DE2117285B2

DE2117285B2 - Elektrophoreseverfahren

Info

Publication number: DE2117285B2
Application number: DE19712117285
Authority: DE
Inventors: Per Just Dr.phil. Glostrup Svendsen (Dänemark)
Original assignee: Lkb-Produkter Ab, Bromma (Schweden)
Priority date: 1970-04-08
Filing date: 1971-04-08
Publication date: 1972-07-06
Also published as: SE357891B; DE2117285A1; JPS5341113B1; US3692654A; FR2085925A1; GB1301065A; FR2085925B1

Description

elektrisches Feld an ein Elektrolylsystem, welches die Bei Anwendung der Erfindung wird ein Protein wtth-ZU trennenden Komponenten enthalt, gelegt. Das rend der Trennung geladen, d, h. die Löslichkeit Elektrolytsystem enthalt einen leitenden Elektrolyten wächst, Das erfind ungsgemaße Verfahren kann somit und einen Endeleklrolyten, Der !eilende Elektrolyt ist auf einer prflparatlven Basis verwendot werden und die eine Komponente, welche die gleiche Ladung besitzt, 5 Anzahl der Proben ist nicht kritisch. Dadurch wird ein wie die Komponenten, welche getrennt werden sollen. konzentrierender Effekt erzielt. Beim herkömmlichen Seine Beweglichkeit ist jedoch höher. Die Ladung des isolachophoretischen Verfahren kann eine Erhöhung Endeleklrolyten soll die gleiche sein wie eine des leiten- des Trennungsgrades durch ein Gegenstromprinzip den Elektrolyten, Die Beweglichkeit des Endelektro- erzielt werden. Dadurch vergrößert sich der Trenlyten ist jedoch geringer als die der zu trennenden io nungsweg, welcher von den Komponenten zurückgc-Komponenten, Bei Gleichgewicht im System haben legl werden muß. In diesem Fall muß jedoch die elekalle Komponenten die gleiche Ladungswanderung bei trophorelische Lösung durch geeignete Mittel stabiliciner Geschwindigkeit, welche gleich ist der Geschwin- sierl werden, z, B. durch ein Pulver, Eine derartige digkcil der Komponenten, welche die höchste Beweg- Stabilisierung kann auch dann angewendet werden, lichkeit haben, Das bedeutet, daß alle Komponenten 15 wenn kein Gegenslromprinzip verwendet wird, Als mit der gleichen Geschwindigkeit wie der leitende Stabilisierungsmedium wird dann normalerweise ein Elektrolyt wandern und daß die Komponenten aufein- Gel z. B. ein Polyacrylamid-Gel verwendet,
anderfolgende Zonen bilden, welche entsprechend der Wenn die Anzahl der Komponenten in der Mi-Beweglichkeit der Komponenten angeordnet sind. schung der amphoteren Elektrolyte ausreichend ist, Besitzen die Komponenten entgegengesetzte Ladun- 20 dann werden die zu trennenden Komponenten durch gen, dann wandern sogenannte entgegengesetzt wir- die amphoteren Elektrolyte getrennt und der !renkende Ionen in entgegengesetzte Richtungen. Die nungsgrad wächst. Die Eigenschaften des Systems Trennung, welche erzielt wird, hängt von den Unter- können durch Änderung der entgegengesetzt wirkenschieden bezüglich der Beweglichkeiten der Kompo- den Ionen des leitenden Ions oder des End-Ions genenten ab. Liegen die Beweglichkeiten der Komponen- 25 ändert werden. Der geeignete pH-Wert der End-Zone ten nahe beieinander, ist es notwendig, daß eine ist bestimmt durch die Beweglichkeit und Konzenweitere Komponente in das System eingebracht wird. tration der entgegengesetzt wirkenden Ionen, nämlich Diese Komponente besitzt eine Beweglichkeit, welche der leitenden Ione und der begrenzenden bzw. Endzwischen den Beweglichkeiten der zu trennenden Ionen. Die Mischung der amphoteren Elektrolyte wird Komponenten liegt. Daß eine Komponente derartige 30 durch die entgegengesetzt wirkenden Ionen ionisiert, Eigenschaften aufweist, kann getrennt festgestellt wer- so daß entweder eine saure oder eine basische Miden. Durch eine isoelektrische Ausrichtung werden die schung erzielt wird, d. h„ daß ein wandernder pH-Graverschiedenen Komponenten innerhalb verschiedener dient erzielt wird. Durch geeignete Wahl des leitenden pH-Bereiche ausgerichtet, und die Proben breiten sich Ions und der entgegengesetzt wirkenden Ionen kann entlang des gesamten pH-Gradienten aus. Ampho- 35 der pH-Gradient einer bestimmten Mischung amphoterische Elektrolyte trennen die verschiedenen Proben- terer Elektrolyte beispielsweise von einem pH-Wert zonen. 5 bis 7 bis zu einem pH-Wert 6 bis 8 verändert werden.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, die ge- Dadurch wird gleichfalls der Grad der Trennung vernannten Nachteile der bekannten Verfahren zu be- ändert. Der pH-Gradient kann gleichfalls durch Verseitigen. 40 wendung einer Mischung aus ampholeren Elektro-

Beim eingangs geschilderten Verfahren besteht die lyten, welche verschiedene Zusammensetzung haben, Erfindung darin, daß eine Mischung amphoterer Elek- verändert werden.

trolyle den Komponenten zugegeben wird, so daß ein Die Mischung amphoterer Elektrolyt kann beiwandernder Beweglichkeits- und pH-Gradient im spielsweise eine solche sein, wie sie in der schwedischen elektrischen Feld entsteht, daß die amphoteren Elek- 45 Patentschrift 314 227 beschrieben ist. Diese Mischung trolyte verschiedene Beweglichkeiten und isoelektrische enthält Aminokarboxylsäuren, denen verschiedene Punkte aufweisen, daß die Unterschiede der Beweg- pyrolitische Gruppen, wie z. B. Stickstoffverbindungen lichkeiten aufeinanderfolgender Elektrolyte klein sind, und Karboxylverbindungen zugesetzt sind. Es können daß der pH-Wert eines jeden Elektrolyts seinem iso- jedoch auch andere geeignete Mischungen verwendet elektrischen Punkt entspricht, daß der pH-Wert durch 50 werden. Es eignen sich Mischungen, welche eine große die verwendeten entgegengesetzt wirkenden Ionen fest- Anzahl von Komponenten enthalten, die verschiedene gelegt wird, daß die entgegengesetzt wirkenden Ionen Substitutionsgrade aufweisen. Es eignen sich auch puffernd wirken und daß der Beweglichkeitsbereich Komponentengemische, welche an sich bekannt sind, der Elektrolytmischung derart gewählt wird, daß der Wenn ein pH- und Beweglichkeitsgradient erreicht Beweglichkeitsbereich der zu trennenden Komponen- 55 werden soll, ist es notwendig, daß die Anzahl der ten umfaßt wird. Komponenten groß ist, so daß der Unterschied des

Bei der Erfindung werden die Vorteile der isoelek- pH- und Beweglichkeitsgradienten zwischen den Komtrischen Ausrichtung bei einem isotachophoretischen ponenten klein ist. Sich auf eine bestimmte Zahl der Verfahren erzielt. Wenn die zu trennenden Komponen- Komponenten festzulegen, ist jedoch nicht erforderten amphoterisch sind, so erreichen sie ihre isoelektri- 60 Hch, da dies vom Intervall, welches vom Gradienten sehen Punkte nicht, wenn die entgegengesetzt wirken- bedeckt ist, abhängt.

den Ionen gemäß der Erfindung eine puffernde Wir- Weiden entsprechend dem erfindungsgemäßen Verkling ausüben. Dies wird dann erzielt, wenn eine fahren Proteine voneinander getrennt, ist es erwünscht, schwache Säure und eine schwache Base zur Anwen- eine Mischung aus amphoteren Elektrolyten zu verdungkommen. Die Trennung, welche sich ergibt, hängt 65 wenden, welches keine ultravioletten Strahlen absorvon der Beweglichkeit der Komponenten und von den biert, die innerhalb des Absorbtionsbereiches der isoelektrischen Punkten ab, wenn die Komponenten Proteine liegen. Andererseits kann es jedoch von Vor-Proteine oder andere amphoterische Bestandteile sind. teil sein, eine UV-absorbierende Lösung zu verwenden,

wenn Komponenten zu trennen sind, die keine UV-Strahlen absorbieren.

Das erHndungägemllße Verfahren wird im folgenden im einzelnen an Hand verschiedener Ausflihrungsbeispiele beschrieben, Die Lösungen, welche bei den Ausfühningsbeispielen verwendet werden, besitzen die folgende Zusammensetzung:

Gelpuffer, pH = 6,1
5,2 g Tris-Base
39 ml IM H₁₁PO₄
0,5 ml Tetramethylelhylendiamin Destilliertes Wasser zu 100 ml angemacht Gelpuffer, pH = 4,0
0,9 g Tris-Base
3,0 ml Eisessig

0,3 ml Tctramethylethylendiamin Destilliertes Wasser zu 100 ml angemacht Gelpuffer, pH = 6,6
6,0 g Tris-Base
39 ml M H_uPO.j

0,9 ml Telramethylethylendiamin Destilliertes Wasser zu 100 ml angemacht Gelpuffer, pH = 4,5
2,0 g Tris-Base
3,0 ml Eisessig

0,3 ml Tetramelhylethylendiamin Destilliertes Wasser zu 100 ml angemacht Gel-Lösung 30% (Gewicht/Volumen) 2,9 g Acrylamid
1 g Bisacrylamid

Destilliertes Wasser zu 100 ml angemacht Katalysatorlösung
4 mg Riboflavin

Destillieites Wasser zu 100 ml angemacht Saccharose-Solution, 25% (Gewicht/Volumen) 25 g Saccharose

Destilliertes Wasser zu 100 ml angemacht Elektroden-Puffer
30 mg Glyzin
6 g Tris-Base
Destilliertes Wasser zu 2000 ml angemacht

Beispiel 1

Eine Mischung, bestehend aus 3 ml Gelpuffer pH = 6,1; 3 ml 30%ige Gellösung, 3 ml 25%ige Saccharose-Lösung, 12 ml destilliertes Wasser und 3 ml Katalysatorlösung ,wird in eine vertikale Elektrophoresesäule eingebracht. Vor dem Einbringen der Lösung wird ein Ende der Säule durch ein Filterpapier, welches mit einer geeigneten Mischung gesättigt ist, abgedichtet. Das Filterpapier wird beispielsweise mit einem Kunststoffilm abgedichtet. Die Gelmischung wird während 45 Minuten durch eine UV-Strahlung polymerisiert, und es wird ein festes Gel erhalten. Auf den oberen Teil dieses Gels wird eine neue Lösung aufgebracht. Diese Lösung besteht aus 2 ml Gelpuffer pH = 6,1, 2 ml 30%iger Gellösung, 2 ml 25%iger Saccharoselösung, 7 ml destilliertem Wasser, 2 ml Katalysatorlösung und 1 ml Ampholin pH = 4 bis 8. Diese letztbezeichnete Komponente ist eine kommerziell erhältliche Mischung, welche Aminokarbonsäure enthält. Auch die letztbezeichnete Mischung wird durch UV-Strahlen polymerisiert. Schließlich wird eine dritte Mischung in die Säule eingebracht. Diese dritte Mischung besteht aus einem Trisglycinpuffer, dies ist die gleiche Mischung, welche in der Elektrodenkammer Die Proteinprobe von 7 ml, welche getrennt werden soll, wird mit 1,25 ml Gelpuffer pH = 6,1 und 1,25 ml Saccharose-Lösung gemischt und mit destilliertem Wasser auf 10 ml verdünm. Die Komponenten der Proben werden ionisiert, und die Proben werden der Elektrophoresosäule zugegeben. Die Probe wird bevorzugt auf den oberen Gel aufgebracht.

Es wird eine Spannung angelegt, und die Elektrophorese wird bei einem konstanten Strom von 10 niA

ίο ausgeführt. Die Phosphationen, welche die Ionen mit der höchsten Beweglichkeit sind, wirken als leitender Elektrolyt während die Glycon-Ionen den Endelektrolyten bilden. DieTris-lonen wirken als entgegengesetzt wirkende Ionen. Bei stationären Bedingungen wandern alle Ionen im System mit der gleichen Geschwindigkeit wie die Phosphationen. Die Komponenten der Probe werden mit dem Wandern des pH-Gradienten getrennt. Sobald die Säule eluiert ist, werden die Inhalte fraktioniert und einer immunochemischen Frak-

ao tionsanalyse unterzogen. Entsprechend dieser Analyse enthalten die Fraktionen Orosomucoid und Prealbumin. Diese werden aufgefangen, und die Mischung wird ultrafiltrierl und gegen destilliertes Wasser zu einem Volumen von 10 ml dialisiert.

Beispiel 2

Dieses erfindungsgemäße Beispiel wird in der gleichen Weise begonnen wie das erstgenannte Beispiel. Die Säule wird mit einer Mischung gefüllt, welche aus 3 ml Gelpuffer pH = 4,0, 3 ml 30%iger Gellösung, 3 ml 25%iger Saccharoselösung, 12 ml destilliertem Wasser und 3 ml Katalysatorlösung besteht. Die Mischung wird durch UV-Strahlung polymerisiert, und es wird eine zweite Mischung beigemischt, welche aus 1 ml Ampholin® pH = 3 bis 7, 1,5 ml 25%iger Saccharose-Lösung und 100 ml Tris-Base besteht. 10 ml Probe von dem vorbeschriebenen Beispiel werden hinzugefügt. Weiterhin wird Triglycinpuffer hinzugefügt und die Elektrophorese wird gestartet. Der Strom während dieses Ausführungsbeispieles beträgt 7 niA. Die anschließende Analyse ergibt, daß die Komponenten der Probe vollständig getrennt sind und daß das Orosomucoid und nicht das Prealbumin immunochemisch rein geworden ist. Wie im vorausgegangenen Ausführungsbeispiel wird die Fraktion vom Prealbumin gemischt und die Mischung ultrafiltriert und dialysiert.

Beispiel 3

Zwei vom ersten Ausführungsbeispiel verschiedene Mischungen werden in die Säule eingebracht, und die eingebrachten Mischungen werden polymerisiert. An Stelle des Gelpuffers pH = 6,1 der zuerst verwendet worden ist, besitzt der nunmehr verwendete Puffer einen pH-Wert = 6,6. Des weiteren wird 1 ml Ampholin® pH = 5 bis 7 verwendet. Die Probe wird gebildet von 9 ml einer Lösung, welche aus der Dialyse des zweiten Ausführungsbeispieles gewonnen wurde. Diese Probe wird mit 1,5 ml Gelpuffer pH = 6,6 und 1,5 ml 25%iger Saccharoselösung verdünnt. Nach dieser Trennung wird chemisch reines Prealbumin sowie Prealbumin, welches einige Albumine enthält, gewonnen.

Beispiel 4

Dieses Ausführungsbeispiel wird zu dem Zweck ausgeführt, um den pH-Gradienten zu kontrollieren. Es wird daher keine Probe hinzugefügt. Die experimen-

teilen Bedingungen sind die gleichen wie im zweiten Ausführungsbeispiel. Das Gelpuffer hat einen pH-Wert von 4,5, und es wird Ampholin® pH = 3 bis 8 verwendet. Das Experiment wird dann gestoppt bevor der leitende Elektrolyt, welcher Azetationen enthält, aus dem Gel hinauswandert. Das Gel wird von der Säule

eluiert und in zehn Bereiche eingeteilt. Jeder Bereict wird mit destilliertem Wasser behandelt. Die pH-Werte der einzelnen Zonen werden dann festgelegt, und ei zeigt sich, daß sich die pH-Werte linear von 4,5 bis 8,f entlang dem Gel ändern. Die Länge des Gels beträgi etwa 8 cm.

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Claims

ander entgegenwirkender Ionen in entgegengesetzten Patentansprüche: Richtungen erfolgt. Es sind verschiedene Elektrophoreseverfahren zur

1. Verfahren zum isotachophoretischen Trennen Trennung von Komponenten bekannt. Bei einem einelektrisch geladener Komponenten einer Lösung, 5 fliehen Elektrophoreseverfahren werden die Kompobei dem die Komponenten in einem elektrischen nenten durch Wanderung in einem elektrischen Feld Feld eine gleiche Ladungswanderung mit einer voneinander getrennt, Die Trennung erfolgt auf Grund Geschwindigkeit gleich der Geschwindigkeit der der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten Komponenten mit der höchsten Beweglichkeit auf- der Komponenten im elektrischen Feld. Der Trenweisen und bei dem die Komponenten in Ab- io nungsgrad, der erreicht wird, hängt von der Länge des hängigkeit von ihrer Beweglichkeit aufeinander- Trennungsweges ab. Für einen langen Trennungsweg folgende Bereiche bilden, wobei die Komponenten ist jedoch eine ziemlich hohe Spannung erforderlich, verschieden geladen sind und eine Wanderung ein- um eine genügend hohe elektrische Feldstärke zu erander entgegenwirkender Ionen in entgegengesetz- zielen. Wenn die Trennung in Form von verschiedenen ten Richtungen erfolgt, dadurch ge ke η n- ig Trennungssäulen erfolgt, dann verlassen die verzeichnet, daß eine Mischung amphoterer schiedenen Substanzen die Säulen bei verschiedenen Elektrolyt den Komponenten zugegeben wird, so Geschwindigkeiten während des Elutionsverfahrens. daß ein wandernder Beweglichkeits- und pH-Gra- Dies ist jedoch nicht erwünscht. Weiterhin bleiben die dient im elektrischen Feld entsteht, daß die ampho- verschiedenen Komponenten während des Trennungsteren blektrolyte verschiedene Beweglichkeiten und ao Vorganges nicht konzentriert, da eine Komponente, isoelektrische Punkte aufweisen, daß die Unter- welche im elektrischen Feld innerhalb eines bestimmten schiede der Beweglichkeiten aufeinanderfolgender Raumes gehalten ist, nach dem Trennungsvorgang auf Elektrolyte klein sind, daß der pH-Wert eines jeden Grund von Diffusionseffekten einen größeren Bereich Elektrolyts seinem isoelektrischen Punkt ent- einnehmen will. Daraus ergeben sich ungenügende spricht, daß der pH-Wert durch die verwendeten 25 Teilungsgrade.

entgegengesetzt wirkenden Ionen festgelegt wird, Zur isoelektrischen Ausrichtung des Elektrophorese-

daß die entgegengesetzt wirkenden Ionen puffernd Verfahrens wird dieses im allgemeinen in einer Miwirken und daß der Beweglichkeitsbereich der schung von amphoteren Elektrolyten durchgeführt, Elektrolytmischung derart gewählt wird, daß der wodurch ein stabiler pH-Gradient erzielt wird. Der Beweglichkeitsbereich der zu trennenden Kompo- 30 pH-Gradient ist selbststabilisierend im elektrischen nenten umfaßt wird. Feld, wodurch bei stationären Bedingungen keine

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Wanderung der Komponenten in der Elektrolytmizeichnet, daß die entgegengesetzt wirkenden Ionen schung erfolgt. Die Komponenten, welche bevorzugt derart gewählt werden, daß für die gewünschte Proteine sind, werden im elektrischen Feld auf Grund Trennung ein geeigneter pH-Gradient sich ergibt. 35 des pH-Gradienten getrennt, und zwar bei einer Ge-

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- schwindigkeit, welche durch die Beweglichkeit der zeichnet, daß die elektrisch geladenen zu trennen- Komponenten festgelegt ist. Die Beweglichkeit hängt den Komponenten Proteine oder Aminosäuren sind. vom pH-Wert der umgebenden Lösung ab. Ein Protein

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wandert mit einer hohen Geschwindigkeit, sobald es dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung der 40 sich in einem pH-Bereich befindet, der entfernt liegt amphoterischen Elektrolyte aus wenigstens drei von dem Bereich, welcher dem isoelektrischen Punkt polyprotischen Gruppen, von denen wenigstens des Proteins entspricht. Die Wanderungsgeschwindigeine eine Karboxylgruppe ist und eine ein basisches keit des Proteins beträgt Null, sobald der pH-Wert der Stickstoffatom ist, gebildet wird. umgebenden Lösung dem isoelektrischen Punkt des

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 45 Proteins entspricht. Durch die isoeleklrische Ausrichdadurch gekennzeichnet, daß die Trennlösung tung kann ein hoher Grad der Trennung erreicht werdurch ein Gel wenigstens bis zu einem bestimmten den. Die Trennungszonen sind im elektrischen Feld Grad stabilisiert wird. ausgerichtet. Die Anzahl der verwendbaren Proben ist

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, jedoch nicht allzu hoch, da sonst ein Niederschlag der dadurch gekennzeichnet, daß die Trennlösung 50 getrennten Komponenten erfolgt, wenn die Grenze der durch ein Pulvermedium stabilisiert wird und daß Lösbarkeit einer Komponente in einer Trennungszone die zu trennenden Komponenten elektrophoretisch überschritten wird. Weiterhin ergeben sich verschiedene gegen einen flüssigen Gegenstrom wandern. Probleme und Schwierigkeiten bei der Elution der einzelnen Trennungssäulen. Die Elution soll bevorzugt

55 ohne Beseitigung des elektrischen Feldes durchgeführt

werden, da sonst die Trennung durch Diffusionserscheinungen vermindert wird. Die Zonen wandern von den Säulen wie bei der normalen Elektrophorese.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Die Säulen sollen jedoch bezüglich des pH-Gradienten isotachophorelischen Trennen elektrisch geladener 60 und der Zonen entleert werden. Wenn der pH-Wert Komponenten einer Lösung, bei dem die Komponen- einer entsprechenden Zone festgelegt ist, ist es nicht ten in einem elektrischen Feld eine gleiche Ladungs- möglich, die Säule zu elutieren, ohne dabei die elektriwanderung mit einer Geschwindigkeit gleich der Ge- sehe Spannung zu beseitigen.

schwindigkeit der Komponenten mit der höchsten Bei einem dritten Elektrophoreseverfahren, dem isoBeweglichkeit aufweisen und bei dem die Komponen- 65 tachophoretischen Trennen, werden einige der obenten in Abhängigkeit von ihrer Beweglichkeit aufein- genannten Nachteile vermieden. Beim isotachophoretianderf olgende Bereiche bilden, wobei die Komponen- sehen Trennen (M artin &Everaerts, Analyten verschieden geladen sind und eine Wanderung ein- tica Chimica Acta, 38 [1967], S. 233 bis 237) wird ein