DE2532779A1

DE2532779A1 - Verfahren zum elektroquantitativen bestimmen von proteinen

Info

Publication number: DE2532779A1
Application number: DE19752532779
Authority: DE
Inventors: Kingdon Lou
Original assignee: ICL SCIENT
Current assignee: ICL SCIENT
Priority date: 1974-07-23
Filing date: 1975-07-22
Publication date: 1976-02-12
Also published as: FR2280076B1; US3912610A; GB1492899A; FR2280076A1; DE2532779B2; DE2532779C3; CA1049402A; JPS5149090A; JPS5529385B2

Description

1 BERLIN 33 SMUNCHEN 80

Augiwte-Viktorla-StraBe66 _n_ nilCOUl/C S DADTMCD PienzenaueretraB·2

Pat-Anw. Dr. Ing. Ruschke LJT. KUoOni\t 04 Γ*ΑΚΙΙΝ£Ι\ Pat.-Anw.Dlpl.-lng.

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Olaf Ruschke ΓΑΙ CIN IAINVVALI C ,98032*

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Quadratur Berlin Qudadrahir München TELEX: 183786 __a , ., _1Q7c TELEX: 522767

München, den 1*· ^JU» ¹³'³

,'I/SCIMTIKHC, Fountain Valley / Kalifornien / Vo St. A.

"Verfallren zum elektroquantitativen Bestimmen von Proteinen"

Die Erfindung betrifft die elektrophoretisch^ Bestimmung von Proteinen und insbesondere ein Verfahren zum Erhöhen der Elelctromobilität von idlutproteinen, um die quantitative Bestimmung mit Hilfe von Elektrophorese-Verfahren zu verbessern.

Die quantitative Bestimmung von'Protein in Blutserum ist als diagnostisches Mittel beim Behandeln von Krankheiten zunehmend bedeutend gewordene Das v/esen der Erfindung ist die quantitative Bestimmung der Immunglobulinen des Blutserums von besonderem Interesse.

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Von den zurzeit verfügbaren Verfahren zum. quantitativen Bestimmen der eiweissartigen Bestandteile des Blutserums sind Elektrophorese-Verfahren als Diagnosemittel bevorzugt, da sie relativ schnell arbeiten und in den meisten labor- und Hospitaleinrichtungen angewandt werden können. In allgemeinen umfassen diese Verfahren das !Trennen von Bestandteilen auf der Grundlage der Unterschiede der Blektromobilität der eiweissartigeh Bestandteile in einem elektrischen Feld. Ein als Diagnosemittel zur Bestimmung von Immunglobulinen bevorzugtes Elektrophoreseveriahren ist Ξ1ektroimmunodiffusion,. Bei diesem Verfahren wird eine Probe in einer Grube angeordnet, die in einer Gelschicht ausgebildet ist, und ein elektrischer Strom wird durch das Gel geschickt, wodurch verursacht wird, daß die Serumbestandteile wandern. Das Gel enthält einen Antikörper, der für den Bestandteil spezifisch ist, welcher gesucht wird. Da der gesuchte Bestandteil durch das Gel wandert, wird ein Niederschlag gebildet, wenn das zweckmässige Verhältnis von Bestandteil zu Antikörper erreicht ist. Die Ausscheidung ist normalerweise sichtbar und bildet eine raketenartige Zone, die sich von der Grube zu einer Elektrode erstreckt, unter normalen Versuchsbedingungen der Anode. Durch Messen der Rakete und Vergleichen der Messung mit einer Messung von Raketen bekannter Muster wird die Menge des Bestandteiles bestimmt.

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Bestimmte Serumbestandteile sind jedoch schwierig quantitativ bestimmbar wegen der relativ geringen Elektromobilität unter den besten Bedingungen. Solche Bestandteile umfassen die sogenannten G-ammaglobuline wie beispielsweise Globulin A, H, Gr, D und B. Diese Proteine werden auch als Immunglobuline (Ig) wegen ihrer Krankheit verhindernden Funktion bezeichnet} sie zeigen eine sehr geringe Bewegung während der Elektrophorese und bilden somit keine Raketen, deren Messungen konzentrationsabhängig sind. Eine Bewegung fehlt wahrscheinlich auf G-rund der Tatsache, daß unter den Bedingungen der Elektrophorese der pH-Wert zwischen 8,2 und 8,6 gehalten wird, und die Gesamtänderungen an den Molekülen sind fast ausgeglichen. So ist während der Elektrophorese eine geringe Bewegung von IgG und IgM zu der Anode vorhanden, jedoch so gering, daß das praktische Messen der raketenförmigen Niederschlagzone höchst ungenau gemacht wird.

Es sind zahlreiche Versuche zum Verbessern der Elektromobilität der Immunglobuline, insbesondere IgG, beschrieben worden. So beschreibt beispielsweise Weeke in "Scand. J. ölin₀ Lab. Invest." 21, (1968) Seite 551 ein Verfahren zum Verbessern des Nachweises von Immunglobulin durch Behandeln der Antiimmunglobuline, um die Beweglichkeit des Antigens in dem Gel zu ändern. Ein ähnliches Verfahren ist in der TJS-PS 3 558 459

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be schrieb en, wobei das Antiimmunglobulin mit einem Aminogruppen-Blockiermittel,wie beispielsweise Bernsteinsäureanhydrid, behandelt wird, um die Elektromobilität des Antigens zu verbessern. Diese Verfahren erfordern 18 - 2o Stunden zum Zubereiten des Antigens und erfordern höchst geübtes und erfahrenes Personal, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.

Ein anderer Versuch umfaßt die Behandlung des Immunglobulins selbst durch Reduzieren de» positiven Ladung, um seine Elektromobilität zu erhöhen» Stephan und Prahm empfehlen in "Z. Klin, Chem, Klin, Biochem," 9 (1971) Seite 224» eine Behandlung mit B-propriolakton. Jedoch ist eine solche Behandlung zeitraubend und kann die Antigenwirksamkeit des Immunglobulins verändern. Es ist auch eine Behandlung der Immunglobuline mit Formaldehyd als wirksamen Ladungsschwächer vorgeschlagen worden.

Die vorliegende Erfindung betrifft das Erhöhen der Elektromobilität eines eiweissartigen Materials, welches normalerweise eine geringe Beweglichkeit unter den Elektrophorese-Bedingungen zeigt. Gemäß der Erfindung wird ein fieaktionsprodukt gebildet, das ein elektromobiles, eiweissartiges Material, ein Dialdehyd und das proteinhaltige Material umfaßt, dessen Elektromobilität erhöht werden soll. Auf diese "Weise wird die Elektromobilität des Reaktionsproduktes im wesentlichen gleich derjenigen des am meisten elektromobilen

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proteinhaltigen Bestandteiles. Gleichzeitig wird die Antiken-Wirksamkeit der proteinhaltigen Bestandteile des Reaktionsproduktes nicht beeinträchtigt, so daß wenigstens eine der
proteinhaltigen Bestandteile des Reaktionsproduktes quantitativ durch Ausscheidungsreaktion mit einem Antikörper bestimmt werden kann, welcher für dieses Teil spezifisch ist.

Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung anhand der beigefügten Zeichnung»

Die Zeichnung zeigt eine Immunoelektrophoreseplatte, wobei
Ausscheidungsbänder und der G-rad der Elektromobilität von
nicht behänd eitern Immunglobulin und Albumin und Immunglobulin gezeigt ist, das gemäss Erfindung behandelt worden ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft das Erhöhen der Elektromobil! tat von eiweissartigen Materialien wie beispielsweise Immunglobuline durch eine Verkettungsreaktion mit einem
elektromobilen Protein durch die Wirkung eines Dialdehyds.
Beispielsweise weist Albumin .einen hohen G-rad an Elektromobilität unter den Versuchsbedingungen auf, die normalerweise bei der elektrophoretischen Analyse von Blutserum vorhanden sind.

Es wurde gefunden, daß ein Immunglobulin wie beispielsweise

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I₀G oder IgM an Albumin gekettet und davon getragen v/erden kann oder auf andere V/eise die Elektromobilitat ues Albuminmoleküls erreicht. Als sehr wesentlich wurde _oefunden, dass die Verkettun^sreaktion relativ schnell ist und leicht durchzuführen ist. Es gibt keinen wesentlichen Verlust an Antigen-Aktivität an dem i'eil des so verketteten Immunglobulins, und das Albumin stört nicht die quantitative Bestimmung des Immunglobulins mit der Ausnahme, dass es dessen Elektromobilitat wesentlich erhöht.

Wegen der Wichtigkeit des Niveaus des Antigens im Blutserum bei der Behandlung von Krankheit o. dgl. wird die Beschreibung der Erfindung auf das Erhöhen der Elektromobilitat von Globulinen in Blutplasma gerichtet. Jedoch sei hervorgehoben, dass die Prinzipien der Erfindung bei der elektrophoretischen Analyse anderer Proteine auch anwendbar sind, deren Elektromobilitat erhöht werden muss, um eine effektive quantitative elektrophoretische Bestimmung zu erzielen. Demgemäss schafft zusätzlich zum verbesserten Diagnoseverfahren für medizinische Zwecke die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Verbessern industrieller und Laborverfahren für die Anzeige und quantitative Bestimmung von Proteinen.

'Die Analyse der Blutproteine wird normalerweise an Blutserum durchgeführt, das ist Blutplasma, aus welchem der

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J?asergehalt durch Gerinnen entfernt worden ist. Albumin, welches ein höchst elektrotaobiles Protein ist, ist ein
dominierender Bestandteil der Proteinfraktion des Blut- · serums. Die Globuline, die auch als Itnmunglobuline und
Antigene bezeichnet werden, sind eine zweite wesentliche Proteingruppe, die in dem Blutserum enthalten ist. Wahrscheinlich ist die am meisten untersuchte Proteinfraktion des Serums die Gamma-Globulinfraktion, welche u.a. den Körper gegen Krankheiten wie beispielsweise Masern und Hepatitis schützt. Die Gamma-Globuline sind als IgA, IgG, IgE, IgM und IgD klassifiziert. Die Globuline werden entsprechend den Unterschieden in der Elektromobilität klassifiziert, wobei IgG das am wenigsten bewegliche ist.

IgG, das normalerweise von grösstem Interesse ist, ist im normalen menschlichen Serum in einem Verhältnis von ungefähr 1 Teil IgG zu ungefähr 4-5 Teilen Albumin vorhanden. Abweichungen von dem normalen Bereich entweder zur hohen oder niedrigen Seite signalisieren eine Abnormalität. Folglich diente die quantitative Bestimmung von IgG als eine Zusatzeinrichtung bei der Diagnose und war nützlich beim Überwachen der Therapiewirksamkeit und zum Nachprüfen von
Prognosen bei Krankheitsstadien. Ähnlicherweise können Abweichungen von den Niveaus anderer Globuline Annorualitäten anzeigen, obwohl die Punktion anderer Globuline und einiger Proteine im Blutserum noch nicht ^anz verstanden wird.

Bei dem gewünschten pH-Bereich von 8,2 bis 8,6 ist die Molekularladung der Gamma-Globuline, insbesondere IgG im wesentlichen ausgeglichen, und die Globuline sind nur gering elektromobil. Unter diesen Bedingungen ist eine ■elektrophoretische quantitative Bestimmung der Gammaglobuline nicht möglich, obwohl andere proteinhaltige Bestandteile des Blutplasmas wie beispielsweise Serumalbumin höchst beweglich sind.

Demzufolge wurde bei der quantitativen Bestimmung von IgG und anderen Globulinen mittels Elektrophoreseverfahren gemäss der vorliegenden Erfindung gefunden, dass Albumin höchst wirksam als elektromobiler Bestandteil des Reaktionsproduktes ist. Zusätzlich zu der grossen Elektromobilität ist Albumin bei der quantitativen Bestimmung anderer Proteine nicht schädigend. Wenn Blutproteine untersucht werden, ist die Verwendung von Albumin höchst vorteilhaft, weil es natürlich als wesentlicher Teil des Blutproteins vorhanden ist. Bei Hypergammaglobulinen ist jedoch das Zusetzen von gereinigtem Albumin zu dem Serum, welches untersucht wird, wünschenswert, um ein Verhältnis von wenigstens 4-5 Teilen Albumin zu ungefähr 1 Teil IgG zu gewährleisten.

Die genaue Struktur des Reaktionsproduktes, das in Übereinstimmung mit der Erfindung gebildet ist, ist nicht vollständig verstanden. Es wird jedoch angenommen, dass ein oder mehrere Moleküle des elektromobil^*! Protein! an

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ein Molekül des weniger beweglichen Proteins gekettet wird. Auf diese V/eise trägt das elektroraobile Molekül oder die Moleküle unter dem Einfluss eines elektrischen Stromes das weniger bewegliche Molekül und verleiht dem weni_oer bewe_olichen Molekül im wesentlichen die Elektrornobilität der beweglichen Moleküle.

Zur 3ildun_o- des elektromobilen lieaktionsproduktes wird ein bifunktionelles Reagens als Verkettungsmittel verwendet. Mfunktionelle Jieagentien wie beispielsweise bifunfctionelle Alkylreste unä Arylhalogenide v/ie beispielsv/eise p, p-difluor-ti], a-dinitrodiplienylsulfon, bifu'aktionelle Imidoester v/ie beispielsv/eise Diäthylmaloniniidat-dihydrochlorid, Diaethyladipimidat-dialdehyde und dergl. sind nützlich beim Verketten des elektromobilen Proteinmoleküls mit dem weniger bev/eglichen Proteinmolekül.

Df s ara meisten bevorzugte Yerkettungsmittel, das verwendet

wird, um das Eeaktionsprodukt zu bilden, ist das Dialdehyd von Glutarsäure, Glutaraldehyd (HGO(CH₂)^CHu). Glutaraldehyd ist für seine !Fähigkeit bekannt, intra- unu intermolekulare Ketten mit Proteinmolekülen zu* bilden, und das Reaktions-

produkt als solches bildet keinen i'eil der Erfindung. Glutaraldehyd ist jedoch bevorzugt, weil die gev/üiaochte Verkettungsreaktiou schnell bei Raumtemperatur eintritt und Glutaraldehyd wasserlöslich ist, so dass es in wässrigen Pufferlösungen gelöst werden kann, so dass der pH-Wert des Reaktionsgemisches leicht gesteuert werden kann.

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Während des Bildens des Reaktionsproduktes mit dem Verkettungsmittel ist es wesentlich, dass die Konzentration des Verkettungsmittels unterhalb des Polymergel bildenden Konzentrates gehalten wird. Bei Glutaraldehyd werden ausgezeichnete Ergebnisse erhalten, wenn die abschliessende Glutaraldehydkonzentration in der Versuchsprobe zwischen ungefähr 0,005 und ungefähr 0,02 M gehalten wird, wobei keine besonderen Reaktionsbedingungen erforderlich sind. Somit wird beim Durchführen der Verkettungsreaktion eine wässrige Glutaraldehydlösung mit der Versuchsprobe gemischt, und das Gemisch wird während einer ausreichenden Zeit gehalten, um die Verkettungsreaktion zu bewirken. Die erforderliche Periode zum Bewirken der Reaktion wurde als in der Grössenordnung von 15 Minuten liegend bestimmt, obwohl es bevorzugt ist, dass das Reaktionsgemisch zwischen 30 Minuten und 1 Stunde gehalten wird, um eine vollständige Verkettungsreaktion zu gewährleisten.

Beim Zubereiten der wässrigen Glutaraldehydlösung ist es notwendig, den pH-Wert der Lösung vor ihrem Zumischen zu der Proteintestprobe einzustellen, da Glutaraldehyd normalerweise einen pH-Wert von ungefähr 3,0 aufweist. Dies kann durch Einstellen des Lösungs-pH-Wertes mit einem geeigneten alkalischen Mittel wie beispielsweise Natriumhydroxyd oder vorzugsweise durch Zubereiten der Glutaraldehydlösung in einem alkalischen Puffer ausge-

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führt werden. Die Lösung sollte auf einen pH-Wert gebracht werden, bei welchem die Elektrophorese auszuführen ist, und bei der Elektrophorese von Blutprotein lisgt der bevorzugte Bereich zwischen 7,5 und 8,6.

Wie es bekannt ist, ist die Wahl einer besonderen Pufferlösung von vielen Faktoren abhängig, nicht zuletzt von der Natur des zu bestimmenden Proteins. Die Ionenkraft des Puffers wird vorzugsweise so gering gehalten, als dies mit seiner Pufferkapazität und dem Proteinauflösungsvermögen verträglich ist, um den Stromfluss auf ein Minimum herabzusetzen. Die meisten Puffersysteme, die bei der elektrophoretischen Proteinbestimmung verwendet werden, sind Systeme, die eine wässrige lösung von Natriumbarbitalum und eine Säure wie beispielsweise Chlorwasserstoff-Acetyl- oder Barbitursäure umfassen. Ein ausgezeichnetes Puffersystein ist eine wässrige Lösung von Tris(Hydroxymethyl)aminomethan, Borsäure und dem Dinatriumsalz von Äthyldiamin-Tetraacetylsäure.

Beim Ausführen der quantitativen Bestimmung von Proteinen können verschiedene gut bekannte Verfahren angewandt werden, um die erhöhte Elektromobilität, die normalerweise unbeweglichen oder etwas beweglichen Proteinmolekülen verliehen wird, ergibt eine wesentliche Verbesserung der quantitativen Bestimmung solcher Proteine. Der Ausdruck »Elektroquantitation», wie er hier verwendet wird, wird

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bei bekannten elektrophoretischen Proteinverfahren verwandt, wie beispielsweise klassische freie Elektrophorese (liselius-Verfahren) Papierelektrophorese, Immunoelektrophorese und Elektroimmunodiffusion.

Das letzte Verfahren wird auf einem gepufferten Gel durchgeführt, in welchem für das Protein oder die Proteine, die zu bestimmen sind, spezifische Antikörper angeordnet sind. Das zu bestimmende Protein wandert aufgrund des elektrischen Stromes, und wenn das Verhältnis von Protein zu Antikörper günstig wirkt, bildet das zu bestimmende Protein eine normal sichtbare Ausscheidung mit dem Antikörper im Gel. In gewissen Fällen ist eine zusätzliche Belastungs- oder Vergrösserungsstufe erforderlich, um die Ausscheidungsstufe sichtbar zu machen, wie dies in der Elektrophoresetechnik bekannt ist.

Die Abmessungen der Ausscheidungszone stehen in direkter Beziehung zu der Menge des Proteins in der Probe, und entsprechend serienmässigen Verfahren werden Serien, die bekannte Kengen an zu bestimmendem Protein aufweisen, gleichzeitig ait der unbekannten Menge durchgeführt.

Immunoelektrophorese unterscheidet sich von Blektroimaunodiffusion darin, dass bei ersterer der Antikörper nicht in dem Gel fixiert ist, sondern ihe gestattet wird,

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in das Gel zu diffundieren, nachdem das Protein der Probe zunächst mittels Elektrophorese abgetrennt ist.■

Die folgenden Beispiele beschreiben die Art, in welcher die Elektromobilität gewisser Proteine vergrössert wird und die so erhaltenen nützlichen Ergebnisse. Obwohl die Beispiele besondere Ausführungsformen beschreiben, soll die Erfindung nicht auf diese Ausführungsforaen beschränkt sein.

Beispiel 1

Um die Erhöhung der Elektromobilität von Globulinen im Blutserum zu demonstrieren, wurde die folgende Immunoelektrophorese-Bestimmung mit Serumalbumin, IgG, Serumalbumin und IgG in salziger Lösung durchgeführt, Serum-Albumin und IgG zur Reaktion mit Glutaraldehyd gebracht und Serumalbumin und IgG mit Formalin zur Reaktion gebracht.

Serumalbumin wurde von der "Blood Research Laboratory" erhalten und als Lot 458 identifiziert. Das IgG wurde von"Armour Laboratories" erhalten und als Lot ^ 1210503 identifiziert.

Der Antikörper, der bei diesem Versuch verwendet wurde, war Pferdeanti-(Human)-Gesamtserum, das von "ICL Scientific, Fountain Valley, Kalifornien", hergestellt

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Eine Elektrophorese-Glasplatte wurde mit einer 0,8 mm dicken Gelschicht beschichtet, welche 1,5 $ Agarose in einer BarMtalum-Pufferlösung umfasst, der pH-Wert war 8.6. Wie in der Zeichnung gezeigt ist, wurde die Gelschicht 11 mit im rechten Winkel ausgerichteten, im Abstand voneinander angeordneten Testgruben 12 versehen. Die Gruben 12 wurden durch längliche sich longitudinal erstreckende Rinnen 13 getrennt, um dazwischen parallel verlaufende Streifen A,B,G, D und E zu begrenzen.

Verdünnungslösungen wurden zubereitet, bestehend aus Salzsäure (9 $> NaCl) 1 # w/v Glutaraldehyd in dem Barbitalampuffer (pH-Wert 8,6) und 1 $ w/v Formalin in dem Barbitalumpuffer (pH-Wert 8,6).

Die folgenden Versuohslösungen wurden zubereitet:

Probe A - Albumin, IgG, Formalin 1:1:4

Probe B - Albumin, IgG, Glutaraldehydlösung 1:1:4

Probe C - Albumin, IgG, salzige Säure 1:1:4 Probe D - IgG, Glutaraldehydlösung 1:4

Probe E - Albumin, Glutaraldehydlösung 1 :4

Teile von -jeder Versuchslösung wurden in den Gruben 12 der entsprechenden Streifen angeordnet, die auf der Elektrophoreseplatte gebildet sind. Die Platte wurde zwischen einem Paar von Behältern gestützt, welche die Barbitalura-

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Pufferlösung enthält, und Papierdochte wurden verwendet, um eine leitende Brücke zwischen den Behältern und der Gelschicht 11 auf der Platte zu schaffen. Die Behälter waren an eine elektrische Stromquelle, wie dies gezeigt ist, angeschlossen, wobei der rechte Behälter die Anode und der linke Behälter die Kathode war. Die Elektrophorese wurde durchgeführt, indem 100 Volt Gleichstrom durch die Gelschicht 11 während einer Periode von 2,5 Stunden geschickt wurde. Der gesamte Stromfluss betrug 40 MilliaapSre.

Bei Beendigung der Elektrophorese wurde der Stromfluss unterbrochen, und die Rinnen 13 wurden mit dem Pferdanti-(human)-Gesamtserum gefüllt, welches mit destilliertem Wasser im Verhältnis von 1:4 Serum/Wasser verdünnt war. Das Antiserum konnte in das Gel diffundieren, bis Ausscheidungslinien sichtbar wurden, wobei angezeigt wurde, dass die Reaktion zwischen den Testproteinen und Antikörper im wesentlichen vollständig war.

Wie in der Zeichnung gezeigt ist, wurdeimittels der Elektrophorese die Proteinfraktionen longitudinal längs den Streifen A bis E getrennt, und die Diffusion des Antikörpers aus den Rinnen 13 bildete Ausscheidungslinien an dem Punkt, wo das Verhältnis von Antikörper zu Protein hooh genug war, um eine sichtbare Ausscheidung zu bilden.

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Der Streifen A wies zwei eindeutige Ausscheidungslinien mit dem Albumin auf, welches am meisten elektromobil ist und am nächsten an die Anode gezogen wurde. Das IgG- wurde im wesentlichen nicht von dem Strom bewegt» Es war klar, daß das Formalin keinen Verkettungseffekt auf das Albumin und IgG- hatte«.

Der Streifen B zeigte einen einzigen Ausscheidungsbereich entfernt von der Grube 12 zu der Anode hin. Dies zeigte eine einzige höchstmobile Proteingruppe an_o Es war keine Spur eines anderen .Ausscheidungsbereiches an dem Streifen vorhanden, was eine Verkettung zwischen Albumin und IgG bewies O

Der Streifen C zeigte zwei deutliche Ausscheidungsbereiche, wobei ein Protein unbewegt blieb, so daß die Ausscheidungszone im wesentlichen an der Grube 12 angeordnet war.

Der Streifen D zeigte eine Ausscheidungszone geringer anodischer Mobilitätο Das Glutaraldehyd scheint die Elektromobilität von IgG um einen schwachen Grad zu verbessern»

Der Streifen E zeigte eine einzige Ausscheidungszone für das Albumine

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Aus den Versuchsergebnissen ist es ersichtlich, daß die Elektromobil!tat von Albumin in der Gegenwart von Glutaraldehyd als auch in der Gegenwart von Salzlösung im wesentlichen gleich bleibtο Eine Kombination von IgG mit Albumin ohne ein Verkettungsmittel hat einen geringen oder keinen Effekt auf die Elektromobilität von Proteine In der Gegenwart eines Verkettungsmittels wird das IgG mit dem Albumin während der Elektrophorese getragen₀ Eine Reaktion von IgG und Glutaraldehyd allein schafft lediglich einen geringen Effekt auf die Elektromobilität von IgG, vermutlich auf Grund des Glutaraldehyds, das beim Reagieren mit positiv geladenen Plätzen an dem IgG-Molekül die positive Ladung des Moleküls reduzierte

Beispiel II

Teile von 12 Proben von Humangesamtserum wurden für die Elektroimmunodiffusion zubereitet durch Mischen mit einer gepufferten Glutaraldehydlösung in dem Verhältnis von 4*1 Serum/Glutaraldehydlösung. Die Glutaraldehydlösung wurde durch Lösen von 0,1 gm Glutaraldehyd in 1oo ml einer wässrigen Pufferlösung zubereitet, die besteht aus:

Tris(hydroxymethyl)aminomethan 27,7 gm

Borsäure 7,6 gm

Di-Natriumäthylendiamintetraacetylsäure 1,8 gm Destilliertes Watter, qs 1,0 Liter

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Die sich ergebende Pufferlösung hatte einen pH-Wert von 8,6 und ein Leitvermögen von 2,ο micro MHOo Die Serum/Glutaraldehydlösungen wurden während 3o Minuten gehalten, um eine Vervollständigung der Verkettungsreaktion zwischen dem IgG und Albumin zu gewährleisten,.

Ein Teil der Pufferlösung wurde mit destilliertem Wasser verdünnt, bis eine Meßanzeige eine Leitfähigkeit von 1,o micro MHO anzeigte» Zu der verdünnten Pufferlösung wurden 1,5 Gewo$ Agarose zugesetzt. Das Agarose-Puffergemisch wurde über einem Wasserbad erhitzt, bis Agarose in dem Puffer gelöst war. Die Lösung konnte auf ungefähr 45°C abkühleno

Das Elektrophoresegel wurde zubereitet, indem 1 Teil Pferdanti(human) = IgG-serum, hergestellt von "ICL Scientific, Fountain Valley, Kalifornien", mit 4 Teilen destilliertem Wasser verdünnt wurde.

Das verdünnte Antiserum (o,5 ml) wurde mit 2 ml der Agarose-Puf ferlösung kombiniert und die insgesamt 2,5 ml in eine 5 χ 7,5 cm Formplatte gegossen und durch Abkühlen auf Raumtemperatur gehärtet. Probengruben wurden längs des kleinen Durchmessers der Platte in der Nähe des Kathodenendes angeordnete 5 Probengruben wurden an der Platte mit einer Grube

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für die Probe und 4 Gruben für Vergleichsproben bekannter IgG--Konzentration in Übereinstimmung gebracht, die mit Serumalbumin über Glutaraldehyd verkettet waren» Die Vergleichsproben wurden mit im Handel erhältlichem IgG und Serumalbumin zubereitete

Eine Platte wurde in der beschriebenen Weise für jede der 12 Gesamtserumproben zubereitete Jede Platte wurde in einer Elektrophoresekammer angeordnet und der Elektrophorese während einer Periode von 3 Stunden bei einem Potential bei 1oo bis 12o Volt unterworfen. Die Platten wurden in Reihen von drei betrieben und der Gesamtstrom, der für die drei Platten erzeugt wurde, war in der Grössenordnung von 1o bis 2o Milliampere· Die Anoden- und Kathodenkammern enthielten die unverdünnte Tris-Pufferlösung, Leitvermögen 2 micro MHO»

Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die Platten mit salziger Lösung gewaschene Gut bestimmte Ausscheidungsraketen, die sich zu der Anode hin erstrecken, wurden sowohl von der Vergleichsprobe, als auch der zu untersuchenden Probe erzeugt. Der Abstand von der Mitte der Grube zu der Spitze der Raketenform wurde gemessen, und die Menge an IgG jeder Probe wurde aus einem Diagramm des Abstandes von der Grube zu der Raketenspitze gegen IgG Konzentration

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von Standardproben bestimmt, die mit jeder Probe parallel untersucnf ^würden·

Um diese Ergebnisse in Wechselbeziehung zu bringen, wurden die Sera auch der quantitativen Bestimmung durch herkömmliche Radial-Impmodiffusipnsverfahren unterworfen» Für diese Versuche war es nicht notwendig, das Serumalbumin und IgG des Serums mit einem Verkettungsmittel reagieren zu lassen, weil die Elektromobil!tat von IgG kein kritischer Faktor ist.
Ein 1,f #, Aragose-Gel, welches die gleiche Konzentration an Anti-(human)-IgG-Serum wie das Elektrophoresegel aufweist, wurde als ein Gel für die Immunodiffusion verwendet» Es
waren 18 - 2o Stunden erforderlich, um die Immunodiffusion zu beenden. .

Die Ergebnisse beider Verfahren sind nachfolgend wiedergegeben»

Serum- Nummer	Radial-Immunodiffu sion (mö6)	Elektroimmuno- diffusion (mg#)
1	1130	1375
2	1300	1250
3	1525	1300
4	930	480
5	840	870
6	840	870

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Serum- Nummer	Radial-Immunodiffu sion (mg$)	Elektro immuno- diffusion (mg#)
7	1375	1450
8	975	1140
9	1025	1250
10	1200	1050
11	1075	1150
12	1850	1625

Mit Ausnahme der Serum-Nummer 4 zeigen die Ergebnisse eine Wechselbeziehung zwischen den beiden Verfahren« Es ist
keine Anzeige vorhanden, daß die Verkettungsreaktion einen bedeutenden Effekt auf die Antigen-Aktivität des IgG- zu
dem Ausmaß hat, daß sie die quantitative elektrophoretisch^ Bestimmung von IgG störte

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur elektro quantitativen Bestimmung von Proteinen, die normalerweise lediglich etwas anodisch elektromobil sind, dadurch gekennzeichnet, daß ein reaktionsfähiges Gemisch des Proteins, eines anodisch elektromobilen Proteins und einer wirksamen Menge eines bifunktionellen Verkettungsmittels gebildet wird, daß dieses Gemisch während einer ausreichenden Zeit gehalten wird, um das Reaktionsprodukt des Proteins, des Verkettungsmittels und des elektromobilen Proteins zu bilden, und daß dieses Reaktionsprodukt zu einem Behälter überführt wird, der mit einer leitenden Matrix versehen ist, durch welche ein elektrischer Strom fliese en kann, so daß das Reaktionsprodukt elektrophoretisch in der Matrix bewegt wird und eine Elektromobilität aufweist, die im wesentlichen gleich derjenigen des elektromobilen Proteins ist.

2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des bifunktionellen Verkettungsmittels geringer als die Menge ist, die mit Protein reagiert, um ein Proteingel zu bild en ο

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3·) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verkettungsmittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Alkyl- und Arylhalogeniden, bifunktionejlen Imidoestern und niedrigerem Alkyldialdehyden besteht·

4o) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verkettungsmittel Glutaraldehyd ist.

5c) Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Glutaraldehyds in dem Reaktionsgemisch in dem Bereich zwischen 0,05 M und ungefähr 0,02 M liegt.

6.) Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Glutanaldehyds in dem Reaktionsgemisch 0,008 M beträgtο

7·) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das anodisch elektromobile Protein Albumin ist.

8.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsprodukt Immunglobulin umfaßte

9o) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunglobulin aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus IgA, IgG, IgD, IgM, IgE und Gemischen daraus besteht.

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10o) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch während einer Periode von wenigstens 15 Minuten gehalten wird, um das Reaktionsprodukt zu bilden,,

11 o) Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß das leitende Mittel eine wässrige Glutaraldehydlösung ist.

12o) Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das anodisch elektromobile Protein wässriges Albumin istο

13ο) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil des Reaktionsproduktes zu einer Elektrophoreseplatte überführt wird, welche eine gepufferte Agarose-Gelschieht einschliessüch einer wirksamen Menge eines Antikörpers umfaßt, der spezifisch für dieses Immunglabulin ist, und daß diese Platte elektrisch mit einer Anode und Kathode verbunden wird und Strom durch die Gelschicht geschickt wird, welche den Seil des Reaktionsproduktes enthält, so daß das Reaktionsprodukt au der Anode hin mit einer größeren Geschwindigkeit als der Antikörper wandert und den Antikörper berührt, wobei der Antikörper mit dem Immunglobulin reagiert, um eine Präzipitat-Zone in dem Gel zu bilden, und daß die Abmessungen der Präzipität-Zone proportional der Menge des Immunglobulins in der Probe sind.

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14·) Verfahren nach. Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der Glutaraldehydlösung eingestellt und zwischen ungefähr 7»5 und 8,6 gehalten wird.

15o) Verfahren nach Anspruch 14» dadurch gekennzeichnet, daß die Glutaraldehydlösung Glutaraldehyd in einer wässrigen
Pufferlösung mit einem pH-Wert von zwischen 7 »5 und 8,6 umfaßt»

16o) Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert 8,6 ist.

17o) Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Serumalbumin zu Immunglohulin wenigstens
ungefähr 4»1 ist.

«ι
18o) Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß

das Reaktions gemisch gänzlich Blutserum umfaßt»

19o) Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktions gemisch gänzlich humanes Blutserum umfaßte

20o) Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß das Agarosegel 1,5 Gew.# Agarose in Lösung umfaßt, die auf

einen pH-Wert von zwischen 7,5 und 8,6 gepuffert ist.
w

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21o) Verfahren nach Anspruch 2o, dadurch gekennzeichnet, daß die Agarosegellö'sung auf einen pH-Wert von 8,6 und ein Leitvermögen von 1 micro MHO gepuffert wird ο

22.) Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer für das gepufferte Agarosegel umfaßt * Iris(hydroxymethyl)aminomethan 27,7 gm Borsäure 7»6 gm

D i-Natriumäthylendiamint etraac etylsäure 1,8 gm

und ausreichend destilliertes Wasser,

um die Leitfähigkeit des Puffers auf 1,o micro MHO zu bringen»

23ο) Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an destilliertem Fasser annähernd 1000 ml beträgt»

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