DE2163018C3 - Verfahren zur Herstellung von L-Lysin - Google Patents

Description

Zur Herstellung von L-Lysin durch Hydrolyse von A-Amino-e-caprolactam sind zwei Verfahren bekannt: Ein chemisches (HeIv. Chim. Act. 41,1958,181 - 188), bei dem das L-Lactam mit verdünnter Salzsäure hydrolysiert wird, und ein Mikrobiologisches (US-PS 30 56 729), bei dem die Ausbeule an L-Lysin, ausgehend von DL-rt-Amino-f-caprolactam, jedoch höchstens 36% beträgt.

Aus der DL-PS 2b 767 ist es weiterhin bekannt, D-Amino-e-caprolactam auf chemischem Wege mit Hilfe von Natriumhydroxid zu racemisieren. Da aber Mikroorganismen und Enzyme gegen Chemikalien und pH-Veränderungen anfällig sind, ist es nicht möglich, diese chemische Racemisierung mit einer mikrobiologischen Hydrolyse ohne Zwischenisolierung des Racemisierungsproduktes zu kombinieren.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand somit darin, auf möglichst einfache Weise, d. h. ohne Isolierung von Zwischenprodukten, und in möglichst hoher Ausbeute und Reinheit L-Lysin aus D- oder DLix-Amino-e-caprolactam zu erhalten. Λ-Aminot-caprolactam wird nachfolgend als »Aminolactam« bezeichnet.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von L-Lysin aus D- oder DL-Aminolactam unter Hydrolyse mittels eines Mikroorganismus oder Enzyms mit L-Aminolactam hydrolysierender Aktivität ist dadurch gekennzeichnet, daß man das Aminolactam in

Gegenwart des Mikroorganismus oder Enzyms mit L-Aminolactam hydrolysierender Aktivität mit einem das Aminolactam racemisierenden Mikroorganismus der Arten Achromobacter cycloclastes, Achromobacter obae, Flavobacterium arborescens und/oder Alcaligenes faecalis oder mit von diesen Mikroorganismen gebildeter Aminolactamracemase behandelt. In diesem Verfahren braucht das Racemisierungsprodukt vor der Hydrolyse nicht isoliert oder vom Reakiionsmedium abgetrennt zu werden, so daß beide Verfahrensstufen

gleichzeitig oder nacheinander im gleichen Reaktionsmedium durchgeführt werden können.

Die Bakterienstämme, die nach der Erfindung zur Racemisierung verwendet werden können, können unter den Stämmen der Arten ausgewählt werden, /u denen die Bakterienproben FERM-P 772, 776, 777, 778, 780 und IAM 1013 gehören (»FERM-P« ist eine Hinterlegungsnummer bei dem »Fermentation Research Institut« des Ministeriums für internationalen Handel und Industrie in Tokyo).

Die Stämme FERM-P 772 und 780 erwiesen sich als Achromobacter cycloclastes, der Stamm FERM-P 777 als Flavobacterium arborescens, der Stamm FERM-P 778 als Alcaligenes faecalis und der Stamm FERM-P 776 als eine neue Spezies mit der Bezeichnung Achromobacterobaesp.nov. Fukumura(1971).

Tabelle I
Bezeichnung

Mikroskopische
Beobachtungen
(1) Zellform

(2) Gramfärbung

Kultlirbeobachtungen

(1) Kolonien auf Bouillon-

Agar-Platten

1. Wachstum

2. Form

3. Qualität

4. Farbe und
Transparenz

Achromobacter cycloclastes

IAM 1013 IHRM-P

FERM-P 780

Achromobacter obae sp. nov. FERM-P 776

Stäbchen,
1,0 · (1.8-2,0) u.
Bewegungsfähig
durch Wimpergeißeln
negativ

mäßig

kreisförmig oder
unregelmäßig,
wellig, buckelig

schimmernd,
buttcrartii:

Stäbchen, 0,8 · (1,5-3,2) μ.

Aktiv bewegungsfähig durch Wimpergeißeln

kreisförmig, unversehrt, konvex, glati

schimmernil ki eisförmig, unversehrt, konvex, glatt

schimmernd, butlerartig

nicht pigmcntbildend. weißlich lcderfarben. durcnscheinend mil op;.kein Zentrum

^ortscl/ung

(2) Sirichkultur auf geeigneten ßouillonirägern
1. Wachstum

2. Farbe

	Ammoniak
	lndol
	Schwefelwasserstoff
	Acetoin
	Katalase
3. Bouillon-Agar-	Urease
Versuch	Nitrite
4. Gelatineversuch	Lauicmusmilch
5. Bouillonbrühe	Gelatineplatte
6. Kartoffel	Stärke
[11. Wachstumsbedingungen	Zuckerfermentation
IV. Physiologische	Lackmus
Eigenschaften
(Ο
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(H)
(12)

(13) L-Lysin-Verwertung

(14) D- und L-Aminolactam-Verwertung

V. Quelle
Tabelle Il

ΙΛΜ K)Ii

ι |_<M.|> ₇₇_7 ITRM-I' 7HO

mäßig, fadenförmig mäßig, fadenförmig, mäßig, fadenförmig,

glatt

nicht pigmentbildenct, weißlich lederl'arben, durchscheinend etwas schleimig

nicht pigmentbildend, durchscheinend,
schimmernd

Achromobucter i)biic sp. nov. FKHM-I' 77b

mäßig, fadenförmig, etwas sich ausbreitend

nicht pigmentbildend, leicht gräulich braun mitteldunkel

Oberflächenwachstum, Nagelkopfwachstum

Oberflächenwachstum, keine Verflüssigung

leicht trüb, Häutchenbildung Sediment von Häutchen

nicht pigmentbildend, leicht gräulich- nicht pigmenlbildend, leicht graubraun, gesteigertes Wachstum, Kartoffel gelbiichbraun, etwas sich ausbreitend, gedunkelt Kartoffel gedunkelt

gutes Wachstum bei 30 C, gutes Wachstum bei pH 7,0 — 7,5, aerob, wahlweise

merklich gebildet

negativ

gebildet

leicht alkalisch nach 8 Tagen, keine

anderen feststellbaren Veränderungen

Bezeichnung	Flavobacterium	arbor-
	esccns FERM-I	> 777
I. Mikroskopische
Beobachtungen
(1) Zellform	Stäbchen, 0,7	■ 1.7 μ.
	keine Geißel.	nicht be-
	wegiingsfähig
(2) Gramfärbung	negativ·
II. Kullurbeobachtungcn
(1) Kolonien auf O 'Π α Λ » »»·
Bouillon-Agar-
Platten
1. Wachstum	mall in

gebildet nicht gebildet gebildet nicht gebildet positiv positiv

merklich aus Nitraten gebildet alkalisch nach zwei oder drei Tagen, keine anderen feststellbaren Veränderungen

keine Verflüssigung

nicht hydrolysiert

es bildet sich weder Säure noch Gas aus Glucose, Galactose, Rohrzucker,

Maltose und Lactose

nicht reduziert in Zuckerfernienialions- leicht reduziert in Zuckerfermen-

medicn tationsmedien

wird als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle verwertet wird als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle verwertet

isoliert aus Frdreich

55

(IO

Bezeichnung	Flavobacterium arbor-
	ebccns FERM-P 777
2. Form	kreisförmig, unversehrt,
	buckelig
3. Qualität	butterariig
4. Farbe	weißlich-gelb, wird gelb
	opak, schimmernd
(2) Strichkultur auf ge
eigneten Bouillon-
triigern
1. Wachstum	mäßig, fadenförmig
2. Farbe	weißlich-gelb, wird gelb.
	opak, schimmernd
3. Bouillon-Agar-	Oberflächen wachstum.
Versuch	N «Igel kopf wachst um

Fortsetzung

liL'/l'k'lllMlllL'

4. Gcliitinevcrsuch

5. Bouillonbrühe
Kartoffel

III. Wachstumsbedingungen

JV. Physiologische Eigenschaften

(1) Ammoniak

(2) Indol

(3) Schwefelwasserstoff

(4) Acctoin

(5) Katalyse

(6) Urease

(7) Nitrite

(8) Lackmusmilch

cscoits ITiUM-I¹ 777

schichtförmige Verflüssigung mit gelbem Sediment

Irüb, gelbes Sediment, keine Häutchen reichliches Wachstum, feuchte und glatte Oberfläche, gelblich-braune Farbe, Kartoffeln werden gedunkelt

gutes Wachstum bei 30⁰C, gutes Wachstum bei pH 7,0-7,5, aerob, wahlweise

(9) Gelatineplatte

(10) Stärke

(11) Zuckerfermentation

(12) Lackmus

(13) L-Lysin-Vcrwertung

(14) D- und L-Aminolactam-Verwertung

Uc/cichnunt;

I. Mikroskopische
Beoachtungen

(1) /cllform

(2) (iramfürbuii}!

Alcaligcncs Uuvalis IT.RM-P 778

Stäbchen 0» ■ 3.7 u. beweglich durch Wimpergeillcln

gebildet
nicht gebildet
nicht gebildet, später etwas gebildet gebildet
positiv

schwach positiv nicht aus Nitraten gebildet

langsame Peptonisierung, alkalisch, wird später etwas sauer verflüssigt
nicht hydrolysiert es wird weder Saure noch Gas aus Glucose, Rohrzucker, Maltose, Lactose und Galactose gebildet

nicht in Zuckerfermentationsmedien reduziert wird als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle verwertet

wird als Kohlensiolf- und Stickstoffquelle verwertet

V. Quelle isoliert aus Erdreich

Diese Eigenschaften ähneln denen von llavobacterium arborescens IAM 1100 und den Angaben in Bergcy's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage.

Tabelle III UlVl'il'llMIIMt!

II. Kuliurbeobachtungen

(1) Kolonien auf
Bouillon-Agar-Plattcn

1. Wachstum

2. Form

3. Qualität

4. Farbe

(2) Strichkultur auf geneigten Bouillon-Agar-PI-atten

1. Wachstum

2. Farbe

(3) Bouillon-Agar-Vcrsuch

(4) Gclatinevcrsuch

(5) Bouillonbrühe

(6) Kartoffel

III. Wachstumsbedingungcn

ICKMC 77H

mäßig

kreisförmig, polsierförniig sich ausbreitend, wellig
butlcrartig
nicht homogen, hellgelblichbraun, durchscheinend mit opakem Zentrum

mäüig, fadenförmig, sk'l ausbreitend, glatt hellgelblichbraun, opak, schimmernd
Oberflächen wachst u 111

Oberflächen wachst u in

trüb, Sediment, keine Häutchen

hellbraun. Kartoffeln werden gedunkelt

gutes Wachstum bei 30°C, gutes Wachstum bei pH 7,0-7.5, aerob

IV. Physiologische Eigenschaften

(1) Ammoniak

(2) Indol

(3) Schwefelwasserstoff

(4) Acetoin

(5) Katalase

(6) Urease

(7) Nitrite

(8) Lachmusmilch

(9) Gelatincplattc

(10) Stärke

(11) Zuckerfcrmenation

(12) Lackmus

(13) l.-l.vsin-Verwerlimg

(14) I) und I .-Aminolactam Verwertung

V. Oiiclle

gebildet
nicht gebildet gebildet
nicht gebildet positiv·
negativ

aus Nitraten gebildet stark alkalisch nach 5 — 8 Tagen
keine Verflüssigung nicht hydrolysiert es wird weder Saure noch Gas aus Glucose. Rohrzucker, Mallose. Lactose und Galactose gebildet

in Ziickcrfermeniaiiunsincdien reduziert w ird als Kuhlensioll- und Stiekstiillijuclle verwertet

und als Kohlensiolliiiul Siieksii.flquelle \ er weitel

Min |-,vl,-,.i,-h I₁,,Ii.,,..

Diese Eigenschaften ähneln denen von Alcaligencs faccalis IFO-3160 und den Angaben in Bergcys Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage.

Es ist entweder ein synthetisches oder ein natürliches Kulturmedium geeignet, wenn es die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des verwendeten Bakterienstammes und eine kleine Menge D-, L- oder DL-(\-Amino-(:-caprolactam als induzierenden Stoff für die En/ymsynlhcsc enthält.

So besteht das in den Beispielen verwendete Medium aus 1% Glucose, 0,25% Polypepton, 0,5% DL-Aminolactamhydrochlorid, 0,13% K₂HF⁵O₄, 0,03% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ ■ 7H₂O, 0,002% MnCl₂ · 5H₂O und 0.05% Hcfcexlrakt (pH 7,3). Die Züchtung erfolgt aerob bei 20 bis 40" C. vorzugsweise 32"C.

Zur Durchführung der D- oder Dl.-Aminolactam-Raccmisicrung können wachsende Zellen, eine Kulturbrühe, eine intakle Zellsuspension, behandelte Zellen, wie lyophilisiertc Zellen und vakuumgctrocknctc Zellen, ein Zellcxtrakt und ein Enzym, nämlich »Aminolactamraccniase« verwendet werden.

Außerdem kann das Enzym als unlöslich gemachtes Enzym, wie an DEAE, TEAE, GE-Ccllulose oder DEÄE-vcnu-tztcs Dextran adsorbiertes Enzym verwendet werden.

Die Aniinohictamracemase läßt sich folgendermaßen charakterisieren:

1. Katalylische Wirkung:

Katalysiert die Racemisierung von D- oder I.-Aminolactam zu optisch inaktivem DL-Aminolaciam.

2. Subsiratspezifität:

Katalysiert nicht die Racemisierung von D-oder

I.- Lysin,
i Aktiver pl I-Bereich:

Aktiv bei pl 1 b bis K), Optimum bei pi I 7,5 bis 8,5.
4. Prüfmethode:

Mil wäßriger D-Aminolaciamlösung von pH 8,5 inkubierl; nach I litzebehamllung wird Aminolaetamamidohydrolase (wie beispielsweise acetnngcirocknelc Zellen von Cryptoeoceus laureniii I'ERM-P 709) zugesetzt und inkubiert. Die Menge des im (iemisch gebildeten l.-l.ysins wird analysiert.

5. Optimale Temperatur:

50 C für die Inkubation von etwa 30 Minuten: 38 bis 43' C für die Inkubation von etwa 4 Stunden; 33" C für die Inkubation von etwa lOStundcn.
b. Inhibitor:

Hydroxylamin.

7. Aktivator:

Py ridoxal-5'- phosphat.

8. Reinigung:

ίο Fraktionierung mit Ammoniumsulfat; Fraktion von

etwa 35- bis 40%iger Sättigung.

Bei der Racemisierung wird vorzugsweise eine wäßrige Lösung von 5 bis IO Gewichts-% D-Aminolactarn mit pH 6 bis 10, vorzugsweise pH 7,5 bis 8,5, verwendet.

Das Aminolactam racemisierende Mittel wird vorzugsweise in einer Menge von 0,1 bis 10 Gewichts-% des Aminolactams in trockenem Zustand verwendet,
:o Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur bis 50°C, vorzugsweise unter vorsichtigem Rühren, inkubiert.

Als Mikroorganismen mit L-Aminolactam hydrolysicrendcr Aktivität kann man die Arten von Cryptococcus, Candida und Trichosoron verwenden.

Zur Durchführung der Hydrolyse von L-Aminolactam können wchsendc Zellen, eine Kulmrbrühc, eine intakte Zcllsuspension, behandeile Zellen, wie lyophili siertc Zellen und acctongctrockncte Zellen, ein 3d Zcllextrakl und ein Enzym, nämlich »1.-Aminolactamamidohydrolase« verwendet werden.

Das 1,-Aminolaciam hydrolysierende Mitlei wird in einer Menge von vorzugsweise 0,1 bis 10 Gewichts-% iles Aminolactams in trockenem Zustand verwendet.
is Die typischen Stämme der Mikroorganismen, die zu Crypioncoccus gehören, sind die Stämme FERM-P 709 FERM-P 710, IFO OMW und IFO (WOb von Cryptococcu> laureniii. Typische Stämme von Candida sind du Stämme FERM-P 715, FIiRM-P 717, 1"ERM-P 719 um .ld IFO 0753 (-ATCC 9949) von Candida humicola, um typische Stämme, «.lie /11 Trichosnc-on gehören, sind dit Stämme F^-I-RM-P 712, FKRM-P 714, FI-RM-P 725 um IFO 0173 von Trichosporon cutaneum.

Die Stämme I^-FlRM-P 709 und 710 erwiesen sich al· ■is Crypiococcus laureniii, die Stämme I^-ERM-P 715, 7\] und 719 als Candida humicola und die Stämme FERM-I 712,714 und 725 als Trichosporon culaiu'iim.

Tabelle IV
Cryptococcus laurcntii

lie/eichnung

IIO (KiO9 IFO (WOb

FFJRM-I' 709 FI-RM-P 710

, Mikroskopische Beobachtungen:

(1) Zellen in YM-Brühe

1. Form

2. Dominierende Zellen

3. Vegetative Vermehrung

(2) Objckttragcrkultur mil' Kartoffel-Agar

(3) Ascosporenbildimg

rund, oval, länglich-oval, rund, oval, lilnglich-oviil

gestreckt oval (4 bis 5) · (8 bis 9) μ rund bis oval (2,5 bis 4) ■

(3 bis 5) μ
vielseitig sprossend

Zellen vorhanden. Wirkliches Mycel, l'scudomyeel, Blasl< sporen, Chlnmydosporen, Arihrosporen werden nicht \v obachlet

nicht beobiichlel auf einem (lipsblock oder einem (iortn kowa-Agtir bei JOUIgigcr Inkubation

Forlsetzung
He/.oieli nung

II. Kultureigenschaften

(1) YM-Brühe

1. Trübheit

2. Sediment

3. Häutchen

4. Ring

(2) YM-Agar-Kolonien

1. Form

2. Rand

3. Erhebung

4. Oberfläche

5. Qualität

6. Farbe

III. Physiologische Eigenschaften

(1) Zuckerfermentation

(2) Zuckerassimilierung (auxanografische Methode)

(3) KNOi-Assimilicrung

(4) I .ackmusmilch

1. Farbe

2. Koagulation

3. Peptonisierung

(5) Aufspaltung von Arbutin (tt) Siiirkeahnliche Verbindung

(7) I.-I.ysin-Verwertung

(8) I.-Aiwinolaetam-Verweriung (<■)) Wachstuiusbedingungen

IV. Quelle

10

MOOb(W H-O(WOb [TRM-P 7(W ITRM-P 710

nicht trübe	gelegendlich kriechend
kompakt	gelegendlich sehr schwacher
kriechend	Ring
abwesend
kreisförmig
unversehrt	glatt, schimmernd
konvex	schleimig
glatt, stumpf	leicht cremefarbig
butterartig
leicht rötlichgelb

es bildet sich kein Gas aus Glucose, Galactose, Rohrzucker,

Maltose, Lactose und Raffinose bei 30tägiger Inkubation Glucose. Galactose, Rohrzucker, Maltose, Lactose und

Riiffinose werden assimiliert

keine

(sowohl nach tier Flüssigkulturmethodc wie auch nach der

auxanografischen Methode)

leicht sauer, nach 2^ Tagen verminde; t

koaguliert nach 2(i Tagen

keine

positiv (stark)

positiv (viok-it) positiv (blau)

wird als kohlensn If- und .Stickstoffquelle verwertet

wird als Kohlenstoff- und Stickstoffquellc verwertet

gutes Wachstum bei K)C

gutes Wachstum bei pi I M)

aus Erdreich isoliert

/weekmilIJig beir.ieluel man die beiden Siiimme .)s grollen Ähnlichkeil mil Cryptoeoecus laiirentii ILO Od H-KM-P 7(W und 710 als Cryplococcus und speziell als (ryptoi'oiviis laurenlii aufgrund der Hesehreibung von |. i.odder und N. |. W. K r e g c r V a η R ι j' s »The Yeasts, A Tiuonomie Study« (H)W) und aufgrund der

Tabelle V

Candida humicola und UX)(WOb.

In Tiihclle V sind die charakteristischen Eigenschal ten von EERM-P 7\\ 717, 7l^l) uiki von C'andidi Inimieol« IK) 07f>J (= Λ I CC »94») iiulgeftihn,

Hc/.cichnung

M-O 07SJ

ATCC ITlUM-I'

ITKM-P 715

Ι·Ί· KM-P 719

I, Mikroskopische Beobachtungen: (I) Zellen in YM·»ruhe

1, Form

2. Dominierende Zellen

unterschiedliche l"onw: mm!, /itroncnrörmig, oviil. elliptisch, llinglich, zylin

mild bei oval rund bis ovnl (3 bis 4) · 7 μ (D bis 6) · (5 bis H) μ

3. Vegetative Vermehrung vielseitig sprossend (2) Objekltrllgerkuluir mif Karloffel-Agur

elliptisch

(4 bis 5) .(7 bis 10)

I. Zellen

vorhanden

11

Fortsetzung

IK) 0753
ATCC 9444

ΓΙ RM I¹ 717

12

[TR Ml· 71")

IKRM-I'

2. Echtes Myecl

3. Pscudomycel

4. Blustosporen

5. Chlamydosporen

6. Arthosporen

(3) Ascosporenbildung

Π. Kuitureigenschaften

vorhanden Entwicklung

reichliche Entwicklung

Entwicklung

nicht beobachtet vorhanden

nicht vorhanden

nicht beobachtet auf einem Gipsblock oder einem modifizierten Gorod-

kowa-Agar bei 30tägiger Inkubation

(1) YM-Brühe	nicht trübe	keine Bildung	flockig
I. Trübheit	kompakt	verschwommener
2. Sediment	inselchen bis dünnes Häutchen		Ring
3. Häutchen	klarer Ring
4. Ring
(2) YM-Agarkolonien	kreisörmig, wird faserig	etwas
1. Form	unversehrt, wird faserig	buckelig	konvex,
2. Rand	konvex, konvex		später
3. Erhebung	manchmal		buckelig
	buckelig		buttcrartig
	butlerartig:, später schleimig
4. Qualität	gelblich leicht cremefarbig	mäßig
5. Farbe		wellig	reichlich
(3) YM-Neigungskultur	reichlich	rauh, trübe	faserig
1. Wachstum	faserig unversehrt		rauh und nin/elig
2. Rand	runzelig, glan/los weich, !rübe		trübe
3. Oberfläche

III. Physiologische Eigenschaften

(1) Zuckeriernu'ntaiioii

(2) /iickerassimilieruiig (auxanografische Me I Iu nie)

(i) KNOi-AssimiliiTung

(•I) l.ackinusmilch

1, Farbe.

2, Koagulation

3, Peptonisierung

(5) Aufspaltung von Arbutin

(6) SillrkeUhnliehe Verbindung

(7) L-Lysin-Verwertung

(H) L-Anu'nolactam-Verwertung (9) Waehstumsbedingungen

IV, Quelle

es bildet sich kein (las aus (ilucose, Galactose, Rohrzucker, Maltose, I.ac

lose und Raffinose bei JOtägiger Inkubation Glucose, Galactose, Rohrzucker, Maltose, Lactose werden assimiliert

(sowohl bei der Flussigkulturmcthodc als auch bei der auxanogralische Methode)

hellrot, spüler rrcdu/icri unverändert, nach 22 Tagen reduzier

koaguliert mich 25 Tagen koaguliert

lungsiime l'eplonisiei'ting der nach 30 Tagen langsame l'epto-

Koagulation nisicrung tier Koagulation

positiv

etwas oiler schwach gebildet nicht gebildet

als Kohlenstoff- und Slicksloffquelle verwertet als Kohlenstoff- und Sticksloffqtielle verwertet gutes Wachstuni bei JO"C

gutes Wachsttun bei pi I W)

aus. F.rdreieh isoliert

Ils ist zweckmllUIg, die drei Stamme FKUM-I' 715,717 und 7U) als Candida und speziell als Candida luimleolu a /.tischen, und /.war aufgrund der lksehrelbung in |. Lo d d e r und N. |. W. K r c g e r - V a η R IJ' s »The Yeas A Taxonomie Study« (1967) und aufgrund der grollen Ähnlichkeit mil Candida humicola Ir'O 0733,

In Tabelle VII sind die charakteristischen l'igenscharten von FLHM-I' 712,714, 725 und Triehosnoron cutaneii IFO 0173 wiedergegeben.

13

Tabelle VI
Trichosporon eutancum

Bezeichnung

I. Mikroskopische Beobachtungen (!) Zellen in YM-Brühe 1. Form

HO 017 J

ITRMI¹ 714

Il

14

725

ITRM-I¹

unterschiedliche Form: rund. oval, länglich-oval, zylimlrisch. gelegentlich

riesige /.eilen

π ι ml bis oval. länglich oval. zylindrisch.

(b bis 8) · (8 bis 10) μ (4 bis 5) ■ (7 bis 8) ■

(7 bis l())u (20 bis 30) μ

3. Vegetative Vermehrung vielseitig sprossend und Spaltung hauptsächlich

Spaltung

/.eilen vorhanden, reichliche Entwicklung von echtem Mycel, kein Pseudomycel, Blastosporen rund bis oval. Büschel bildend. Arthrosporcn in typischer Zickzack-Form

nicht beobachtet auf Gipsblock oder einem modifizierten Goiodkowa-Agar bei 30tägiger Inkubation
Kultureigenschaften

(1) YM-Brühe

1. Trübheit

2. Sediment

3. I liiutchen

2. Dominierende /eilen

(2) Objektträgcrkullur auf Kartoffcl-Agar

(3) Ascosporcnbildung

nicht trübe

kompakt flockig kompakt

es bildet sich ein 1 liiutchen, das spüler als Sediment absinkt

(2) YM-Agarkolonien	kreisförmig.
I. Form	faserig
2. Rand	erhöht
3. Krliebung	rauh, stunipl
4. Oberfläche	bultcrartig
r). Qualität	bis trocken
	crcmclarhig
(i. I ai'he
(3) YM-Neigiingskiihui	reichlich
I. Wachstum	faserig
2. Rand

1. Oberfläche iOtilgigc Kultur samlariii:

gefaltet

I. Physiologische lügcnsehaftcn (I) /uekcrfernientalion unversehrt, faserig werdend

konvex konvex, später erhöht

nebeiförmig

glait. wird rauh, glatt, wird saint- niii/elir. glanzlos stumpf artig gefaltet.

glanzlos butterartig trocken

cremclarbig bis weidlich

mäl.lig reichlich

wellig, wird auf wellig bis laseng

dem oberen Teil

laseng

rauh samtartig wellig

gelallci

(2) /.uckenissiniilierung (uuximogrnfischu Methode)

(3) KNOi-Assimiliemng

(4) t ,aekmusmilch

1. Farbe

2. Koiigiilation

3. Peptonlslei'ung

es bildet sich kein (las aus tilucnse, (ialaciuse, Rolu/ucker, Maltose, I .ac tose und Ralfiiiose bei iOiagiger Inkubation (iltiiHtse, (iiiliictose, Rohmicker, Mtilloso und l.nctosc weiden assimiliert

keine (sowohl mich der !■'lüssigkuluinuciluulc als micli mich iler mixaiiognilischet

Methode)

(5) Aufspnlluiig von Arbtilin iinvcritnclurl, nach 25 Ingen redii/.iert

kongiilieil nach 2^r) ΊΉμοη

keine langsame Popioiiiosieruny

der Koagtiliition

negativ positiv negativ

(b) Stlli'kollhnliehc Verbindung wird nicht proilu/Jert
(8) I.-I.ysin-Vei'werlung tiIs Kohlenstoff- tiiul Sticksloffc|tiellle verwertet

(8) 1,-AmIiU)IuClUm-VeI¹WOrItIiIg win! nls Kohlenstoff- und Slicksloffquelle verweriel

(9) WuclislimisbcilingungcM gutes Wachstum bei 10 Γ

gutes Wachsluni bei pll (ι,Ο

IV. Quelle uns Ij'ilreich isoliert

keine

Die drei Stämme FERM-P 712, 714 und 725 können zweckmäßig als Trichosporon und speziell als Trichosporon cutaneum angesehen werden, und zwar aufgrund der Beschreibung in J. Lodder und N.J.W. Kreger-Van Rij's »The Yeasts, A Toxonomic Study« (1967) und aufgrund der starken Ähnlichkeit mit Trichosporon cutaneum IFOl,.

Als Kulturmedium ist entweder ein synthetisches oder natürliches Kulturmedium geeignet, solange es die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des verwendeten Hefestammes sowie eine kleine Menge von L- oder DL-Aminolactam als induzierenden Stoff für die Enzymsynthese enthält. So besteht das in den Beispielen verwendete Medium aus 1% Glucose, 0,3% NH₄NO₃,5% L-Aminolactamhydrochlorid, 0,1 KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7H₂O, 0,02% MnCL₂ · 5H₂O und 0,05% Hefeextrakt (pH 6). Die Züchtung erfolgt aerob bei 20 bis 40^DC, vorzugsweise bei 30⁰C.

Zur Durchführung der Hydrolyse von L-Aminolactam können wachsende Zellen, eine Kulturbrühe, lebende Zellen, modifizierte Zellen, wie lyophilisierte Zellen und acetongetrocknete Zellen, ein Zellextrakt und ein aus Zellen gewonnenes gereinigtes Protein, nämlich L-Aminolactamamidohydrolase verwendet werden. Außerdem kann das Enzym als unlöslich gemachtes Enzym, als an DEAE, TEAE, GE-Cellulose oder an DEAE-vernetztes Dextran adsorbiertes Enzym verwendet werden. Das L-Aminolactam hydrolysierende Enzym wird als L-Aminolactamamidohydrolase bezeichnet, deren Eigenschaften nachstehend beschrieben sind.

1. Katalytische Wirkung:

1. Katalysiert die Hydrolyse von L-Aminolactam zu L-Lysin.

2. Katalysiert die Hydrolyse von D-Aminolactam mit einer Aktivität von 0,5% derjenigen Aktivität, die gegenüber L-Aminolactam vorhanden ist.

2. Substratspezifität:

Katalysiert nicht die Hydrolyse von «-Butyrolactarn, o-Valerolactam, e-Caprolactam, von zyklischen Dimeren, Trimeren und Pentameren der ε-Aminocapronsäure, D- und L-Pyrrolidonvarbonsäure.

3. pH-Bereich:

Aktiv bei pH 6 bis 12, wobei das Optimum bei etwa pH 9,0 liegt.

4. Prüfmethode:

Wird mit L-Aminolactamlösung mit einem PH-Wert von 9,0 inkubiert. Die in dem inkubierten Gemisch produzierte L-Lysinmenge wird analytisch bestimmt.

5. Optimale Temperatur:

7O⁰C für eine Inkubation von etwa 20 Minuten. 40 bis 50⁰C für eine Inkubation während mehrerer Stunden.

6. Inhibitor:

Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA).

7. Aktivator:

Mn + +,Mg++,Zn++,Co++. do

8. Reinigung:

Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, Fraktionierung mit etwa 30 bis 40% Sättigung, dann Flüssigchromatographie unter Verwendung von DEAE-Cellulose. . <>5

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgte in dem Kulturmedium der vorstehend angegebenen Zusammensetzung.

Beispiel 1

In der üblichen Weise wurden lyophilisierte Zellen von Achromobacter cycloclastes FERM-P 772 gewonnen. Die spezifische Aktivität der Aminolactam-Racemisierung betrug 4 μ Mol je Stunde je Milligramm.

Acetongetrocknete Zellen von Cryptococcus laurentii FERM-P 709 wurden auch in der üblichen Weise gewonnen. Dieses Präparat besaß L-Aminolactam hydrolysierertde Aktivität. Die spezifische Aktivität dieses Präparates betrug 10 μ Mol je Stunde je Milligramm.

Ein Reaktionsgemisch aus 600 mg der lyophilisierten Zellen von Achromobacter cycloclastes FERM-P 772, 200 mg der acetongetrockneten Zellen von Cryptococcus (aurentii FERM-P 709, 3 g D-Amino)actam und 30 ml Wasser (pH8,5) wurde bereitet. Die Inkubation erfolgte 24 Stunden bei 40⁰C. Aus dem Reaktionsgemisch erhielt man 4,15 g L-Lysinmonohydrochlorid. Die Ausbeute, bezogen ajf D-Aminolactam, betrug 97%. Die optische Reinheit betrug 99%.

Beispiel 2

Lyophilisierte Zellen von Alcaligenes faecalis Ferm-P 778 wurden in der üblichen Weise gewonnen. Die spezifische Aktivität der Aminolactam-Racemisierung dieses Präparates betrug 2 μ Mol je Stunde je Milligramm.

Acetongetrocknete Zellen von Candida humicola FERM-P 717 wurden ebenfalls in der üblichen Weise gewonnen. Dieses Präparat besaß eine L-Aminolactam hydrolysierende Aktivität, und die spezifische Aktivität betrug 6 μ Mol je Stunde je Milligramm.

Ein Reaktionsgemisch wurde aus 600 mg der lyophilisierten Zellen von Alcaligenes faecalis FERM-P 778, 300 mg der acetongetrockneten Zellen von Candida humicola FERM-P 717, 3 g DL-Aminolactam und 30 ml Wasser (pH 8,5) hergestellt. Die Inkubation erfolgte während 24 Stunden bei 40°C.

Aus dem Reaktionsgemisch wurden 4,07 g L-Lysinmonohydrochlorid erhalten. Die Ausbeute, bezogen auf DL-Aminolactam, betrug 95%. Die optische Reinheit betrug 98%.

Um die racemisierende Wirkung der anderen Mikroorganismen zu belegen, wurden folgende Versuche durchgeführt:

Beispiel 3

50 ml Kulturmedium wurden in einem 500-ml-Kolben sterilisiert. Das Medium wurde mit jedem der in Tabelle VII aufgeführten Stämme beimpft, und die Stämme wurden aerob unter Schütteln 20 Stunden bei 32°C gezüchtet. Die Zellen wurden abgetrennt und lyophilisiert.

Sodann wurde ein Reaktionsgemisch aus 10 mg lyophilisierten Zellen und 2 ml einer wäßrigen Lösung von 2,5% D-Aminolactamhydrochlorid mit einem pH-Wert von 8,5 bereitet. Das Gemisch wurde bei 40⁰C während einer Stunde bzw. 20 Stunden inkubiert.

Die spezifischen Aktivitäten und die Umwandlungsraten wurden bei den Umsetzungen von einer Stunde bzw. 20 Stunden aufgezeichnet. Die spezifische Aktivität ist in μ Molen ausgedrückt. Die Umwandlungsrate wurde nach folgender Formel errechnet:

TTF · ^1OÜ(%)

Tabelle VII

Stamm

Spezifische Umwand-Aktivitüt limgsraie

Achromobacter cycloclastes 5,0 50

IAM 1013

Achromobacter cycloclastes 5,2 50

FERM-P 772

Achromobacier cycloclastes 2,7 48

FERM-P 780

Flavobacterium arborescens 0,8 25

FERM-P 777

Alcaligenes faecalis 2,8 47

FERM-P 778

Achromobacter obae sp. nov. 3,1 49

FERM-P 776

Beispiel 4

Achromobacter cycloclastes FERM-P 772 wurde aerob in 5 1 des Kulturmediums gezüchtet. Aus dieser Kultur erhielt man 60 g lebende Zellen.

Das Reaktionsgemisch bestand aus 10 g der lebenden Zellen, 10 g D-Aminolactam und Wasser (auf 100 ml). γ, Der pH-Wert wurde auf 8,5 mit HCl eingestellt. Es wurde 10 Stunden bei 40⁰C inkubiert. Aus dem Reaktionsgemisch wurden 12,2 g DL-Aminolactamhydrochlorid erhalten.

Beispiel 5

15 g der in Beispiel 4 erhaltenen lebenden Zellen wurden lyophilisiert, wobei 3,5 g getrocknete Zellen erhalten wurden.

Das Reaktionsgemisch bestand aus 3,5 g dieser getrockneten Zellen und 100 ml einer wäßrigen 10%igen D-Aminolactamlösung mit einem pH-Wert von 8,5. Es wurde 10 Stunden bei 40⁰C inkubiert. Aus dem Reaktionsgemisch wurden 12,4 g DL-Aminolactamhydrochlorid erhalten.

Beispiel 6

55 g lebende Zellen von Achromobacter cycloclasies FERM-P 772 wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 4 erhalten. Die lebenden Zellen wurden in 50 ml 10~²m Phosphatpuffer von pH 8,5 suspendiert. Die Suspension wurde in einer French-Presse behandelt und zentrifugiert. 100 ml einer so erhaltenen oben schwimmenden Flüssigkeit wurden mit Ammoniumsulfat fraktioniert, /ede Fraktion wurde gegen den Phosphatpuffer dialysiert. Eine Fraktion von 35 bis 40% Sättigung hatte ein Volumen von 80 ml und zeigte eine spezifische Aktivität von 54,6 μ Mol je Stunde je Milliliter. In die Enzymlösung (48 ml) wurde DEAE-Cellulose (Ig Trockengewicht), mit 10~²m Phosphatpuffer von pH 7,6 gepuffert, gegeben, sodann wurde filtriert. Die Enzymaktivität der Lösung wurde vollständig auf der DEAE-Cellulose adsorbiert.

600 ml 0.5%ige wäßrige D-Aminolactamlösung mit einem PH-Wert von 8,5 ließ man durch eine Säule von 1 cm Durchmesser und 20 cm Länge mit dem an DEAE-Cellulose adsorbierten Enzym 15 Stunden bei 42⁰C fließen. Aus dem Ausfluß erhielt man 3,5 g DL-Aminolactamhydrochlorid.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von L-Lysin aus D- oder DL-a-Amino-E-caprolpctam unter Hydrolyse mittels eines Mikroorganismus oder Enzyms mit L-«-Amino-e-caprolactam hydrolysierender Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß man das «-Ainino-E-caprolactam in Gegenwart des Mikroorganismus oder Enzyms mit L-a-Amino-f-caprolactam hydrolysierender Aktivität mit einem das a-Amino e-caprolactam racemisierenden Mikroorganismus der Arten Achromobacter cycloclastes, Achromobacter obae, Flavobacterium arborescens und/oder Alcaligenes faecalis oder mit von diesen Mikroorganismen gebildeter Aminolactamracemase behandelt.