DE2117285C - Elektrophoreseverfahren - Google Patents

Description

lpktrisches Feld an ein Elektrolytsystem, welches die Bei Anwendung der Erfindung wird ein Protein wah-■ trennenden Komponenten enthält, gelegt. Das rend der Trennung geladen, d. h. die LosiicnKeit £Ltrol·!system enthält einen leitenden Elektrolyten wächst. Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit 1,1 einen Endelektrolyten. Der leitende Elektrolytist auf einer präparativen Basis verwendet werden und die te Komponente, welche die gleiche Ladung besitzt, 5 Anzahl der Proben ist nicht kritisch. Dadurch wird ein ⁶Tedt Komponenten, welche getrennt werden sollen. konzentrierender Effekt erzielt. Beim herkömmlichen Se ne Beweglichkeit ist jedoch höher. Die Ladung des isotachophoretischen Verfahren kann e.ne &hohung Indelekirolyten soll die gleiche sein wie eine des leiten- des Trennungsgrades durch em Gegenstrompnnzip din E! kuolyten. Die Beweglichkeit des Endelektro- erzielt werden. Dadurch vergrößert sich^ der^ Tren_y ^e"_en i_st jedoch geringer als die der zu trennenden „ nungsweg, welcher von ^ *™*™^£%Ζ%£_ Komponenten. Bei Gleichgewicht im System haben legt werden muß. In diesem Fall ™^BJ^e^.^hj¹'"^ £ Komponenten die gleiche Ladungswanderung bei trophoretische Lösung durch geeignete Mittel stob 1. ner Geschwindigkeit, welche gleich ist der Geschwin- siert werden, z. B. durca ein Pulver. Ein ^de™£se Sei·der Komponenten, welche die höchste Beweg- Stabilisierung kann auch dann angewende werden {$&< haben. Das bedeutet, daß alle Komponenten i₅ wenn kein Gegenstrompnnz,p verwende wird As Ϊ ;_r gleichen Geschwindigkeit wie der leitende Stabilisierungsmedium wird dann normalerweise ein Ski yfwandern und daß di! Komponenten aufein- Ge. z. B. ein Polyacrylam«^d verwende and-f. inde Zonen bilden, welche entsprechend der Wenn die Anzahl der Komponenten in der M

Ee M-.Jhkeit ctr Komponenten angeordnet sind. schung der amphoteren Elektrolyte aupichend is c_e"Γ':: die Komponenten entgegengesetzte Ladun- *o dann werden die zu trennenden Κ™Ρ°^η«£' durch ^_n Vl.;;.n wandern sogenannte entgegengesetzt wir- die amphoteren EIektrolyte ge en, und der T«n tw- ionen in entgegengesetzte Riehtuneen. Die nungsgrad wachst. Die Ligenscnanen ue^>

,,π welche erzFeU wfrd. hängt xon de~n Unter- können _ullrch Änderung der entgegenge«,ζ wirken- ;i.:,rbe/üglich der Beweglichkeiten der Kompo- den Ionen des leitenden lon, oder des End ^ ge I ab. Lieeen die Beweglichkeiten der Komponen- ,₅ ändert werden Der geeignete pH-Wert derEndl Zone

hinten lie.t. Lß eine Komponente derartige 30 durch die ™^^ ™%^S„l

Eieeiischaften aufweist, kann get) nnt festgestellt wer- so daß entweder ein. saure oder _a_

_dVn. Durch eine isoelektrische Ausrichtung werden die f ^!f^^urch ÄniTwaM des leitenden

verschiedenen Komponenten inner alb verschiedener el .ent erz el w,rd Durch gee^g" _kann

pH-Bereiche ausgerichtet, und die Proben bre.ten su:h Ions ^^^^„ΐΓη Mischung ampho-

entlang des gesamten pH-Gradienten aus. Ampho- 35 der,pH-Grad ent ^b ^m ^ ,ansehe Elektrolyte trennen die verschiedenen Proben- terer ^^kt™^^e _e^^ _{6 bis} g verändert werden.

"Ε)"· Aufgabe der Erfindung besteht darin, die ge- Dadurch^vird^aHs der CJ- Jr Trennung vernannten Nachteile der bekannten Verfahren zu be- ^^^'u^Z Lphoteren E.ektro-^Sel^S hid Zmensetzung haben

^^^u^Z Lpho

lim eingangs geschiiderten Verfahren besteht die lyten, welche verschiedene Zusammensetzung haben, Erfindung darin, daß eine Misc!;· ng amphoterer Elek- verändert werden. _Elektrolyte kann bei-

trolyte den Komponenten zugegeben wird, so daß ein De Mischung, amprοj ,schwedischen

wandernder Beweglichkeits- und pH-Gradient im sp.elswe.se ene sokhe « η w.es« elektrischen Feld entsteht, daß die ampl.oteren Elek- 45 Pa " sehr'^ ^²²J ^ ^C^J^e"_dcnen verschiedene troly te verschiedene Beweglichkeiten und ,sclektnschc ent ha\ ^^™°^ Stickstoffverbindungen

puffernd wirken und daß der Beweghchke.tsbere.ch ^^f»*¹^güchkeitsgradient erreicht der Elektrolytmischung derart gewählt wird, daß der Wenn eir1 pH und α g B ^^ ^

Beweglichkeitsbereich der zu trennenden Komponen- 55 werden »«U«« ™_{ ^₆I* der Unterschied des

^eitfÄung werden die Vorteile der isoejek- PH^-^Jtagnjjen^_Ξ^Κ trischen Ausrichtung bei einem isotachophoretischen ponenicn k e η ^-^ =h aut e ^^_

^Z:^^^=^= SiS^ ^{Jlches vora oradiewcn}

sehen Punkte nicht, wenn die entgegengesetzt w.rkcn- bedeckt ,st bhang^. _erfindungSgemäßen Ver-

oder andere amphoterische Bestandteile sind.

wenn Komponenten zu trennen sind, die keine UV-Strahlen absorbieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden im einzelnen an Hand verschiedener Ausführungsbeispiele beschrieben. Die Lösungen, welche bei den Aus- 5 führungsbeispielen verwendet werden, besitzen die folgende Zusammensetzung:

Gelpuffer, pH = 6,1
5,2 g Tris-Base
39 ml 1 M H₃PO₄
0,5 ml Tetramelhylethylendiamin Destilliertes Wasser zu 100 ml angemacht Gelpuffer, pH = 4,0
0,9 g Tris-Base
3,0 ml Eisessig

0,3 ml Tetramethylethylendiamin Destilliertes Wasser zu 100 ml angemacht Gelpuffer, pH — 6,6

6,0 g Tris-Base 39 ml M H₃PO₄

0,9 ml Tetramethylethylendiamin Destilliertes Wasser zu 100 ml angemacht Gelpuffcr, pH 4,5
2,0 g Tris-Base
3,0 ml Eisessig

0,3 ml Telramcthylethylendiamin Destilliertes Wasser zu 100 ml angemacht Gel-Losung 30°/₀ (Gewicht/Volumen) 2,9 g Acrylamid 1 g Bisacrylamid

Destilliertes Wasser zu 100 ml angemacht Kalalysatorlösung

4 mg Riboflavin

Destilliertes Wasser zu 100 ml angemacht Saccharose-Solution, 25% (Gewicht/Volumen) 25 g Saccharose

Dcstiü-crtcs Wasser zu 100 ml angemacht Elektroden-Puffer
30 mg Glyzin
6 g Tris-Base
Destilliertes Wasser zu 2000 ml angemacht

Beispiel 1

Line Mischung, bestehend aus 3 ml Gelpuffcr pH- 6,1; 3ml 30%ige Gcllösung, 3ml 25°/_oigc Saccharose-Lösung, 12 ml destilliertes Wasser und 3 ml Katalysatorlösiing ,wird in eine vertikale Eieklrophorcsesäule eingebracht. Vor dem Einbringen der Lösung wird ein Ende der Säule durch ein Filterpapier, welches mit einer geeigneten Mischung gesättigt ist, abgedichtet. Das Filterpapier wird beispielsweise mit einem Kuhststoflilm abgedichtet. Die Gclmischung wird während 45 Minuten durch eine UV-Strahlung polymerisiert, und es wird ein festes Gel erhalten. Auf den oberen Teil dieses Gels wird eine neue Lösung aufgebracht. Diese Lösung besteht aus 2 ml Gelpuffcr pll. 6,1, 2ml 30%igcr Gcllösung, 2ml 25°/_oigcr Saccharoselösung, 7 ml destilliertem Wasser, 2 ml Katalysatorlösiing und 1 ml Ampholin pH 4 bis S. Diese Ict/.tbczcichnetc Komponente ist eine kommerziell erhältliche Mischung, welche Aminokarbonsäurc enthält. Auch die Ict/.lbc7cichnctc Mischung wird durch UV-Strahlen polymerisiert. Schließlich wird eine dritte Mischung in die Säule eingebracht. Diese diille Mischung besteht aus einem Trisglycinpuffer, dies ist die gleiche Mischung, welche in der Eleklroilcnkanmicr wird.

Die Proteinprobe von 7 ml, welche getrennt weru.n soll wird mit 1,25 ml Gelpuffer pH = 6,1 und1 25 ml SacclTaros"Lösung gemischt und mit dest. l.erlem Was er auf 10 ml verdünnt. Die Komponenten der Proben werden ionisiert, und die Proben werden oer Elektrophoresesäule zugegeben. Die Probe w.rd bev κ-zugt auf den oberen Gel aufgebracht.

Es wird eine Spannung angelegt und d.e EIek.rophoreSe wird bei einem konstanten Strom von 10 :r,A iusSirt. Die Phosphationen, welche die Ionen m,t £ höchsten Beweglichkeit sind, w.rken als Ie.lenocr Elektrolyt während die Glycon-lonen den Endelek'.ro-Iyten Slden. Die Tris-lonen wirken als entgegengeht wirkende Ionen. Bei stationären Bedingungen wandern a Ie Ionen im System mit der gleichen Geschw.nd.gkeit wie die Phosphationen. D.e Komponenten der Probe werden mit dem Wandern des pH-Gradicnicn «trennt. Sobald die Säule eluiert ist, werden d.c mhal c fraktioniert und einer immi.nochcm.schcn I-rakionsanalyse unterzogen. Entsprechend dieser AnaI^ enthalten die Fraktionen Orosomucoid und Pr,-albumin. Diese werden aufgefangen und d.e M.sclumg wird ullraliltricrt und gegen destilliertes V. .isser /u einen Volumen von 10 ml diahsiert.

Beispiel 2

Dieses erf.ndungsgcmäßc Beispiel wird in dor gleichen Weise begonnen wie das erstgenannte Beispiel. Die Säule wird mit einer Mischung gefüllt. J-cichc aus 3 ml (lclpufTer pH 4 0. 3 ml 30·,,.^r Gcllösung. 3 ml 25«/_oiger Saccharoselosung 12 ml destilliertem Wasser und 3 ml Katalysalorlosung besteht Die Mischung wird durch UV-Strahlung polymerisiert, und es wird eine zweite Mischung beigemischt, welche aus 1 ml Ampholm* pH^ 3 bis 7. 1 5 ml 'Woiger Saccharose-Losung und 100 ml Ins-Basc besteht. 10 ml Probe von dem vorbeschnebencn Beispiel werden hinzugefügt. Weiterhin wird Inglycmpuffer hinzugefügt und die Elektrophorese wird gesl irtct Der Strom während dieses Ausfuhrungsbeispieles beträgt 7 mA. Die anschließende Analyse ergibt da« Mic Komponenten der Probe vollständig gcircnnt sind und daß das Orosomucoid und mehl das Prcalbumin immunochemisch rein geworden ist Wie im vorausgegangenen Ausführungsbcispicl wird die Fraktion vom Prealbumin gemischt und die Misduing ultraiiltricrt und dialysicrt.

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Beispiel 3

Zwei vom ersten Ausführungsbcispicl verschiedene Mischungen werden in die Säule eingebracht, und die eingebrachten Mischungen werden polymerisiert. An Stelle des Gelpuffers pH 6,1 dci zuerst verwendet worden ist, besitzt der nunmehr verwendete Puffer cin^ii pH-Wert -= 6,6. Des weiteren wird 1 ml Ampholin^Sj pH - 5 bis 7 verwendet. Die Probe wird gebildet von 9 ir.', einer Lösung, welche aus der Dialyse des zweiten Ausführungsbcispieles gewonnen wurde. Diese Probe wird mit 1,5 ml Gelpuffer pH = 6,6 und 1,5 ml 25⁰Zt₁IgCr Saccharosclösung verdünnt. Nach dieser Trennung wird chemisch rcini'S Pioalbiimin sowie Prcalbumin, welches einige Albumine enthält, gewonnen.

Beispiel 4

Dieses Ausführungsbcispicl wird zu dem Zweck ausgeführt, um den pll-Gradicnicn zu kontiollicrcii. Es wird daher keine Probe hinzugefügt. Die cxpci iincn-

teilen Bedingungen sind die gleichen wie im zweiten Ausführungsbcispicl. Das GclpuiTer hat einen pl 1-Wcrt von 4,5, und es wird Ampholin® pH =- 3 bis 8 verwendet. Das Experiment wird dann gestoppt bevor der leitende Elektrolyt, welcher Azetalioncn enthält, aus dem Gel hinauswandert. Das Gel wird von der Säule

cluicrl und in zehn Bereiche eingeteilt. Jeder Bereich wird mit destilliertem Wasser behandelt. Die p! !-Werte der einzelnen Zonen werden dann festgelegt, und es zeigt sich, daß sich die pH-Werte linear von 4,5 bis 8,5 entlang dem Gel ändern. Die Länge des Gels beträgt etwa 8 cm.

Claims (6)

ι 2 ander-entgegenwirkender Ionen in entgegengesetzten Patentansprüche:. Richtungen erfolgt. Es sind verschiedene Elektrophoreseverfahren zur

1. Verfahren zum isotachophoretischen Trennen Trennung von Komponenten bekannt. Bei einem einelektrisch geladener Komponenten einer Lösung, 5 fachen Elektrophoreseverfahren werden die Kompobei dem die Komponenten in einem elektrischen nenten durch Wanderung in einem elektrischen Feld Feld eine gleiche Ladungswanderung .mit einer voneinander getrennt. Die Trennung erfolgt auf Grund Geschwindigkeit gleich der Geschwindigkeit der der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten Komponenten mit der höchsten Beweglichkeit auf- der Komponenten im elektrischen Feld. Der Trenweisen und bei dem die Komponenten in Ab- io nungsgrad, der erreicht wird, hängt von der Länge des hängigkeit von ihrer Beweglichkeit aufeinander- Trennungsweges ab. Für einen langen Trennungsweg folgende Bereiche bilden, wobei die Komponenten ist jedoch eine ziemlich hohe Spannung erforderlich, verschieden geladen sind und eine Wanderung ein- um eine genügend hohe elektrische Feldstärke zu erander entgegenwirkender Ionen in entgegengesetz- zielen. Wenn die Trennung in Form von verschiedenen ten Richtungen erfolgt, d a d u r c h ge k e η n- 15 Trennungssäulen erfolgt, dann verlassen die verzeichnet, daß eine Mischung amphoterer schiedenen Substanzen die Säulen bei verschiedenen Elektrolyse den Komponenten zugegeben wird, so Geschwindigkeiten während des Elutionsverfahrcns. daß ein wandernder Beweglichkeits- und pH-Gra- Dies ist jedoch nicht erwünscht. Weiterhin bleiben die dient im elektrischen Feld entsteht, daß die arnpho- verschiedenen Komponenten während des Trennungsteren Elektroly te verschiedene Beweglichkeiten und 20 Vorganges nicht konzentriert, da eine Komponente, isoelektrische Punkte aufweisen, daß die Unter- welche im elektrischen Feld innerhalb eines bestimmten schiede der Beweglichkeiten aufeinanderfolgender Raumes gehalten ist, nach dem Trennungsvorgang auf Elektrolyse klein sind, daß der pH-Wert eines jeden Grund von Diffusionseffekten einen größeren Bereich Elektrolyts seinem isoelektrischen Punkt ent- einnehmen will. Daraus ergeben sich ungenügende spricht, daß der pH-Wert durch die verwendeten 25 Teilungsgrude.

entgegengesetzt wirkenden Ionen festgelegt wird. Zur isoelektrischen Ausrichtung des Elektrophorese-

daß die entgegengesetzt wirkenden Ionen puffernd Verfahrens wird dieses im allgemeinen in einer Miwirken und daß der Beweglichkeitsbereich der schung von amphoteren Elektrolyten durchgeführt, Elektrolytmischung derart gewählt wird, daß der wodurch ein stabiler pH-Gradient erzielt wird. Der Beweglkhkeitsbereich der zu tiennenden Kompo- 30 pH-Gradient ist selbststabilisierend im elektrischen nentei; u.nfaßt wird. Feld, wodurch bei stationären Bedingungen keine

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Wanderung der Komponenten in der Elektrolytmizeichnet, daß die entgegengesetzt wirkenden Ionen schung erfolgt. Die Komponenten, weiche bevorzugt derart gewählt werden, daß für die gewünschte Proteine sind, werden im elektrischen Feld auf Grund Trennung ein geeigneter pH-Gradient sich ergibt. 35 des pH-Gradienten getrennt, und zwar bei einer Ge-

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- schwindigkeit, welche durch die Beweglichkeit der zeichnet, daß die elektrisch geladenen zu trennen- Komponenten festgelegt ist. Die Beweglichkeit hängt den Komponenten Proteine oder Aminosäuren sind. vom pH-Wert der umgebenden Lösung ab. Ein Protein

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wandert mit einer hohen Geschwindigkeit, sobald es dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung der 40 sich in einem pH-Bereich befindet, der entfernt liegt amphoterischen Elektrolyte aus wenigstens drei von dem Bereich, welcher dem isoelektrischen Punkt polyprotischen Gruppen, von denen wenigstens des Proteins entspricht. Die Wanderungsgeschwindigei.ie eine Karboxylgruppe ist und eine ein basisches keit des Proteins beträgt Null, sobald der pH-Wert der Stickstoffatom ist, gebildet wird. umgebenden Lösung dem isoelektrischen Punkt des

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 45 Proteins entspricht. Durch die isoelektrische Ausrichdadurch gekennzeichnet, daß die Trenplösung tung kann ein hoher Grad der Trennung erreicht werdurch ein Gel wenigstens bis zu einem bestimmten den. Die Trennungszonen sind im elektrischen Feld Grad stabilisiert wird. ausgerichtet. Die Anzahl der verwendbaren Proben ist

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, jedoch nicht alizu hoch, da sonst ein Niederschlag der dadurch gekennzeichnet, daß die Trennlösung 50 getrennten Komponenten erfolgt, wenn die Grenze der durch ein Pulvermedium stabilisiert wird und daß Lösbarkeit einer Komponente in einer Trennungszone die zu trennenden Komponenten elektrophoretisch überschritten wird. Weiterhin ergeben sich verschiedene gegen einen flüssigen Gegenstrom wandern. Probleme und Schwierigkeiten bei der Elution der einzelnen Trennungssäulen. Die Elution soll bevorzugt

55 ohne Beseitigung des elektrischen Feldes durchgeführt

werden, da sonst die Trennung durch Diffusions-

erseheinungen vermindert wird. Die Zonen wandern von den Säulen wie bei der normalen Elektrophorese.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Die Säulen sollen jedoch bezüglich des pH-Gradienten isotachophoretischen Trennen elektrisch geladener 60 und der Zonen entleert werden. Wenn der pH-Wert Komponenten einer Lösung, bei dem die Komponen- einer entsprechenden Zone festgelegt ist, ist es nicht ten in einem elektrischen Feld eine gleiche Ladiings- möglich, die Säule zu elutieren, ohne dabei die elektriwandertmg mit einer Geschwindigkeit gleich der Ge- sehe Spannung zu beseitigen.

schwindigkeit der Komponenten mit der höchsten Bei einem dritten Elektrophoreseverfahren, dem isoBeweglichkeit aufweisen und bei dem die Komponen- 65 tachophoretischen Trennen, werden einige der obenten in Abhängigkeit von ihrer Beweglichkeit aufein- genanmon Nachteile vermieden. Beim isotachophoretianderfolgende Bereiche bilden, wobei die Komponen- sehen Trennen (Martin &Everaerts, Analyten verschieden geladen sind und eine Wanderung ein- tica Chimica Acta, 38 [1967], S. 233 bis 237) wird ein