DE2117285A1 - Elektrophoreseverfahren - Google Patents

Description

2117285 Patentanwalt Dipl.-Phy,Gerhard Liedl 8 München 22 Steinsdorfstr.21-22 MOUB

LKB-Produkter AB, S-161 25 Bromma l/Schweden

E lektrophoreseverfahren

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum isotachophoretischen λ

Trennen elektrisch geladener Komponenten einer Lösung, bei dem die Komponenten in einem elektrischen Feld eine gleiche Ladungswanderung mit einer Geschwindigkeit gleich der Geschwindigkeit der Komponenten mit der höchsten Beweglichkeit aufweisen und bei dem die Komponenten in Abhängigkeit von ihrer Beweglichkeit aufeinanderfolgende Bereiche bilden, wobei die Komponenten verschieden geladen sind und eine Wanderung einander entgegenwirkender Ionen in entgegengesetzten Richtun-N/Ho

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gen erfolgt.

Es sind verschiedene Elektrophoreseverfahren zur Trennung von Komponenten bekannt. Bei einem einfachen Elektrophorese verfahren werden die Komponenten durch Wanderung in einem elektrischen Feld voneinander getrennt. Die Trennung erfolgt aufgrund der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten der Komponenten im elektrischen Feld. Der Trennungsgradjder erreicht wird, hängt von der Länge des T rennungs weges ab. Für einen langen Trennungsweg ist jedoch eine ziemlich hohe Spannung erforderlich, um eine genügend hohe elektrische Feldstärke zu erzielen. Wenn die Trennung in Form von verschiedenen Trennungssäulen erfolgt, dann verlassen die verschiedenen Substanzen die Säulen bei verschiedenen Geschwindigkeiten während des ElutionsVerfahrens. Dies ist jedoch nicht erwünscht. Weiterhin bleiben die verschiedenen Komponenten während des Trennungsvorganges nicht konzentriert, da eine Komponente, welche im elektrischen Feld innerhalb eines bestimmten Raumes gehalten ist, nach dem T rennungs Vorgang aufgrund von Diffusionseffekten einen größeren Bereich einnehmen will. Daraus ergeben sich ungenügende Teilungsgrade.

Zur isoelektrischen Ausrichtung des Elektrophoreseverfahrens wird dieses im allgemeinen in einer Mischung von amphoteren Elektrolyten durchgeführt, wodurch ein stabiler pH-Gradient erzielt wird. Der pH-Gradient ist selbststabilisierend im elektrischen Feld, wodurch bei stationären Bedingungen keine Wanderung der Komponenten in der Elektrolytmischung erfolgt. Die Komponenten, welche bevorzugt Proteine sind, werden im elektrischen Feld und aufgrund des pH-Gradienten getrennt, und zwar bei einer Geschwindigkeit, welche durch die Beweglichkeit der Komponenten festgelegt ist. Die Beweglichkeit hängt vom pH-Wert der umgebenden Lösung ab. Ein Protein wandert mit einer hohen Geschwindigkeit, sobald es sich in einem pH-Bereich befindet, der entfernt liegt von dem

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Bereich, welcher dem isoelektrischen Punkt des Proteins entspricht. Die Wanderungsgeschwindigkeit des Proteins beträgt Null, sobald der pH-Wert der umgebenden Lösung dem isoelektrischen Punkt des Proteins entspricht. Durch die isoelektrische Ausrichtung kann ein hoher Grad der Trennung erreicht werden. Die Trennungszonen sind im elektrischen Feld ausgerichtet. Die Anzahl der verwendbaren Proben iet jedoch nicht allzu hoch, da sonst ein Niederschlag der getrennten Komponenten erfolgt, wenn die Grenze der Lösbarkeit einer Komponente in einer Trennungszone überschritten wird. Weiterhin ergeben sich verschiedene Probleme und Schwierigkeiten bei der Elution der einzelnen Trennungssäulen. Die Elution soll bevorzugt ohne Beseitigung des elektrischen Feldes durchgeführt werden, da sonst die Trennung durch Diffusionserscheinungen vermindert wird. Die Zonen wandern von den Säulen wie bei der normalen Elektrophorese. Die Säulen sollen jedoch bezüglich des pH-Gradienten und der Zonen entleert werden. Wenn der pH-Wert einer entsprechenden Zone festgelegt ist, ist es nicht möglich, die Säule zu elutieren, ohne dabei die elektrische Spannung zu beseitigen.

Bei einem dritten Elektrophoreseverfahren, dem isotachophoretischen Trennen, werden einige der obengenannten Nachteile vermieden. Beim isotachophoretischen Trennen (Martin & Everaerts, Analytica Chimica Acta 38 (1967 sid 233-7) wird ein elektrisches Feld an ein Elektrolytsystem, welches die zu trennenden Komponenten enthält, gelegt. Das Elektrolytsystem enthält einen leitenden Elektrolyten und einen Endelektrolyten. Der leitende Elektrolyt ist eine Komponente, welche die gleiche Ladung besitzt, wie die Komponenten, welche getrennt werden sollen. Seine Beweglichkeit ist jedoch höher. Die Ladung des Endelektrolyten soll die gleiche sein, wie eine des leitenden Elektrolyten. Die Beweglichkeit des Endelektrolyten ist jedoch geringer als die der zu trennenden Komponenten. Bei Gleichgewicht im System haben alle Komponenten die gleiche Ladungswanderung bei einer Geschwindigkeit, welche gleich ist der Geschwindigkeit der Korn-

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ponenten, welche die höchste Beweglichkeit haben. Das bedeutet, daß alle Komponenten mit der gleichen Geschwindigkeit wie der leitende Elektrolyt wandern und daß die Komponenten aufeinanderfolgende Zonen bilden, welche entsprechend der Beweglichkeit der Komponenten angeordnet sind, Besitzen die Komponenten entgegengesetzte Ladungen, dann wandern sogenannte entgegengesetzt wirkende Ionen in entgegengesetzte Richtungen. Die Trennung, welche erzielt wird, hängt von den Unterschieden bezüglich der Beweglichkeiten der Komponenten ab. Liegen die Beweglichkeiten der Komponenten nahe beieinander, ist es notwendig, daß eine weitere Komponente in das System eingebracht wird. Diese Komponente besitzt eine Beweglichkeit, welche zwischen den Beweglichkeiten der zu trennenden Komponenten liegt. Daß eine Komponente derartige Eigenschaften aufweist, kann getrennt festgestellt werden. Durch eine isoelektrische Ausrichtung werden die verschiedenen Komponenten innerhalb verschiedener pH-Bereiche ausgerichtet und die Proben breiten sich entlang des gesamten pH-Gradienten aus. Amphoterische Elektrolyte trennen die verschiedenen Probenzohen.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, die genannten Nachteile der bekannten Verfahren zu beseitigen.

Beim eingangs geschilderten Verfahren besteht die Erfindung darin, daß eine Mischung amphoterer Elektrolyte den Komponenten zugegeben wird, so daß ein wandernder Beweglichkeits- und pH-Gradient im elektrischen Feld entsteht, daß die amphoteren Elektrolyte verschiedene Beweglichkeiten und isoelektrische Punkte aufweisen, daß die Unterschiede der Beweglichkeiten aufeinanderfolgender Elektrolyte klein sind, daß der pH-Wert eines jeden Elektrolyts seinem isoelektrischen Punkt entspricht, daß der pH-Wert durch die verwendeten entgegengesetzt wirkenden Ionen festgelegt wird, daß die entgegengesetzt wirkenden Ionen puffernd wirken und daß der Beweglichkeitsbereich der Elektrolytmischung derart gewählt wird, daß der Beweglichkeitsbereich der zu trennenden Komponenten umfaßt wird.

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Bei der Erfindung werden die Vorteile der isoelektrigehew Ausrichtung bei einem isotachophoretischen Verfahren erzielt. Wenn die au trennenden Komponenten amphoterisch sind, so erreichen sie ÜL-re isoelektrischen Punkte nicht, wenn die entgegengesetzt wirkenden Ionen gemäß der Erfindung eine puffernde Wirkung ausüben. Dies wird dann erzielt, wenn eine schwache Säure und eine schwache Base zur Anwendung kommen. Die Trennung, welche sich ergibt, hängt von der Beweglichkeit der Kornpenenten und von den isoelektrischen Punkten ab, wenn die Komponenten Proteine oder andere amphoterische Bestandteile sind» Bei Anwendung der Erfindung wird ein Protein während der Trennung geladen, d.h. die Löslichkeit wächst. Das erfindüngsgemäße Verfahren kann somit auf ä

einer präparativen Basis verwendet werden und die Ansahl der Proben ist nicht kritisch. Dadurch wird ein konzentrierender Effekt .erzielt. Beim herkömmlichen isotachophoretischen Verfahren kann eine Erhöhung des Trennungsgrades durch ein Gegenstromprinzip erzielt werden. Dadurch vergrößert sich der Trennungsweg, welcher von den Komponenten zurückgelegt werden muß. In diesem Fall muß jedoch die elektrophoretisch^ Lösung durch geeignete Mittel stabilisiert werden, z. B, durch ein Pulver. Eine derartige Stabilisierung kann auch dann angewendet werden, wenn kein Gegenstromprinzip verwendet wird. Als Stabilisierimgsmedium wird dann normalerweise ein Gel z.B. ein Polyacrylamid-Gel verwendet.

Wenn die Anzahl der Komponenten in der Mischung der amphoteren Elektrolyte ausreichend ist, darin werden die zu trennenden Komponenten durch die amphoteren Elektrolyte getrennt und der Trennungsgrad wächst. Die Eigenschaften des Systems können durch Änderung der entgegengesetzt wirkenden Ionen des leitenden Ions oder des End-Ions geändert werden. Der geeignete pH-Wert der End-Zone ist bestimmt durch die Beweglichkeit und Konzentration der entgegengesetzt wirkenden Ionen, nämlich der leitenden Ione und der begrenzenden bzw. End-Ionen. Die Mischung der amphoteren Elektrolyte wird durch die entgegengesetzt wirkenden

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Ionen ionisiert, so daß entweder eine baure oder eine basische Mischung erzielt wird_? d.h. daß ein wandernder pH-Gradient erzielt wird. Durch geeignete Wahl des leitenden Ions und der entgegengesetzt wirkenden Ionen kann der pH-Gradient einer bestimmt en Mischung amphoterer Elektrolyte beispielsweise von einem pH-Wert 5-7 bis zu einem pH-Wert β - S verändert werden. Dadurch wird gleichfalls der Grad der Trennung verändert. Der pH-Gradient kann gleichfalls durch Verwendung einer Mischung aus amphotereE Elektrolyten,, welche verschiedene Zusammensetzung haben, verändert werden.

Die Mischung amphoterer Elektrolyt® kann beispielsweise eine solch© seüij wie sie in der schwedischen Patentschrift 314 22"? beschrieben ist. Diese Mischung enthält Ammok&rboxy !säuren, denen verschiedene pyrolitische Gruppen^ wie z.B« Stickstoff verbindungen und Kar boxy !verbindungen angesetzt sind. Es können jedoch auch andere geeignete Mischungen verwendet werden. Es eignen sieh Mischungen, welche eine große Anzahl von Komponenten enthalten, die verschiedene Substitutionsgrade aufweisen. Ss eignen sieh auch Komponentengemisehe, welche an sich bekannt sind. Wenn ein pH- und Bewegiiehkeitsgradient erreicht werden soll, ist es notwendig«, daß die Ansah! der Komponenten groß ist, so daß der Unterschied des pH- und Beweglichkeitsgradienten zwischen der« Komponenten klein'ist. Sich auf eine bestimmte Zahl der Komponenten festzulegen«, ist jedoch nicht erforderlich, da dies vom Intervall, ■ welches vom Gradienten bedeckt ist, abhängt.

Werden entsprechend dem erfindungsgSBiäßen "/erfahren Proteine voneinander getrennt, ist es erwünscht«, sin® Mischung ans amphotaren Elektrolyten zu verwenden, welches kern© ultravioletten Strahlen absorbiert, die innerhalb des Absorbiionsfcs-reiehes eier Proteine liegen. Andererseits kann es jedoch von Vorteil sein eine UV-absorbierende Lo-"

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sung zu verwenden, wenn Komponenten zu trennen sind, die keine UV-Strahlen absorbieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden im einzelnen anhand verschiedener Ausführungsbeispiele beschrieben. Die Lösungen, welche bei den Ausführungsbeispielen verwendet werden, besitzen die folgende Zusammensetzung:

Gelbuffer, pH = 6,1 5, 2 g Tris-Base 39 ml 1 M H„PO

4
0, 5 ml Tetramethy!ethylendiamin

Dest. Wasser zu 100 ml angemacht

Gelbuffer, pH = 4,0

0,9 g Tris-Base 3,0 ml Eisessig

0,3 ml Tetramethylethylendiamin Dest. Wasser zu 100 ml angemacht

Gelbuffer, pH = 6, 6

6,0 g Tris-Base "

39 ml M H₃PO₄

0,9 ml Tetramethylethylendiamin

Dest. Wasser zu 100 ml angemacht Gelduffer, pH = 4,5

2,0 g Tris-Base 3,0 ml Eisessig

0, 3 ml Tetramethylethylendiamin

Dest. Wasser zu 100 ml angemacht

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Gel-Lösung 30 % (Gewicht/Volumen)

2,9 g Acrylamid

1 g Bisacrylamid

Dest. Wasser zu 100 ml angemacht

Katalysatorlösung

4 mg Riboflavin

Dest. Wasser zu 100 ml angemacht

Saccharose-Solution, 25 % (Gewicht/Volumen)

25 g Saccharose

Dest. Wasser zu 100 ml angemacht

Elektroden-Buffer

30 mg Glyzin

6gTris-Base

Dest. Wasser zu 2000 ml angemacht

Beispiel 1

Eine Mischung bestehend aus 3 ml Gelbuffer pH = 6,1; 3 ml 30 %ige Gellösung, 3 ml 25 %ige Saccharose-Lösung, 12 ml destilliertes Wasser und 3 ml Katalysatorlösung werden in eine vertikale Elektrophorese säule eingebracht. Vor dem Einbringen der Lösung wird ein Ende der Säule durch ein Filterpapier, welches mit einer geeigneten Mischung gesättigt ist, abgedichtet. Das Filterpapier wird beispielsweise mit einem Kunststoffilm abgedichtet. Die Gel-Mischung wird während 45 Minuten durch eine UV-Strahlung polymerisiert und es wird ein festes Gel erhalten. Auf den oberen Teil dieses Gels wird eine neue Lösung aufgebracht. Diese Lösung besteht aus .2 ml Gelbuffer pH = 6,1, 2 ml 30 %iger Gellösung, 2 ml 25 %iger Saccharoselösung, 7 ml destilliertem Wasser, 2 ml Katalysatorlösung und 1 ml Ampholin pH = 4 - 8. Diese letztbezeichnete

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Komponente ist eine kommerziell erhältliche Mischung, welche Aminokarbonsäure enthält. Auch die letztbezeichnete Mischung wird durch UV-Strahlen polymerisiert. Schließlich wird eine dritte Mischung in die Säule eingebracht. Diese dritte Mischung besteht aus einem Trisglycinbuffer, dies ist die gleiche Mischung, welche in der E iektrodenkarnmer verwendet wird.

Die Proteinprobe von 7 ml, welche getrennt werden soll, wird mit 1,25 ml Gelbuffer pH = 6,1 und 1,25 ml Saccharoselösung gemischt und mit destilliertem Wasser auf 10 ml verdünnt. Die Komponenten der Proben werden λ ionisiert und die Proben werden der Elektrophoresesäule zugegeben. Die Probe wird bevorzugt auf den oberen Gel aufgebracht.

Es wird eine Spannung angelegt und die Elektrophorese wird bei einem konstanten Strom von 10 mA ausgeführt. Die Phosphationen, welche die Ionen mit der höchsten Beweglichkeit sind, wirken als leitender Elektrolyt während die Glycon-Ionen den Endelektrolyten bilden. Die Tris-Ionen wirken als entgegengesetzt wirkende Ionen. Bei stationären Bedingungen wandern alle Ionen im System mit der gleichen Geschwindigkeit wie die Phosphationen. Die Komponenten der Probe werden mit dem Wandern des pH-Gradienten getrennt. Sobald die Säule eluiert ist werden die Inhalte ä

fraktioniert und einer immunochemischen Fraktionsanalyse unterzogen. Entsprechend dieser Analyse enthalten die Fralrtionen Orosomucoid und Prealbumin. Diese werden aufgefangen und die Mischung wird ultrafiltriert und gegen destilliertes Wasser zu einem Volumen von 10 ml dialisiert.

Beispiel 2

Dieses erfindungsgemäße Beispiel wird in der gleichen Weise begonnen, wie das erstgenannte Beispiel. Die Säule wird mit einer Mischung ge-

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füllt, welche aus 3 ml Gelbuffer pH = 4, 0, S ml 30 ^iger Gellösung, 3 ml 25 ^iger Saccharoselösung, 12 ml destilliertem Wasser und 3 ml Katalysatorlösung besteht. Die Mis chung wird durch UV-Strahlung polymerisiert und es wird eine zweite Mischung beigemischt, welche aus 1 ml

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Ampholin pH = 3 - 7, 1, 5 ml 25 ^iger Saecharoselösurig und 100 ml Tris-Base besteht. Π ml Probe von dem vorbesehriebenen Beispiel werden hinzugefügt. Weiterhin wird Triglycinbuffer hinzugefügt und die Elektrophorese wird gestartet. Der Strom während dieses Ausführungsbeispieles beträgt 7 mA. Die anschließende Analyse ergibt, daß die Komponenten der Probe vollständig getrennt sind und daß das Orosomucoid und nicht das Prealbumin immunochemisch rein geworden ist. Wie im vorausgegangenen Ausführungsbeispiel wird die Fraktion vom Prealbumin gemischt und die Mischung ultrafiltriert und dialysiert.

Beispiel 3

Zwei vom ersten Ausführungsbeispiel verschiedene Mischungen werden in die Säule eingebracht und die eingebrachten Mischungen werden polymerisiert. Anstelle des Gelbuffers pH = 6,1 der zuerst verwendet worden ist, besitzt der nunmehr verwendete Buffer einen pH-Wert = 6, 6. Des weiteren wird 1 ml Ampholin pH = 5 - 7 verwendet. Die Probe wird gebildet von 9 ml einer Lösung, welche aus der Dialyse des zweiten Ausführungsbeispieles gewonnen wurde. Diese Probe wird mit 1, 5 ml Gelbuffer pH = 6, 6 und 1, 5 ml 25 %iger Saccharoselösung verdünnt. Nach dieser Trennung wird chemisch reines Prealbumin sowie Prealbumin, welches einige Albumine enthält, gewonnen.

Beispiel 4

Dieses Ausführungsbeispiel wird zu dem Zweck ausgeführt, um den pH-Gradienten zu kontrollieren. Es wird daher keine Probe hinzugefügt. Die experimentellen Bedingungen sind die gleichen wie im zweiten Ausführungsbeispiel. Das Gelbuffer hat einen pH-Wert von 4, 5 und es wird

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Ampholin pH = 3 - 8 verwendet. Das Experiment wird dann gestoppt bevor der leitende Elektrolyt, welcher Azetationen enthält, aus dem Gel hinauswandert. Das Gel wird von der Säule eluiert und in 10 Bereiche eingeteilt. Jeder Bereich wird mit destilliertem Wasser behandelt. Die pH-Werte der einzelnen Zonen werden dann festgelegt und es zeigt sich, daß sich die pH-Werte linear von 4, 5 bis 8, 5 entlang dem Gel ändern, Die Länge des Gels beträgt etwa 8 cm.

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Claims (6)

Patentansprüche

1. Verfahren zum isotachophoretischen Trennen elektrisch geladener Komponenten einer Lösung, bei dem die Komponenten in einem elektrischen Feld eine gleiche Ladungswanderung mit einer Geschwindigkeit gleich der Geschwindigkeit der Komponenten mit der höchsten Beweglichkeit aufweisen und bei dem die Komponentenabhängigkeit von ihrer Beweglichkeit aufeinanderfolgende Bereiche bilden, wobei die Komponenten verschieden geladen sind und eine Wanderung einander entgegenwirkender Ionen in entgegengesetzten Richtungen erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mischung amphoterer Elektrolyte den Komponenten zugegeben wird, so daß ein wandernder Beweglichkeits- und pH-Gradient im elektrischen Feld entsteht, daß die amphoteren Elektrolyte verschiedene Beweglichkeiten und isoelektrische Punkte aufweisen, daß die Unterschiede der Beweglichkeiten aufeinanderfolgender Elektrolyte klein sind, daß der pH-Wert eines jeden Elektrolyts seinem isoelektrischen Punkt entspricht, daß der pH-Wert durch die verwendeten entgegengesetzt wirkenden Ionen festgelegt wird, daß die entgegengesetzt wirkenden Ionen buffernd wirken und daß der Beweglichkeitsbereich der Elektrolytmischung derart gewählt wird, daß der Beweglichkeitsbereich der zu trennenden Komponenten umfaßt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die entgegengesetzt wirkenden Ionen derart gewählt werden, daß für die gewünschte Trennung ein geeigneter pH-Gradient sich ergibt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrisch geladenen zu trennenden Komponenten Proteine oder Aminosäuren sind.

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4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung der amphoterischen Elektrolyte aus wenigstens drei polyprotischen Gruppen, von denen wenigstens eine eine Karboxylgruppe ist und eine ein basisches Stickstoffatom ist, gebildet wird.

5. "Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennlösung durch ein Gel wenigstens bis zu einem bestimmten Grad stabilisiert wird.'

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet,' daß die Trennlösung durch ein Pulvermedium stabilisiert wird und daß die zu trennenden Komponenten elektrophoretisch gegen einen flüssigen Gegenstrom wandern.

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