DE2218162A1 - Entzündungshemmende Mittel - Google Patents

Entzündungshemmende Mittel

Info

Publication number
DE2218162A1
DE2218162A1 DE19722218162 DE2218162A DE2218162A1 DE 2218162 A1 DE2218162 A1 DE 2218162A1 DE 19722218162 DE19722218162 DE 19722218162 DE 2218162 A DE2218162 A DE 2218162A DE 2218162 A1 DE2218162 A1 DE 2218162A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
protease
cellulose
group
proteases
molecular weight
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE19722218162
Other languages
English (en)
Inventor
Setsuro Dr.med. ToVaishima; Otsuka Masatomi Naruto Tokushima; Osaki Yoshiyasu Ishii Miyozai Tokushima; Fujii (Japan). P
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Otsuka Kagaku Yakuhin KK
Original Assignee
Otsuka Kagaku Yakuhin KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Otsuka Kagaku Yakuhin KK filed Critical Otsuka Kagaku Yakuhin KK
Publication of DE2218162A1 publication Critical patent/DE2218162A1/de
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

76-18.633P 11. *. 1972
OTSUKA KAOAKU YAKUHIN KABUSHIKI KAISHA, Osaka-»hi (Japan)
Entzündungshemmende Mittel
Sie Erfindung bezieht eich auf ein anti-inflaminator!aches bzw. entzündungshemmendes Mittel mit einem SehaIt an einer spezifisch modifizierten Protease als wirksamem Bestandteil.
Bs iat allgemein bekannt, da3 Proteasen eine entzündungshemmende Wirksamkeit besitzen, jedoch können Proteasen nicht in ausreichenden Dosen zur Herbeiführung befriedigender antiinflammatorischer Wirksamkeiten angewandt werden, da sie gleichzeitig erheblich störende Nebenwirkungen zeigen. So wird beispielsweise bei lokaler Verabreichung der Protease der Antikörper gebildet und bei oraler Verabreichung wird die Schleimhaut de3 Darms infolge der hohen proteolytischen Aktivität gereizt.
76-(OKS 23 case B) ' HoHe
20*8457-1181-
Von den Erfindern wurden zahlreiche Untersuchungen über die Hemmung beim durch Karrageenin (carrageenin) verursachten ödem unter Verwendung unter3chiedlicher Proteasen in intraperitonealer Verabreichung (der z.Zt. üblichsten Verabreichungsart) durchgeführt, wobei gefunden wurde, daß zwar jede der Proteasen eine merkliche Hemmwirkung auf daa ödem ausübte, erhöhte Dosen zur Verbesserung der Wirksamkeit jedoch Blutungen in der Bauchhöhle oder Ascites verursachten.
Das besagt, daß alle Proteasen in nur begrenzten zulässigen Doeen verabreicht werden müssen, um derartige störenden Nebenwirkungen zu verhindern. Eine solche Tendenz wurde bei unterschiedlichen Proteasen gefunden. Beispiele für die Proteasen sind Trypsin, Chymotrypsin u.dgl. als Proteasen tierischen Ursprungs, Bromelin, Papain u.dgl. als Proteasen pflanzlichen Ursprungs und Proteasen, die von Mikroorganismen nie Streptomyces griseus, Bacillus subtilis, Aspergillus malleus, Aspergillus niger und anderen Bakterien der Genua Serratia und Genua Bacillus erhalten werden.
Ziel der Erfindung ist demgemäß ein anti-inflammatorisch wirksames Mittel mit einem Gehalt an einer modifizierten Protease, die zwar die entzündungshemmende Wirksamkeit beibehält, jedoch praktisch keine störenden Nebenwirkungen zeigt, selbst wenn sie in ausreichenden Dosen zur Herbeiführung einer zufriedenstellenden anti-infiommatorischen Aktivität verabreicht wird. Weiteres Ziel ist eine aati-inflammatorisch wirksame Zusammensetzung, die ohne irgendwelche störenden Nebenwirkungen oral und lokal verabreicht werden kann.
Das zu diesem Zweck entwickelte erfindungagemäße entzündungshemmende Mittel 1st gekennzeichnet durch eine anti-
2098*5/ MS1
inflammatoriseh wirksame'Menge einer wasserunlöslichen modifizierten Protease, die durch chemische Bindung einer Protease an eine hochmolekulare Substanz mit einem Molekulargewicht von zumindest.10 000 erhalten worden ist sowie übliche Arzneihilf estoffe.
Bislang wurde als wesentlich angesehen, daß die Proteasen, um anti-inflammatorisch wirksam zu sein, eine hohe proteolytische Wirksamkeit und Wasserlöslichkeit besitzen müßten. Darauf geht beispielsweise die Annahme zurück, daß eine durch Abwandlung wasserunlöslich gemachte Protease keinerlei antiinf lammatorische Wirkung bei oraler oder lokaler Verabreichung zeigen sollte, da eine solche modifizierte Protease eine außerordentlich niedrige oder gar keine proteolytische Aktivität besitzt und nicht mehr vom Darm aufgenommen wird.
Untersuchungen der Erfinder haben jedoch gezeigt, daß unter Erzeugung wasserunlöslicher modifizierter Proteasen chemisch an hochmolekulare Substanzen gebundene Proteasen mit weit geringerer proteolytischer Aktivität als die ursprünglichen Proteasen noch eine ausreichende anti-inflammatorische Aktivität beibehalten und völlig frei von störenden Nebenwirkungen 3ind.
Der Grund, warum die obigen Ergebnisse mit einer solchen modifizierten Protease erhalten werden können, konnte noch nicht restlos geklärt werden, jedoch wird angenommen, daß die esterolytische Aktivität der Proteasen durch die Modifizierung nicht so außerordentlich vermindert wird wie die prcteolytische Aktivität und daß die entzündungshemmende Wirkung durch die estarolytische Aktivität der Proteasen b-3 stimmt wird und auch entfaltet werden kann, wenri die Sub- · stanz vjasserunlöslich iat,
§ÄD ORIGINAL ·
2G9845/1iei
» Δ, ·™
Darüber hinaus kann die modifizierte Protease gemäß der Erfindung ohne irgendwelche störenden Nebenwirkungen oral oder lokal verabreicht werden, da 3ie infolge der Wasserunlöslichkeit vom Darm nicht leicht aufgenommen wird und infolge der geringen proteolytischen Aktivität weder die Schleimhaut merklich reizt, noch Antikörpersubatanzen erzeugt.
Zu erfindungsgeiüäß zu modifizierenden Proteasen gehören unterschiedliche Proteasen, die von Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen erhalten werden. Beispiele für Proteasen tierischen Ursprungs sind Trypsin, Pepsin, Chymotrypsin, Pancreatin etc.} Proteasen pflanzlichen Ursprungs sind Bromelin, Papain, etc.} und Proteasen von Mikroorganismen sind solche von Fadenpilzen, Basidiomyceten, Bakterien, Strahlenpilzen usw.
Von Padenpilzen erhaltene Proteasen sind beispielsweise solche vom Aepergillus melleus, Aspergillus oryzae, Penlcillium notatum, Hhizopus chinensis, Mucor racemosus, etc. Proteasen von Basidiomyceten aind solche von Trametes sanguines, Ilodella subpileata, etc. Proteasen von Bakterien aind solche vom Bacillus subtilis, Pseudomonas myxogenes, etc. Proteasen von Strahlenpilzen sind solche von Streptomyces griseus, Streptomyces fradiase, etc.
Von diesen Proteasen werden Chymotrypsin, Trypsin und Proteasen vom Bacillus subtilis und Aspergillus melleus bevorzugt.
Gemäß der Erfindung verwendete hochmolekulare Substanzen sind solche mit einem Molekulargewicht von zumindest 10 000, vorzugsweise 20 000 bis 200 000 und zu ihnen gehören beispiels-
weise 1) Aminosäurepolymere mit einer Haupt- oder Gerüst--. kette mit wiederkehrenden Peptidbindungen&
2) Polysaccharide?
3) Polyaminostyrole und
4) Copolymere von Äthylen und Maleinsäure bzw. Maleinsäureanhydrid. . " . -
Von diesen werden Aminosäurepolymere und Polysaccharide besonders bevorzugt.
Bevorzugte Beispiele für Aminosäurepolymere sind Copolymere von I-Leucin und p-Amino-DL-phenyl'alanins Polymere von N-Garboxy-^-methyl-glutaminsäureanhydrid, Polymere von N-Carboxy-jr-methyl-tyrosin-anhydridj Polymere von'N-Carboxytyrosin-anhydrid etc. Es können Substanzen verwendet werden^ die während der Reaktion mit der Protaase obige Polymere bilden wie N-Carboxy-^-methyl-glutaMinsäuraanhyörid, K-Carbozy-/-methyl-tyrosin-anhydridj N-Carbosy-tyroain-snhydria. etc„
Bevorzugte Polysaccharid® sind beiepi©lsy©iB© GelIuIqas und Cellulosederivate wie Biäthylaaiaoäthylcellulo-s©-, Garbosymethylcellulos®, p«-Aminob®asylc©llwloü®9 ai=-lminoanisol-=o©llu= lose, m-Aminobenzioylosymethylöislliilosfο 3-(p-Amino-=m=»m®thgrl~ anilino-S-chlorJ-i-triacetyno-cslluloseis, Garboxymethylcallu·= · loseazid, Cyanurcellulose, Bromacetylcellulose, Gsllulos©- citrat etc. ,sowie Dextran und Dextranderivate-, ^i® Diätfejiaminoäthyldextran,, Carboxymethyldesrfeg'asi od©r Heaktionsprodukte von Dextran und Isocyanat»
Ton diesen hochmolekularen Substanzen werden solch®9 di© mit Proteasen unter Bildung kov@lsnte£ odes ionische? Bindungen und Erzeugung wasserunlöslicher /Pro tea sen ".--Iy aw9 Protease-
/-1181
modifikate gemäß der Erfindung reagieren können, für die Modifizierung der Proteasen so, wie sie sind, verwendet.
So können beispielsweise Carboxymethylcelluloseazid, Cyanurcellulose, Bromaeetylcellulose, Reaktionsprodukte von Dextran und Isocyanat etc. mit der Protease umgesetzt werden und mit dieser unter Bildung von wasserunlöslichem Proteasemodifikat eine kovalente Bindung eingehen.
Ferner können Produkte mit Carboxylgruppen oder Diäthylaminoäthylgruppen im Molekül mit Protease umgesetzt und an diese durch lonen'oindung unter Bildung wasserunlöslicher Protease gebunden werden.
Kochmolekulare Substanzen, die nicht mit Proteasen unter Bildung wasserunlöslicher Proteasemodifikate reagieren, werden nach Eintührung protesae-reaktiver Gruppen wie -NsN, -H^i=S','0001, -NCNH, »NvO, -CN, Halogen oder einer Anionencdar Xationenaustauachgruppe in herkömmlicher Weise mit Proteasen umgesetzt. So kann beispielsweise eine Nali-Bindung o4*r -Gruppa ir: eine hochmolekulare Substanz mit Aminogruppe durch Diazo iier-sn in bekannter Weise eingeführt werden. Weiter können -A"»NaX ,-CCCl, -NCIiU, -JSCO oder -CN in das Molekül einer hoc;;&:"', eäularen Substanz mit Carboxylgruppen durch deren Umsexsung- &v; /dien, Dcloriden, Carbodiimide!!, Isocyanaten, Cy&nider. {cyanes' etc. in herkömmlicher Weise eingeführt werden, KalogenatCEe könnet; Ir. Moleküle von hociiaiolekularen Substanzen mit Hydroxylgruppen, Carboxylgruppen uaw. in herkömmlicher Weise eingeführt werden. Anionen- oder KationenauBtäuscbgruppen können darin ebenfalls in herkömmlicher Weise gebildet «erden.
209845/1181
Die Proteasemodifizierung mit den obigen hochmolekularen Substanzen ist dem Fachmann bekannt und gemäß der Erfindung kann eine solche Modifizierung in herkömmlicher 'Weise ausgeführt werden. So wird beispielsweise die Modifizierung der
+ Protease mit einer hochmolekularen Substanz mit N=N-Gruppen im Molekül durch Kopplung derselben mit der Protease erreicht. Diese Reaktion wird beispielsweise in "Naturwiss»" Bd. 4O-, (1953) S. 508 von Ii. Grubhof er u.a.} in "J. Biol. Chem." Bd. £37 (1962) S. 1832 von A.N. Glazer u.a.? in der US-PS 3 167 485 von E. Katchalskij in "Biochemistry" Bd.^ (1964) S. 1913 von L. Goldstein u.a. und in "Biochem. J." Bd. 95, Nr. 3 (1965) S. 45-46 von Ι,ί. Dilly u.a. beschrieben. Hochmolekulare Substanzen mit -N-, -COGl, -NGNH, -NGO oder -CN im Molekül werden mit der Protease durch Umsetzung solcher Gruppen mit Aminogruppen der Protease unter Erzeugung modifizierter Protease chemisch gebunden. Diese Art der Modifizierung wird beispielsweise in "Seventeenth Collection of Lecture at Enzyme Chemistry Symposium", P 21 (1965) von Toru Takami u.a. (abgehalten in Tokushima-ken, Japan)5 in der japanischen Patent-Publikation Nr. 27492/1964 von Jiro Kirimura u.a. und in "Biochemistry" Bd. 2» (1964) S. 1905 von Y. Lerin u.a. beschrieben.
Die Proteaee kann auch durch Umsetzung mit hochmolekularen Substanzen mit Halogenatomen, im Molekül modifiziert werden. Diese Modifizierungsmethode wird beispielsweise in "J. Am. Ghem. Soc," Bd. j69_ (1947) S. 1551 von R.B. Woodward u.a. und in "J. Biol. Chem.» Bd. 236 (I961) S. 1720 von J.J. Cebra u.a. angegeben. Modifizierte Protease kann auch durch Bindung von Proteasen an hochmolekulare Substanzen mit Anionen- oder Kationenaustauachgruppen in herkömmlicher Weise hergestellt werden. Dafür wird beispielsweise eine wässrige
2SS84S/1131
Lösung der Protease zur Modifizierung durch eine Ionenaustauacherharzschicht geschickt. Dieae3 Verfahren wird beispielsweise in "J. Am. Ohem. Hoc." 3d £M_ (1959) S. 4024 von M.A. Mitz u.a. beschrieben.
Die resultierende wasserunlösliche modifizierte Protease wird von nicht umgesetzter Protease, hochmolekularer Substanz und ggf. vorhandenen anderen wasserlöslichen Substanzen beispielsweise durch Waschen des Reaktionsproduktes mit physiologischer Salzlösung, bis das Waschwa3ser keine (positive) Finhydrinreaktion mehr zeigt, nachfolgendos Waschen mit Wasser zur Entfernung von NaGl und abschließendes Trocknen getrennt. Das Waschen des Produktes kann mit wässriger Lösung anderer wasserlöslicher Metallsalze wie Natriumacetat oder mit Wasser seibat vorgenommen werden.
Gemäß der Erfindung wird die wasserunlösliche modifizierte Protease als wirksamer Bestandteil einer anti-inflanmatorisehen Zusammensetzung verwendet, da nur eine solche modifizierte Protease entzündungshemmende Wirkungen zeigt, die völlig frei von stö.renden Nebenwirkungen sind. Wenn die modifizierte Protease wasserlöslich ist, zeigt sie unerwünschte Störwirkungen infolge der Absorption im Barm, so daß' das Ziel der Erfindung nicht erreicht werden Kann.
Die wasserunlösliche modifizierte Proteasewird zur Verabreichung als ariti-inflaninatoriaches Mittel durch übliche Verfahren in unterschiedliche Formen gebracht. So können beispielsweise Tabletten, Granalien oder Pulver in üblicher ffoise hergestellt werden. Alternativ können Salben zubereitet werden. Abhängig von der Praparatform kann die modifizierte Protease intraperitoneel, oral oder loka] verabreicht werden.
Es folgen Beispiele zur Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1
1 g oC-Chymotrypsinkristalle wurde in 100 ml 0,05 molarer Natriumacetatlösung gelöst und der pH-Wert der Löaung auf 7,3 eingestellt. Zu der lösung wurde-tropfenweise unter Rühren eine auf 20C abgekühlte Lösung von 4 g N-Carboxy-$*-methyl-L-glutaminsäureanhydrid in 40 ml Dioxan hinzugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 20G gerührt und 20 Stunden lang bei 40C stehengelassen. Die gebildete Ausscheidung wurde durch Zentrifugieren mit 20 000 Upm bei O0G .abgetrennt und mit 0,05 molarer Natriumacetatlösung gewaschen. Der keine (positive) Mnhydrinreaktion zeigende gewaschene Niederschlag wurde zur Bildung von 2,1 g Poly-Z-methyl-l-glutamyl-cC-chymctrypein in Form eines weißen Pulvers gefriergetrocknet. Das Produkt war wasserunlöslich und enthielt 19,1 Gew.-^ an N-Garboxy-Z-methyl-L-glutaminsäureanhydrid gebundenes «^-Chymotrypsin.
Die esteroiytische Aktivität des resultierenden Produktes gegenüber N-Acetyl-L-tyrocin-äthylester war auf das 0,15-i'ache des als Ausgangsiaaterial dienenden c*-Chymotry.psins vermindert. Ke ergibt sich somit aus dem Gehalt an Chymotrypsin im Produkt, daß 78,6 $> dor Aktivität wiedererhalten wurden.
Das so erhaltene Poly-^-mathyl-L-glutamyl-o^-chymotrypsin bzw. das ala Ausgangsmaterial verwendete cXHChyuotrypsin nurdon jeweils in 5 »1 physiologischer Salzlösung in einsr zur Erzeugung einer saterolytischen Aktivität von .300 raM/min gegenüber N-lcetyl-L-tyrosin-äthyleoter nach der Heaterin-Möthode itusreiehoriden Mange dispergiert, wodurch eine Probe (-1)
mit Auagangsprotease und eine Probe (II) mit der resultierenden wasserunlöslichen Protease erhalten wurden.
Beide Proben wurden Ratten in einer Bo3is von 5 ml/kg intraperitoneal verabreicht. In 30 Minuten wurden 0,05 ml 1 #iges Karrageenin subkutan in die Sohle der Hinterpfote jeder Ratte injiziert. Die Volumenzunahme der Hinterpfote wurde zur Bestimmung der ödemhommwirkung 3 Stunden apäter gemessen, wobei die in der nachfolgenden Tabelle 1 angegebenen Werte erhalten wurden. Tabelle 1 zeigt außerdem zu Vergleichszwecken ("Kontrolle") Versuchsergebnisse, die in gleicher V/eise wie oben, aber lediglich unter Verwendung physiologischer Salzlösung erhalten wurden.
Tabelle 1
Probe Ödeminhibition Resultat der Autopsy
I 62 i»
II 65 i»
Kontrolle 0
BeLBj)LaI 2
31utung beobachtet
keine Veränderung festgestellt
5 el einer vom Bacillus sp 0 - 20 (hinterlegt beim ritation Research Inatitute of Agency of industrial Solenne and Technology, Japan, seit 20.2.'9ί9ί Kinterle N'r. "i3P;.I -P 270) erhaltener, Protease warden in 4,5 ml 0,1 awLarara Bi'VvJ:fV.i£sr rait υ,ϋ! M QaC2.. .uit :;ir;diü pli-'A'ji-t von 8,0 e^l.st.
BAD
Die in diesem Beispiel verwendete Protease hatte eine proteolytische Aktivität von 4 000 000 PE/g (als eine Einheit enzymatischer Aktivität wird diejenige Aktivität der nicht-proteinioche Substanz erzeugende Protease bezeichnet, die Folinfarbe (folin colour) entsprechend 1 fTyrosin in 1 Minute zeigt). Zu der Lösung wurde 1 ml Succinylanhydrid gelöst in 0,5 ml Dioxan hinzugegeben und die Mischung 30 Minuten lang gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde mit 0,005 M CaCIp einen Tag lang dialysiert und die dialysierte Substanz wurde an "DEAE-Sephadex" (Warenzeichen für Diäthylamlnoäthyl-dextran der Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) absorbiert, der mit 0s01 molarem Boratpuffer mit 0,05 M NaCl2 von pH 8,0 gepuffert und in eine Säule gefüllt werden war. Das resultierende Produkt wurde mit physiologischer Salzlösung gewaechen, bis die Waschflüssigkeit weder enzymatische Aktivität noch (eine positive) Ninhydrinreakticn zeigte. Das Produkt wurde weiter mit Wasser mit 0,001 M CaCl2 zur Entfernung des Natriumchlorids gewaechen und bei. 40C im Vakuum getrocknet, wodurch eine wasserunlösliche modifizierte Protease in Form eines weiüen Pulvers erhalten mirde. Die in der resultierenden modifizierten Protease gebundene Protease betrug 6
Dio Ausgangsprotease und die modifizierte Protease wurden hinsichtlich der preteolytisehen und esterolytischen Aktivität wie folgt miteinander verglichen. Die «sterolytische Aktivität wurde in Werten ausgedrückt, die ernalten werden, wonn die einzelnen Proteasen in einer für eine proteolytische Aktivität von 100 erforderlichen Menge angewandt werden.
Tabelle 2
Protease proteolytische
Aktivität bei
Casein *
Ausgangsp'rotease 100
modifizierte Protease 100
esterolytische Aktivität gegenüber N-Acetyl-L-tyrosinäthylester **
100 1 500
Bemerkungi * Casein-Folin-liethode ** Hesterin-Methode
Die Ausgangsprotease bzw. die modifizierte Protease wurden in 5 ml physiologischer Salzlösung und zwar in solcher Menge diepergiert, daß eine esterolytische Aktivität gegenüber Acetyl-tyrosinäthylester von 500 mM/min nach der Hesterinllethode erhalten wurde, wodurch die Proben (III) und (IV) erhalten wurden.
Die Ödemhemmwirkung dieaer Proben wurde in gleicher Weiee wie in Beispiel 1 geprüft, wobei die in der nachfolgenden Tabelle 3 angegebenen Werte erhalten wurden.
Tabelle 3
Probe Ödeminhibition
III
IY		 71 *
70 <
Resultat Autopey
Blutung beobachtet
keine Veränderung festgestellt
208845/1181
Beiapiel 3
"Nagaae" (Warenzeichen für eine vom BacillUB aubtilia erhaltene Proteaae, Produkt der Ifagase Sangyo Co., Ltd., Osaka, Japan) wurde succinyliert und an "DEAE-Sephadex" (wie in Beispiel 2) adsorbiert zur Erzeugung von wasserunlöslicher modifizierter Protease in gleicher Weise wie in Beispiel 2.
Die proteolytische Aktivität gegenüber Casein und die eeterolytische Aktivität gegenüber N-Acetyl-L-tyrosin-äthylester der modifizierten Protease waren auf ein 1/10 bzw. 8/10 derjenigen der Auagangsprotease vermindert.
Die Auagangsproteaae bzw. die resultierende modifizierte Protease wurden in gleicher Weise wie in Beiapiel 1 zu physiologischer Salzlösung hinzugegeben unter Bildung der Proben V und VI, die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 geprüft wurden. Dabei wurden die in Tabelle 4 angegebenen Ergebnisse erzielt.
Tabelle 4 Resultat der Autopsy
Probe ödeminhibition Blutung beobachtet
keine Veränderung fest
gestellt
V
VI		 63 *
. 62 *
20984S/1181
-H-
Beispiel 4
In 75 ml 1/15-molarem Acetatpuffer mit 0,01 LI Galciumacetat und einem pH-Wert von 7,2 wurden bei 40G 481 j"-Protease mit einer proteolytischen Aktivität gegenüber Casein von 4 000 000 PE/g gelöst, die vom Bacillus sp 0 - 20 (gleicher wie in Beispiel 2) erhalten worden war. Zu der Lösung wurden langsam unter Rühren 4 mg N-Carboxy-Z-methyl-L-tyrosin-anhydrid gelöst in 30 ml Dioxan hinzugegeben und die Oberfläche der Mischung mit einer geringen Menge Toluol abgedeckt. Danach wurde die Mischung 20 Stunden bei 40G stehengelassen und die erzeugte Ausscheidung mit 10 000 Upm bei O0C abzentrifugiert zur Erzielung von wasserunlöslicher modifizierter Protease. Die enzymatischen Aktivitäten von Ausgangsprotease und resultierender modifizierter Protease sind in Tabelle 5 wiedergegeben, in der die esterolytische Aktivität in V/erten angegeben ist, die bei Verwendung der einzelnen Proteasen in der für eine proteolytische Aktivität von 100 erforderlichen Menge erhalten wurden.
Tabelle 5
esterolytische Akti-
Protease
äthylester
Ausgangsprotease 100 100
modifizierte Protease 100 1 570
Die Ausgangsproteasebzw. die modifizierte Protease wurden jeweils zu 5 ml physiologischer Salzlösung in solcher Menge hinzugegeben, daß eine esterolytiache Aktivität gegenüber N-Acetyl-L-tyrosinäthylester von 300 m M/min nach der Heste- *
209845/1181
rin-Methode festgestellt wurde, wodurch die Proben VII und VIII erhalten wurden.
Die ödemhemiawirkung der einzelnen Proben wurde in gleicher Weige wie in Beispiel 1 geprüft, wodurch die in der nachfolgenden Tabelle 6 enthaltenen Ergebnisse erhalten wurden.
Tabelle 6 Resultat der Autopsy
Probe Ödeminhibition Blutung beobachtet
keine Veränderung fest-
VII
VIII 		53 5*
54 #
gestellt
Beispiel 5
1 g Trypsin wurde in 0,1 molarem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,6 und einem Gehalt von 50 (Jew.-# HgSO-, (containing 50 wt. i* HgSO4J gelöst. Zu 40 ml der resultierenden
Lösung wurden langsam unter Rühren bei 40C 800 mg N-Carboxy-L-tyrosin-anhydrid, gelöst in 18 ml Dioxan hinzugegeben und die Mischung 16 Stunden lang bei 4°C stehengelassen. Die' so gebildete Ausscheidung wurde durch Zentrifugieren mit 10 üpm bei 40C abgetrennt. Das resultierende Produkt wurde mit physiologischer Salzlösung gewaschen, bis die Waschflüssigkeit (positive) Ninhydrinreaktion zeigte uni β*! wurde dann zur Entfernung von Natriumchlorid mit Wasser nachgewaschen. Das ausgewaschene Produkt wurde gefriergetrocknet, wodurch 775 Eg wasserunlösliche modifizierte Protease in Form von Pulver erhalten wurden. Das in der modifizierten Protease gebundene Trypsin betrug 10,4 #
2CS845/1181
Unter Verwendung der Ausgangsprotease (Trypsin) bzw. der modifizierten Protease wurden Proben IX und X in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt. Die Henunwirkung der einzelnen Proben wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 geprüft. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 7 wiedergegegeben.
Tabelle 7
Probe Ödeminhibition Resultat der Autopsy
IX 54 $ Blutung beobachtet
X 54 $> keine Veränderung
festgestellt
209845/1181

Claims (6)

Patentansprüche
1. Anti-inflammatorisches Mittel, gekennzeichnet durch eine anti-inflammatorisch wirksame Menge einer wasserunlöslichen modifizierten Protease, die durch chemische Bindung einer Protease an eine hochmolekulare Substanz mit einem Molekulargewicht von zumindest 10 000 aus der Gruppe der Aminosäurepolymeren mit einer Hauptkette mit wiederkehrenden Peptidbindungen, Polysaccharide, Polyaminostyrole und Gopolymeren von Äthylen und Maleinsäure oder Maleinsäureanhydrid erhalten worden ist sowie übliche Arzneihilfsstoffe.
2. Anti-inflammatorisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die hochmolekulare Substanz ein Aminosäurepolymeres mit einer Hauptkette mit wiederkehrenden Peptidbindungen, insbesondere aus der Gruppe der Copolymeren von L-Ieucin und p-Amino-Dl-phenylalanin, Polymeren von N-Carboxy-j*-methyl-glutaminsäureanhydrid, Polymeren von N-Carboxy-^T-methyl-tyrosin-anhydrid und Polymeren von N-Garboxytyroain-anhydrid ist.
3. Anti-inflammatorieches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die hochmolekulare Substanz ein PoIysaccharid vorzugsweise aus der Gruppe der Cellulose und Cellulosederivate wie insbesondere Diäthylaminoäthylcelluloee, Carboxymethylcellulose, p-Aminobenzylcellulose, m-Aminoanisolcellulose, m-Aminobenzoyloxymethylcellulose, 3-(p-Aminom-methylanilino-5-chlor)-1-triacetynocellulose, Carboxymethyl· celluloseazid, Cyanurcellulose, Bromacetylcellulose und Cellulosecitrat ist.
209845/1181
4. Anti-inflammatorisches Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid zu der durch Dextran und Dextranderivate gebildeten Gruppe gehört, wobei als Dextranderivate Diäthylaminoäthyldextran, Garboxymethyldextran und ein Reaktionaprodukt von Dextran und Iaocyanat bevorzugt werden.
5. Anti-inflaminatoriaches Mittel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Protease in die Gruppe Trypsin, Pepsin, Chymotrypsin und Pancreatin oder Bromelin und Papain oder in die Gruppe der von Mikroorganismen wie Aspergillus aelleus, Aspergillua oryzae, Penicillium notatum, Hhizopus chinensia, Mucor racemosus, Trametes sanguinea, Llodella subpileata, Bacillus subtilis, Pseudomonas myxogenes, Streptomyces griseus und Streptomyces fradiase erhaltenen Proteasen gehört.
6. Anti-inflammatorisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease der Gruppe Chymotrypsin, Bromelin und Proteasen vom Bacillus subtilia oder Aapergillus melleus angehört.·
209845/1181
DE19722218162 1971-04-14 1972-04-14 Entzündungshemmende Mittel Pending DE2218162A1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2400571A JPS5443074B1 (de) 1971-04-14 1971-04-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE2218162A1 true DE2218162A1 (de) 1972-11-02

Family

ID=12126433

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19722218162 Pending DE2218162A1 (de) 1971-04-14 1972-04-14 Entzündungshemmende Mittel

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JPS5443074B1 (de)
DE (1) DE2218162A1 (de)
GB (1) GB1390542A (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0045285A1 (de) * 1980-07-01 1982-02-03 Etablissement TEXCONTOR Nichtadsorbierbare, mukolytische Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und therapeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen als Wirkstoff enthalten
DE3315482A1 (de) * 1982-04-30 1984-01-12 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo Mittel zur verhinderung und behandlung von blutlipid-abnormalitaet und/oder arteriosclerose
WO2014037438A1 (en) * 2012-09-05 2014-03-13 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ277766B6 (en) * 1990-01-04 1993-04-14 Vnii Textilno Biologically active material and process for preparing thereof
GB0123232D0 (en) * 2001-09-26 2001-11-21 Smith & Nephew Polymers
DE10321725A1 (de) * 2003-05-14 2004-12-02 Mucos Pharma Gmbh & Co Enzymhaltige Zusammensetzungen, daraus hergestellte diätetische Lebensmittel und Arzneimittel und ihre Verwendung für medizinische Zwecke
US7998476B2 (en) 2006-11-22 2011-08-16 Standard Biologics, Inc. Method of treatment using Aspergillus oryzae protease
EP2234594A4 (de) 2007-12-19 2013-01-16 Elc Man Llc Zusammensetzungen und verfahren zur hautbehandlung mit extrakten aus trameten
CN114224980A (zh) * 2020-09-08 2022-03-25 上海市同仁医院 一种外用涂抹组合物

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0045285A1 (de) * 1980-07-01 1982-02-03 Etablissement TEXCONTOR Nichtadsorbierbare, mukolytische Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und therapeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen als Wirkstoff enthalten
DE3315482A1 (de) * 1982-04-30 1984-01-12 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo Mittel zur verhinderung und behandlung von blutlipid-abnormalitaet und/oder arteriosclerose
WO2014037438A1 (en) * 2012-09-05 2014-03-13 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity

Also Published As

Publication number Publication date
GB1390542A (en) 1975-04-16
JPS5443074B1 (de) 1979-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0003616B1 (de) Neue Aminozucker-Derivate, ihre Herstellung und Amylase-hemmende Mittel
DE2643800C2 (de) Verfahren zur Herstellung von Xylose durch enzymatische Hydrolyse von Xylanen
DE2347782C3 (de) Aminozuckerderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel
US3969540A (en) Enzymatically prepared metal proteinates
DE2064092A1 (de) Inhibitoren für Glykosidhydrolasen aus Actinomyceten
DE1944048C3 (de) Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Enzymsystems
DE2646879A1 (de) Matrix aus einem in wasser unloeslichen beta-1,3-glucangel und verfahren zu ihrer herstellung
DE2218162A1 (de) Entzündungshemmende Mittel
DE1943490A1 (de) Enzymatisch aktives Addukt und Verfahren zu seiner Herstellung
DE2659808C3 (de) Proteingebundene Polysaccharide und deren Verwendung zur Bekämpfung von Tumoren
DE2209834C3 (de) Herstellung von Saccharase-Inhibitoren
US3932618A (en) Anti-inflammatory compositions
DE3124429A1 (de) Proteolytisches mittel fuer proteinhydrolysen
CH628218A5 (de) Verfahren zur herstellung eines suessungsmittels.
DE2417265A1 (de) Traegergebundene enzyme
DE2614393B2 (de) Aminozucker-Derivate und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel
DE1948298A1 (de) Stabile,Polymer-Enzym-Verbindungen enthaltende Mundhygiene-Mittel
DE2828933A1 (de) 3- eckige klammer auf (s)-1&#39;-phenylaethylamino eckige klammer zu -propylaminobleomycin, verfahren zu seiner herstellung und diese verbindung enthaltendes arzneimittel
JPH01146900A (ja) 鉄含量が高い可溶性ポリペプチド誘導体とその製法及びこれを含有する製薬組成物
EP0499306A1 (de) Stärken mit verbessertem Aroma
JP2777825B2 (ja) 酵素処理セルロース及びその製造法
DE2634904A1 (de) Neue immunologische adjuvantien, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel
DE2209833C3 (de) Herstellung eines Amylaseinhibitors
DE2209832C3 (de) Herstellung von Saccharaseinhibitoren
DE19907726A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Eiweißhydrolysaten