen aus; der Rf-Wert bei
der Papierchromatographie beträgt 0,35 in einem Lösungsmittel, Butanol-Essigsäure-Wasser,
in einem Verhältnis von 4': 1 : 5.
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Eine andere Verbindung, die Neurohormon "S" genannt wurde, stellt
eine thermostabile, wasserlösliche Verbindung dar, die semipermeable Membranen durchdringt,
saure Eigenschaften besitzt, sich bei der Papieralektrophorese bei 3.000 Volt im
Citratpuffcr bei pH von 3,8 in Richtung der Anode langsamer bewegt, als di) vorher
erwähnte Verbindung. Der Rf-Wert bi der Papierchromatographie beträgt 0,15 mit Lösungsmittel
Butanol-Bssigsäue-Wasser in einem Verhältnis von 4 : 1 : 5, die Verbindung verliert
nicht die biologische Wirksamkeit bei der Hydrolyse in 6r HC1 während 24 Stunden
bei einer Temperatur von 1050 c, verliert nicht die biologische Wirksamkeit bei
der Behandlung mit Pepsin und Trypsin. Bei der Gelfiltration auf Sephadex G-10 und
G-25 tritt die genannte Verbindung nach der oben erwähnten aus; sie besitzt kein
kennzeichnendes Spektrum.
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Die genannten Neurohormone besitzen eine koronarerweiternde Wirkung
uld werden in der Medizin als Arzneimittel verwendet.
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Das Arzneimittel von koronarerweiternder Wirkung enthält erfindngsgemäss
als Wirkstoff das Neurohormon des Hypothalamus des Rindes, welches eine niedermolekulare
thermostabile wasserlösliche Verbindung darstellt, die semipermeable
Membranen
durchdringt, saure Eigenschaften besitzt, sich bei der Papierelektrophorese bei
3.000 Volt im Citratpuffer bei pH von 3,8 in Richtung der Anode bewegt, einen Rf-Wert
bei der Papierc-hromatographie von 0,15 im Lösungsmittel Butanol-Essigsäure-l.'asser
in einem Verhältnis von 4 : 1 : 5 hat. Es verliert nicht die biologische Wirksamkeit
bei der Hydrolyse in 6n HCl während 24 Stunden bei einer Temperatur von 1050 C,
verliert nicht die biologische Wirksamkeit bei der Behandlung mit Pepsin und Trypsin.
Bei der Filtration durch Molekularsiebe von 200 - 400 Maschen tritt es als letzte
Fraktion aus und zeigt kein kennzeichnendes Spektrum.
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Das erfindungsgemässe Präparat ist indiziert bei akutem Myokardinfarkt,
Angina pectoris, bei chronischer Koronarinsuffizienz. Der Wirkstoff.des Arzneimittels
- das Neurohormon- wiril iri den neurosektretorischen Hypothalamuskernen gebildet,
gelangt in den Gesamtkreislauf und wird durch das Herz transportiert, indem es lockere
Bindungen mit Albuminen und Gammaglobulinen des Blutserums eingeht. Das Neurohormon
übt eine direkte Wirkung auf die Koronargefässe aus.
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Wird es intravenös Tieren in einer Dosis von 1 - 2 p g/kg Körpergewicht
injiziert, so erweitert das Neurohormon die Koronargefässe in 3 - 5 Minuten. In
einer Stunde beträgt die Blutmenge, welche von den venösen Herzgefässen in einer
Zeiteinheit abfliesst, 200 - 300 5o' im Vergleich zum Ausgangswert. Dieser Effekt
hält 3 - 6 Stunden an. Nach der Hypophysenektomie behält das Präparat den koronarerweiternden
Effekt völlig bei. Das bewist, dass die Hypophyse am Zustandekommen der koronarorweiternden
Wirkung des Präparates nicht beteiligt ist.
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Nach der Nebennierenektomie verschwindet der Effekt des Präparats.
Das beweist, dass unter den Bedingungen des intakten
Organismus
die Nebenniere eine wichtige Rolle in der Realisation des Effekts des Präparats
spielt.
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Unter physiologischen und pathologischen Bedingungen wird das Neurohormon
aus dem Hypothalamus ins Blut unter dem Einfluss von chemischen Faktoren des Pankreas
und des Herzens ausgeschieden. Wenn diese chemischen Stoffe ins Blut gelangen, reizen
die Chemorezeptoren des Sinus carotiens, was über cholinoreaktive Hirnsysteme zur
Ausscheidung des Neurohormons aus dem Hypothalamus ins Blut führt.
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Auf diese Weise wurde der Weg der chemischen Regulation der Herzdurchblutung
durch ilypothalamusneurohormone nachgewiesen.
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Synthetische Präparate, welche in der Klinik als koronarerweiternde
Mittel Anwendung finden, stehen dem Neurohormon in allen Daten nach.
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Das Neurohormon ist nicht toxisch, selbst wenn Mäusen 100 - 700 und
mehr biologisch wirksame Dosen verabreicht werden. Es übt keinen Einfluss auf den
Blutdruck aus. Die minimale koronarerweiternde Dosis beträgt 1 - 2 g/kg. Die bekannten
koronarerweiternden Mittel werden in einer um das 100- und 1.000-fache höheren Dosierung
angewendet. Das Neurohormon übt eine spezifische Wirkung auf den Koronarkreislauf
aus; es ist ein natürlicher chemischer Regulator des Koronarkreislaufs.
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Das Neurohormon erweitert ziemlich schnell die Herzgefässe, trägt
zur Öffnung aller Herzanastomosen bei und ist ein ausserordentlich wirksames Mittel
zur Behandlung des Myokardlnfarkts und anderer Erkrankungen der Herzgefässe.
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Das Arzneimittel von koronarerweiternder Wirkung wurde in den Kliniken
an 60 Kranken mit Nyokardinfarkt, Angina pectoris und chronischer Koronarinsuffizienz
geprilft.
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Das Präparat wurde den Kranken durch intravenöse Iajektion verabreicht.
Es wurde den Kranken in einer Menge von je 30 - 40 g g Substanz inform von steriler
Lösung im Gemisch mit bidestilliertem Wasser und physiologischer Lösung injiziert.
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Nach einer Stunde wurde das Verschwinden von Schmerzen im Herzbereich,
die Druckstabilisation, die Normalisierung der Herzfrequenz und die Verbesserung
des Elektrokardioramms nachgewiesen.
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Das erfindungsgemässe Präparat kann inform von Pulver, Tabletten
und Injektionslösungen verwendet werden.
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DAs Arzeipräparat enthält erfindungsgemäss den Wirkstoff in Kombination
mit einem pharmazeutischen Lösungsmittel; es ist zweckmässig als letzteres ein Gemisch
von bidestilliertem Wasser und physiologischer Lösung oder Glukoselösung zu verwenden.
Der Gehalt der Lösung an Wirkstoff beträgt 0,qOol2 -O,0016 Gewichtsprozent. Diese
Verzbrteichungsform des erfin-.
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durgsgemässen Präparats ist am meisten vorzuziehen. Das Präparat wird
in Flaschen hergestellt, welche je 5 ml steriler Präparatlösung in doppelt destilliertem
Wasser enthalten. Die Lösung wird vor der Anwendung mit physiologischer Lösung oder
Glukose gemischt und intravenös eingeführt. Das Präparat löst keine Nebenerscheinungen
aus. Es gibt keine Kontraindikationen zur Anwendung des Präparats.
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Als Erfindung wird auch das Verfahren zur Isolierung des Neurohormons
aus dem Hypothalalamus von Rindern - des Nirkstoffes des Arzneimittels von koronarerweiternder
Wirkung -ange sehen.
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Das Verfahren zur Isolierung der genannten Neurohormone wurde in
der Literatur nicht beschrieben.
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Erfindungsgemässf bestcht das Verfahren zur Isolierung des Neurohormons
aus dem Hypothalamus von Rindern darin, dass man den Hypothelamus der Rinder mit
0,25 - 0,5 &-iger Essigsaure während 20 - 30 Minuten etPtrahiert, den Extrakt
zentrifugiert, danach bochnoilckulare Verbindungen mit organischen Lösungsmitteln
fällt, das zurückgebliebene Gemisch von niedermolekularen Verbinduiagen lyophilisiert,
dann in destilliertem Wasser löst, diese Verbindungen durch Filtration ihrer Lösung
durch Molekularsiebe von 200 - 400 Maschen abtrennt, die zwei erhaltenen Fraktionen
von niedermolekularen Verbindungen mit destilliertem Wasser oder mit 0,25 - 0,5
t-i.ger Essigsäure eluiert und durch lyophilisieren trocknet, wobei man aus der
letzten Fraktion das Endprodukt erhält. Die Extraktion mit der Essigsäurelösung,
ist vorzugsweise bei einer Temperatur von 80 - 850 C durchzuführen.
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Es ist zweckmässig, das Zentrfugieren bei 8.000 -10.000 g durchzuführen.
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Als organische Lösungsmittel verwendet man vorzugsweise Äthanol und
Chloroform.
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Als Molekularsiebe werden zweckmässig Sephadex G-10 oder C-25 verwendet,
Das Verfahren wird folgenderweise durchgeführt: Rinderhypothalamus wird mit 0,25
- 0,5 %-iger Essigsäurelösung extrahiert. Das Verfahren kann bei Zimmertemperatur,
vorzugsweise unter Erwähnen auf eine Temperatur von 80 -8rO C durchgeführt werden.
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Die Extraktion wird w1lrend 20 - 30 Minuten durchgeführt, nachher
wird der Extrakt bei 8.000 - 10.000 g zentrifugiert.
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Aus dem erhaltenen Gemisch werden hochmolekulare Verbindungen durcli
Fällung mit organischen Lösungsmitteln, z.B.
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äthanol, dann mit Chloroform entfernt. Das zurückgebliebene Gemisch
von niedermolekularen Verbindungen wird lyophilisiert, dann in destilliertem Wasser
gelöst und durch ein Molekularsieb, z.B. Sephadex G-10 oder G-25 geleitet, um von
zwei Fraktionen niedermolekularer Verbindungen, die anschliessend durch Elution
mit Wasser oder mit 0,25 - 0,5 %-iger Essigsäure gewonnen werden, zu isolieren.
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Die erhaltenen Fraktionen niedermolekularer Verbindungen werden durch
lyophilisieren getrocknet. Aus der letzten Fraktion wird das Endprodukt erhalten.
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Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird folgendes
Beispiel für die Durchführung des Verfahrens zur Isolierung des Neurohormons aus
Rinderhypothalamus angeführt.
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Beispiel.
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In einen Glashomogenisator werden 1 kg Hypbthalamus und 5 1. 0,25.5'e-iger
Essigsäure eingebracht und während 20 - 30 Minuten homogenisiert.
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Dann wird das Gemisch zur Entfernung von Bruchstücken, Kernen usw.
zentrifugiert. Zur Flüssigkeit über dem Niederschlag wird Alkohol von 960 in einem
Verhältnis. von 1 : 3 zugegeben. Es wird während 2 Stunden geschüttelt und im KühlsohranI
über Nacht stehengelassen. Man zentrifugiert nachher, entfernt hochmolekulare Verbindungen
und giesst Chloroform zur'Flüssigkeit über dem Niederschlag in einem Verhältnis
von 1 : 3 zu.
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Man mischt während 60 Minuten. Nachher lässt man es im Kühlschrank
über Nacht stehen. An der Grenze von Chloroform und
Wasser wird
ein Film gebildet. Die obere Schicht wird dekantiert, durch Lyophilisieren getrocknet.
Dabei erhält man 1,5 - 2g pulverförmige niedermolekulare Verbindungen. Durch eine
Säule der Abmessung 5 x 50 cm gefüllt mit Sephadex G-10 oder G-25 werden 3 g des
erhaltenen vorher in 10 - 20 ml destilliertem Wasser gelösten Pulvers geleitet.
Die Abtrennung erfolgt während 24 Stunden. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 100
ml/Stunde. Alle 30 Minuten werden je 50 ml gesammelt. Aus 3 g Pulver werden 100
-120 pg Neurohormone "K" und "S" erhalten.
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Die Austrittsstellen von zwei koronarerweiternden Neurohormonen werden
nach der biologischen Methode bestimmt - es wird die Blutmenge bestimmt, welche
aus dem venösen Sinus des Herzens der Katze pro Zeiteinheit nach der intravenösen
Injektion der eluierten Fraktionen abfliesst.
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Patentansprüche