DE2241470A1

DE2241470A1 - Arzneimittel mit antivirus-wirksamkeit

Info

Publication number: DE2241470A1
Application number: DE19722241470
Authority: DE
Inventors: Zlatka Petkova Dipl Dimtscheva; Angel Simeonov Galabov; Lubomir Michajlov Shindarov; Duschka Staneva Stojtscheva; Georgi Nikolov Vassilev; Radka Taneva Dipl Ch Vassileva; Emilia Christova Velitschkova
Original assignee: MIDIZINSKA AKADEMIA
Current assignee: MIDIZINSKA AKADEMIA
Priority date: 1971-08-23
Filing date: 1972-08-23
Publication date: 1973-03-22
Also published as: GB1408198A; FR2150834B1; FR2150834A1; JPS4828609A

Description

Arzneimittel -mit Antivirus-Wirksamkeit (Priorität: 23. August 197", Bulgarien, Nr. 17 294)

Die Erfindung bezieht sich auf die Vervrendung von Thioharnstoffderivaten der allgemeinen Formel I

Cz-H^NHCSN ^/ I

als Wirkstoff für Arzneimittel.. In dieser Formel bedeuten R ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, R¹ eine niedere Alkyl-, Allyl-, fi-Hydroxyathyl·? ß-Aminoäthyl-',^-Aminohexylgruppe, einen Fettsäurerest, eine Methoxyphenyl-j Chlorphenyl-, Phenyl-, Benzyl-, Tolyl-, Hydroxyphenyl-, Carboxyphenyl-, Chinolyl-, Carboxyhydroxyphenyl-, Hydroxynitrophenyl-, Nitrophenyl-, Hydroxychlorphenyl-, Chlornitrophenyl-, Phenylthioharnstoffhexyl-, Trimethylphenyl-, Methylchlorphenyl-, Pyridyl-, Acetyljjhenyl-, Acetylaminophenyl-, Dimethylaminophenyl-, Aminopyridyl-, Phenylthioureidopyridyl-, Phenylthioureidonaphthyl-, Aminonaphthyl-, Chlorphenylthioureidophenyl-, Furfuryl-, Dichlorphenyl, Allylthioureidophenyl-Gruppe oder einen ähnlichen Rest. ·

Das Auffinden von Substanzen mit ausgeprägter antivireller Ak- ,

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tivität ist eine Hauptaufgabe der raoderenen Virologie, soweit es die Prophylaxe und insbesondere die Behandlung von Virus-Infektionskrankheiten betrifft.

Die Antivirus-3igenschaften der Thioharnstoffderivate und der strukturell mit diesen verwandten Thiocarbanilide . wurden zuerst durch Bu.u-Hoi nachgewiesen. Bei der Durchführung von Tests an Mäusen zeigten diese Substanzen eine gewisse Wirkung auf den Typ A/PR8 des Influenzavirus. Girard et al. fanden, daß bestimmte Di.thiobiuretderivate Mäuse schützen konnten, die mit Poliovirus 2 inokuliert waren. Gut bekannt für ihre beträchtliche antivirelle Aktivität sind außerdem die N-Methylisatin-ß-thiosemicarbazonderivate, die breite Anwendung zur Prophylaxe von Windpocken gefunden haben.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, aktive antivirell wirksame Substanzen aufzufinden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die vorstehend bezeichneten Verbindungen dor Formel I als Wirkstoff verwendet werden. Eine große Anzahl der durch die allgemeine Formel I bezeichneten Verbindungen wurde bereits in herbiziden Zubereitungen verwendet. Es wurde nun unerwarteterweise gefunden-, daß diese Thioharnstoffderivate hohe Antivirus-Aktivität gegenüber Picornaviren (Polio, Coxsackie A und B, Echo-Virus und dem Virus der Maul- und Klauenseuche (FWD)) zeigen.

Die inhibierende Wirkung auf die Vermehrung von Poliovirus 1, Coxsackievirus B1, Echovirus 19 und des Virus der Maul-und Klauenseuche wird auf 95,0 bis 99,9Jo geschätzt. Ausgeprägte antivirelle Aktivität wird auch festgestellt, wenn die genannten Thioharnstoffderivate auf experimentelle Infektionen mit Coxsackie A6, A7, B1 und B3 angewendet werden, sowie auf experimentelle Maul- und Klauenseuche. Die erfindungsgemäß verwendeten Thioharnstoffderivate werden in Dosen von 40 bis 200 mg/kg bei hohen Werten des Selektivitätsindex (über 5) an-

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gewendet (akute Toxizi-tät 400 bis 1000 mg/kg).

Die erfindungsgemäß als Wirkstoff vorliegende! Thioharnstoffderivate werden nach einem bekannten Verfahren aus Phenylisothio cyanat und dem entsprechenden Amin unter Verwendung eines orga nischen Lösungsmittels als Medium hergestellt. Dieses Verfahren verläuft nach folgendem Reaktionsschema:

C₆H₅NCS+HNRR'— j. CgH

worin R. und R¹ die bereits genannte Bedeutung haben.

Die antivirelle Aktivität■der Thioharnstoffderivate wird an den folgenden Picornaviren geprüft: Poliovirus 1, Coxsackievirus B 1 , Echovirus 19 und Typ C des Maul- und Klauenseuche-Virus. Es wird durch folgende Methoden geprüft.

1.) Durcn den Selektions-Gradienten-Plaque-Inhibitions-Test von Kucera und Herrmann, modifiziert durch das Viral Inhibitors¹ Laboratory of the Department of Virology, Postgraduate" Medical Institute, Sofia.

2.) Durch einstufige Virus-Wachstumscyclus-Versuche.

Der Gradienten-Plaque-Inhibitions-Test wird mit einschichtigen Zellkulturen in Povitzky-Flaschen durchgeführt (dabei werden FL-Zellen für Poliovirus 1, Coxsackievirus B1 und Echovirus 19, Kalbsnieren-Primärkulturen für das Virus der Maul- und Klauenseuche verwendet). Die einschichtigen Kulturen werden mit bis 300 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) des entsprechenden Virus inokuliert. Zwei Schichten einer Agar-Deckschicht werden in der Weise aufgelegt, daß ein Gradient in der Konzentration der zu prüfenden Substanz ausgebildet wird, die sich in der zweiten Schicht befindet. Nach 48-stündiger Inkubationsdauer wird der antivirelle Effekt durch das Vorliegen einer der toxischen Zone benachbarten Zone gemessen, die keine Plaques ent-• hält oder Plaques mit vermindertem Durchmesser enthält.

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Zur Durchführung der Einstufen-Viruswachstumscyclus-Versuche werden einschichtige Kulturen der vorstehend angegebenen Typen, die in Brosse-Flaschen angeordnet wurden, bei hoher Multiplizität der Infektion inokuliert (über 50 für Poliovirus 1, Coxsackievirus B1 und Echovirus 19 und über 20 für das Virus der Maul- und Klauenseuche). Die zu prüfenden Verbindungen, die in maximaler subtoxischer Konzentration angev/endet werden, werden in der KuItürlösung vorgelegt. Am Ende des Virus-Wachstumscyclus (8 bis 9 Stunden) und nach dreifachem Gefrieren und Auftauen wird die Virusausbeute in Gegenwart Jeder der zu prüfenden Verbindungen gemessen. Die prozentuale Inhibierung wird unter Verwendung einer Kontrollprobe zu Vergleichszwecken bestimmt .

Die Aktivität der erfindungsgemäß verwendeten Derivate in vivo wj.rd durch experimentelle Inokulation von neugeborenen Mäusen mit Hilfe von Coxsackievirus A wA B (bei einer Virusdosis von 5 bis 10 LDc₀ ^durch subkutane Inokulation], Typ C des Maul- und Klauenseuche-Virus (Maul- und Klauenseuche-Enzephalitis bei neugeborenen Mäusen)(Virusdosis 3 bis 50 LDkq bei subkutaner Inokulation) und mit Hilfe von Maul- und Klauenseuche-Virus bei Meerschweinchen (Virusdosis 5 bis 15 LDgQ durch Inokulation in die Pfoten) gezeigt. Die Verbindungen werden subkutan einmal täglich verabreicht und die Wirkung zur Bekämpfung der Infektion und auf den Verlauf der experimentellen Coxsackie- oder Maul- und Klauenseuche-Infektionen werden auf Basis der prozentualen Mortalität in den behandelten Tiergruppen im Vergleich zu der Placebogruppe bestimmt, sowie durch Messen der alternativen Ansprechzeit: ETcq (Link, 1968). Bei der Durchführung von Tests mit Meerschweinchen durch Inokulieren mit dem Virus der Maul- und Klauenseuche wird die Wirksamkeit der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen auf Basis des prozentualen Anteils der Tiere in der behandelten Tiergruppe, die Allgemeininfektion zeigen, in Vergleich mit der Placebogruppe, gezeigt.

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_ 5 —

Die Ergebnisse, die durch Prüfen der Antivirus-Aktivität einiger der erfindungsgemäßen Derivate gegenüber Poliovirus erhalten wurden, sind in Tabelle 1 angegeben.

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, ist die antivirelle Aktivität einiger der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen außerordentlich hoch. So inhibiert beispielsweise N-Phenyl-N'-4-carboxy-5-hydroxyphenylthioharnstoff bei der Verwendung in einer Konzentration von 40 /ig/ml 99,9250 der Virusausbeute und N-Phenyl-N'-3-hydroxypheny!thioharnstoff in einer Konzentration von 20jug/ml inhibiert die Virusausbeute zu 99,62%. Hohe Aktivität zeigen außerdem die folgenden Verbindungen: N-Phenyl-N'- 3-tolylthioharnstoff _r j^-Phenylthioureidobuttersäure, N-Phenyl-N⁵-acetylpheny!thioharnstoff und N-Phenyl-N'-2-carboxyphenylthioharnstoff, die 95-99/0 der Virusausbeute inhibieren.

Tabelle ? zeigt die Ergebnisse der Prüfung der Antivirus-Aktivität einiger Thioharnstoffderivate gegenüber Coxsackievirus B1. Ein hoher inhibierender Effekt wird erhalten, wenn N-Phenyl-N¹ -4-carboxy-5-hydroxyphenylthioharnstoff, N-Phenyl-N'-3-hydroxyphenylthioharnstoff, N-Phenyl-N-¹·-4-hydroxyphenylthioharnstoff und Ψ-Phenylthioureidobuttersäure verwendet werden. Die inhibierende . Wirkung wird zu 99»87?o der Virusausbeute ermi'ttelt.

Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse, die beim Prüfen der antiyirellen Aktivität einiger der erfindungsgemäß verwendeten'Thioharnstoffderivate gegenüber Echovirus 19 erhalten wurden.

Aus der Tabelle ist klar ersichtlich,, daß hohe antivirelle Aktivität (Inhibierung der Virusausbeute von mehr als 99%) bei folgenden Thioharnstoffderivaten festgestellt wird: N-Phenyl-N·- 4-carboxy-5-hydroxypheny!thioharnstoff, N-Phenyl-N'-3-hydroxy-' pheny!thioharnstoff, N-Phenyl-N»-2-carboxyphenylthioharnstoff und ^-Phenylthioureidobuttersäure. Merkliche antivirelle Eigenschaften werden auch bei N-Phenyl-N'^-hydroxy-S-nitrophenylthioharnstoff beobachtet (97,73?ό Inhibierung der Virus-

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ausbeute),

Ergebnisse die beim Prüfen der antivirellen Aktivität einiger/erfinäU'V-sgemäß verwendeter Thioharnstoffderivate auf das Virus der Maul- und Klauenseuche erhalten wurden, sind in Tabelle 4 angegeben.

Hohe Aktivität zeigen N-Phenyl-N'-A-hydroxyphenylthioharnstoff (99,65% Inhibierung der Virusausbeute) und N-Phenyl-N'-3-hydroxyphenylthioharnstoff (97,92$S-ige Inhibierung der Virusausbeute ).

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Tabelle 1

Wirkung von N-Phenyl-N'-alkylthioharnstoffimd N-Phenyl-N *-ary!thioharnstoffderivaten auf die Vermehrung von Poliovirus 1

Versuch Verbindung Nr.

Ergebnis Ergebnis von einstudes Gra- figen Viruswachstumsdientencyclus-Versuchen

hibierung

tests

7 C₆H₅NHCSNH 8 C₆H₅NHCSNH -

3,3x1O⁸ 67,00

5,2x10⁸ 48,00

17 C₆H₅NHCSNH

COOH

+++ 5,9x10' 95,09

20 C₆H₅NHCSNH -<_v /)-COOH ++ unter 1x10⁶ über 99,92

23 C₆H₅NHCSNH 24 C₆H₅NHCSNH

25 C₆H₅NHCSiJH v.

OH

7x10. 99,42

3,7x10⁸ 69,17

3,5x10⁸ 70,83

309817/1?36

Tabelle 1 (Fortsetzung)

29 C₆H₅NHCSNFICH₂CH₂Ch₂COOH ++

36 C₆H₅NHCSNH -

44 C₁

51 Cl

NHCSNHC₆H

₆H₅

NHCSNHC₆H₅

1,5x10 1,4x1O

4,3x10

98,75 98,79

4,6x10⁷ 96,17

57.00

Kontrollprobe

1,2χ1θ

PFU = Plaque - bildende Einheit

309817M23C

Tabelle 2

Wirkung von' Nr-Phenyl-N¹ -alkyl thioharnstoff derivaten und N-Plienyl-N' -ary!thioharnstoffderivaten auf die Vermehrung von Coxsackievirus B1

Versuch
Nr.

Verbindung Ergebnis Ergebnis von einstudes Gra- figen Viruswachstumsdientencyclus-Versuchen .

tests

20 C₆H₅NHCSNH -,

COOH

DH

23 C₆H₅IiHCSNH -4 j)

)H

24 C₆H₅NHCSNH -/ Λ- OH

25 C₆H₅NHCSNH -

OH 29 C₆H₅NHCSImCH₂CH₂CH₂COOH

1x10

1x1O

99,87

99,37

+++ *. 1x10° > 99,87

++ 4,6x1O⁷ 93,87

99,87

Kontrollprobe 7,5x10

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Tabelle

Wirkung von II-Phenyl-N'-alky!thioharnstoffderivaten und N-Phenyl-N¹-arylthioharnstoffderivaten auf die Vermehrung von Echovirus 19

Versuch Verbindung Nr.

Ergebnis Ergebnis von einstudes Gra- figen Viruswachsturas dienten- cyclus-Versuchen

tests

% - InVii-

17 C₆H₅NHCSNH

20 C₆H₅NHCSNH

23 C₆H₅MHCSlJH -

25 C₆H₅NHCSNH

0OH

COOH

Or

29 C₆H₅NHCSNHCH₂CH₂Ch₂COOH 5x10"

2x10'

.7

++ 5,9x10

5x10⁶

99, ei

>99,96

99,92

97,73

99,81

Kontrollprobe

2,6x1O⁹

3098

224H70

-11-Tabelle 4

Wirkung von N-Phenyl-N'-alkylthioharnstoffderivaten und N-Phenyl-N¹-ary!thioharnstoffderivaten auf die Vermehrung des Typs C von Maul- und Klauenseuchevirus

Ver- '

such Verbindung Nr.

^tlons"
tests

23 C₆H₅NHCSNH -£ \

)H

24 C₆H₅KTiCSNH -/ \-

1,5x10-

97,92

++ . 2,5x10 99,65

Kontrollprobe

7,2x10^v

30981?/123e

224U70

f «

N-Phenyl-N'-4-carboxy-5-hydroxypheny!thioharnstoff (20) und N-Phenyl-N'-3-hydroxypheny!thioharnstoff (23) zeigen ausgeprägte Antivirus-Aktivität, wenn sie an experimentell mit Coxsackievirus B1, B3, A6 und A7 (3-10 LDc₀) infizierten neugeborenen Mäusen geprüft werden. Der Verlauf der Infektion ist um 2 bis 3 Tage verzögert und es kann beobachtet werden, daß 50 bis 70# der geprüften Tiere überleben. Die EDc₀-OoSiS der Verbindung Nr. 20 beträgt 43t3 mg/kg und die der Verbindung 23 beträgt 86,6 mg/kg. Beide Verbindungen werden einmal täglich während eines Zeitraums beginnend 48 Stunden vor der Virusinokulation über den gesamten Verlauf der Krankheit hinweg subkutan appliziert«

Bei der experimentellen Infektion neugeborener Mäuse (Virusdosis 5 bis 10 LDc₀) führte die täg?4iche Verabreichung von 86,6 mg/kg N-Phenyl-N^f-4-hydroxypheny!thioharnstoff nach dem vorstehend angegebenen Schema zum überleben von 84,6 bis 100$ der behandelten Tiere, während die prozentuale Mortalität in der Placebogruppe. 90 bis 100# betrug. Verbindung Nr. 23t verabreicht in einer Dosis von 173t2 mg/kg (akute Toxixität 1000,0 mg/kg) verhindert die Entwicklung einer Maul- und Klauenseuche-Enzephalitis bei 33»3# der Tiere, die mit einer Virusdosis von 10 LDc₀ inokuliert waren (verglichen mit einer 100#-igen Mortalität in der Placebogruppe).

In Fällen einer experimentellen Maul- und Klauenseuche bei Meerschweinchen (5 bis 15 LDc₀) vermindert die Verbindung Nr. 24, wenn sie in einer Dosis von 40 bis 60 mg/kg täglich während einer Dauer beginnend 48 Stunden vor der Virus-Inokulation bis 5 Tage nach der Inokulation verabreicht wird, die Anzahl der erkrankten Tiere um das zwei- bis dreieinhalbfache , verglichen mit der Placebogruppe (Signifikanzwert ρ weniger als 0,01, ρ < 0,01 ).

Bei der Prüfung der akuten Toxizität an Mäusen und Ratten wurden für Verbindung Nr. 20 die folgenden LD_5Q-¥erte bestimmt

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(ausgewertet nach der Pershiai-Hethode): Für Mäuse: 55Q»1 mg/kg (intraperitoneale Verabreichung) und mehr als 1QOO,0 mg/kg (subkutane Verabreichung);. bei Ratten: 733,6.- mg/kg, (intraperi-...-toneale Verabreichung). Es. ist ersichtlich, daß, diese Verbindung einen hohen Selektivitätsindex besitzt (LDrq/ED,-q ^ 23).

Bei der Ermittlung der subakuten Toxizität von" Verbindung Nr. 2Ö* bei Ratten, wobei diese Substanz intraperitoneal in Tagesdosen ' von 200 mg/kg während einer Dauer von 30 Tagen verabreicht wurde , wurden keine" Veränderungen des Ällgemeinzustands und des Verhaltens der Tiere , noch des Gewichts oder des Blutbilds und dergleichen beobachtet. Es wurde kein teratogener Effekt festgestellt, wenn trächtige weibliche Ratten mit Verbindung Nr.20 behandelt wurden (intraperitoneal, Tagesdosis 100 mg/kg).

Die erfindungsgemäß als Wirkstoffe für Arzneimittel vorliegenden Verbindungen können in-Pulverform, in Form von Körnern, in Form wässeriger oder anderer Suspensionen,- in Form von Emulsionen unter Verwendung eines geeigneten Emulgators oder in anderer Form verwendet werden. ■ · "

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Claims

224 U70 Patentansprüche

1. Antivirus-Mittel, dadurch gekennzeichnet·, daß es als Wirkstoff ein Thioharnstoffderivat der allgemeinen Formel

° ° \ R¹

aufweist, in der R ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe und R¹ eine niedere Alkyl-, Allyl-, ß-Hydroxyäthyl-, ß-Aminoäthyl-, a/-Aminohexylgruppe, einen Fettsäurerest, eine Methoxyphenyl-, Chlorphenyl-, Phenyl-, Benzyl-, Tolyl-, Hydroxyphenyl-, Carboxyphenyl-, Chinolyl-, Carboxyhydroxyphenyl-, Hydroxynitrophenyl-, Nitrophenyl-, Hydroxychlorphenyl-, Chlornitrophenyl-, Phenylthioureidohexyl-, Trimethylphenyl-, Methylchlorphenyl-, Pyridyl-, Acetylphenyl-, Acetylaminophenyl-, Dirnethylaminophenyl-, Phenylthioureidopyridyl-, Phenylthioureidonaphthyl-, Aminonaphthyl-,Chlorphenylthioureidophenyl-, Furfuryl-, Dichlorphenyl- oder Allylthioureidophenylgruppe bedeutet.

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