DE2112730A1 - Stabilisierung von neutraler Protease in alkalische Protease enthaltenden Enzymegemischen unter Verwendung alkalischer Proteaseinhibitoren - Google Patents

Stabilisierung von neutraler Protease in alkalische Protease enthaltenden Enzymegemischen unter Verwendung alkalischer Proteaseinhibitoren

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DE2112730A1
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Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF
PATENTANWÄLTE MÜNCHEN 2, HILBLESTRASSE
Dr. Berg Dipl.-Ing. Stopf, 8 München 2, Hllblestro6e 20 Ihr Zeichen Unser Zeichen
Anwaltsakte 20 698
Be/τα
Monsanto Company St. Louis U.S.A.
Datum
17. März
" Stabilisierung von neutraler Protease in alkalische
Protease enthaltenden Enzymgemisohen unter Verwendung alkalischer Proteaseinhibitoren "
Neutrale Protease, im Gemisch mit alkalischer Protease,
verliert besonders in Form von Lösungen oder Pasten beim Stehenlassen viel von ihrer proteolytischen Wirksamkeit.
11-21-0140
109841/1662
Eine solche Abnahme der Wirksamkeit, besonders in verdünnten lösungen bei geringen Konzentrationen, wurde bisher der Autolyse, "Denaturierung oder Proteolyse durch die in dem T-e« misch vorhandene alkalische Protease oder anderen Faktoren, zugeschrieben. 15Is wurde nunmehr festgestellt, dass diese Abnahme im wesentlichen allein der Proteolyse der neutralen Protease durch die vorhandene alkalische Protease zuzuschreiben ist. Während die einfachste Lösung dieser Schwierigkeit zu entgehen, darin bestehen würde, die alkalische Protease zu entfernen und damit eine derartige Proteolyse zu vermeiden, ist dies nicht möglich, wenn man die alkalische proteolytische Wirksamkeit in dem Gemisch für dessen vn6verwendung· zu erhalten wünscht, wie beispielsweise bei einem Additiv für ein Wäschedetergens, da man die entft-ute oder inhibierte alkalische Protease dem G-emisch vor einer solchen Verwendung wieder zuführen müsste. Es wurde nunmehr gefund^^, dass bestimmte alkalische Proteaseinhibitoren hinsichtlich ihrer Wirkung reversibel sind und bei höheren Konzentrationen wirksame alkalische Proteaseinhibitoren sind, .iedocn als solche Inhibitoren bei geringeren Konzentrationen unwirksam sir.d, zum Beispiel nach Verdünnung, so dass die Verdünnung in wirk samer Weise verwendet werden kann, die alkalische Proteasewirksamkeit in einem solchen G-emisch wieder herzustellen, sofern es durch die relativ hohen Konzentrationen derartiger Alkaliproteaseinhibitoren inhibiert wurde.
- 3 BAD ORIGINAL
1 0 9 8 A 1 / 1 6 S 2
"1Ke vorliegende TSrfindunsr beinhal+et demgeinäss die Verwendung einer? reversiblen alkalischen Proteaseinhibitors, wie Fartoffelinhihitors und dergleichen, zur wirksamen Inhibieruni'"" der au kai i sehe"": Protease in einem Gemisch, das neutrale und alkali srille Protease enthält, wodurch die vorhandene neu— t-^al e P^o+esssp s+aMlisiert ivirdc "Her Inhibitor ist in relativ hohen ν οι ·? entr ation en 7ur Tnhibierunp vorhanden, iedoch wi ^i ^ie ^onz-p'tration des Tnhibitors vor der "^erweniun-r des "^nzym^emischs so verdünnt, dass dessen alkalische Protease— Wirksamkeit wieder hergestellt wird. Die Erfindung betrifft weiterhin ne^+rale und alkalische Proteasegemische, die rniit einem solchen reversiblen alkalischen Proteaseinhibitor stabilisiert sind. "Die stabilisierten neutralen und alkalischen Proteasep-emische sind wertvoll als Additive in Wäschedeteriüi Spülmit ein.
^s können reversible alkalische Proteaseinhibitoren, wie der kartoffel!nhilsi+or· und dergleichen, einverleibt werden einem relativ konzentrierten n-emisch von proteolyti sehen Enzymen, die neutral-31 und alkalische Protease enthalten, wie sie durch " "ikrofcien - Fermentation unter Verwendung des ^akteriums Bazillus sub ti Ils hergestellt werden, wobei man gleichzeitig· "inzymwirksaTikeit in den konzentrierten T-emisehen nach ausgedehnter Tareruns konserviert.
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BAD ORIGJNAL
Vorzugsweise ist der reversible alkalische Proteaseinhibitor in dem .Gemisch in einer Konzentration im Bereich von ungefähr 50 bis ungefähr 1000 Gew.$, bezogen auf das Gewicht der alkalischen Protease und vorzugsweise im Bereich von ungefähr 100 bis ungefähr 600 Gew.% vorhanden.
Das in dieser Weise formulierte erhaltene Gemisch kann dann als Additiv Wäschedetergenzien und Spülmitteln einverleibt werden, wobei das Additiv gewöhnlich in einer Menge im Bereich von ungefähr 0,03 bis ungefähr 1 Gew.% vorhanden ist.
Das stabilisierte, den reversiblen Inhibitor enthaltende Enzymgemisch kann nach Wunsch in Form einer Flüssigkeit, Paste oder trockene Granulate hergestellt werden. Der Inhibitor wird vorzugsweise gemeinsam mit dem Bnzymgemisch ausgefällt oder sprühgetrocknet. Bei Verwendung wird das Inhibitor enthaltende Enzym so mit Wasser verdünnt, dass in der Arbeitslösung die Konzentratxon des Inhibitors nicht mehr ausreichend hoch ist, seine inhibierende Wirkung auf die vorhandene alkalische Protease auszuüben. Vorzugsweise ist die In« hibitorkonzentration in der Arbeitslösung geringer als ungefähr 1 Gew.^ und insbesondere geringer als ungefähr 0,1
Der für die Durchführung der Erfindung geeignete Kartoffelinhibitor kann aus hellen Kartoffeln (Solanum tuberosum) mittels Extraktion an getrocknetem, lyophilisiertem weissem Kartoffel - Saft erhalten werden. Die Extraktion des
- 5 ~ 109841/1662
.Kartoffelinhibitors kann geeigneterweise· nach Verfahren erreicht werden, wie sie von Ryan, C. A. und Balls, A. K. Proc. N.A.S. 48, 1840 (1962), und Balls, A. K. und Byan,
0. Α., J. Biol. Chem. 238, Fo. 9,2976 (1963) beschrieben sind.
Zur weiteren Verbesserung der Lagerungsfähigkeit oder Haltbarkeit der Enzymgemische kann der pH - Wert des erhaltenen Gemischs aus Inhibitor und den Enzymen auf den sauren Bereich, d.h., weniger als 7 und vorzugsweise auf einen Wert im Be- ' reich von ungefähr 5t5 bis ungefähr 6 dadurch eingestellt ™ werden, dass man Säure, wie eine schwache organische Säure (Essigsäure), dem Gemisch zugibt. In ähnlicher Weise können Calciumionen dem Inhibitor enthaltenden Gemisch in Form eines Calciumsalzes, wie Calciumacetat, Calciumchlorid, Calciumnitrat und dergleichen, zugegeben werden, um auf diese Weise eine Calcium - Ionenkonzentration in dem Gemisch im Bereich von ungefähr 10~li bis ungefähr 10 M zu bilden«.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfin«-· dung, wobei die Proteaseaktivität bestimmt wurde durch das allgemein bekannte Casein - Digestionsverfahren und ebenso unter Verfolgen der Hydrolysenanfangsgeschwindigkeit von Benzyloxycarbonylglycin - ρ - nitrophenylester (Z-GIy ONP)β
Bei dem Caseindigestionsverfahren katalysiert die alkalische
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Protease die Caseinhydrolyse eine bestimmte Zeitdauer bei pH 10; die Reaktion wird dann durch Zugabe von Trichloressigsäure angehalten und die erhaltene Lösung filtriert. Die Farbe des !"iltrats wird durch 3?olin - Phenolreagens entwickelt und die Höhe der Enzymwirksamkeit v/ird durch Messen des AbsorbtionsVermögens des Filtrate bei einer Wellenlänge von 280 lau. bestimmte Das Caseindige3tionsverfahren ist eingehender in Journal of General Physiology 30, 291 (1947) und in Methods of Enzymology 2, 33, Academic Press M.Y., (1955) beschrieben.
Die Anfangahydrolysengeschwindigkeit von Z - GIy OHP wurde in pH 6,1 wässrigem Phosphat-Puffer bei einer Wellenlänge von 345 mu, einer Ionenkraft von 0,0^ u^id einer Substratkonzentration von 5 χ 10 M verfolgt.
Beispiel 1. Reversible Inhibieruno' von alkalischer Protease durch den Kartoffelinhibitor
Es wurde eine wässrige Lösung mit einem Gehalt von 0,033 mg alkalische Protease pro ml hergestellt. Ein ml der hergestellten Lösung (Lösung A) wurde einer Caseinstandardlö- .^ pH 10 zugegeben. Es wurde spektrophotometrisch festgestellt, daß die Abs orbt ions fähigke it bei 280 mi sich um eine O.D. (optische Dichte)-einheit erhöhte (iOO$ige Enzymaktivität).
Ein ml der gleichen hergestellten Lösung von alkalischer Protease, die jedoch ungefähr 0,1 mg Kartoffelinhibitor ent-
109841/1662 ~7"
hielt (Lösung B) y/urde hinsichtlich der alkalischen Proteaseaktivitat in der gleichen Weise wie die Lösung A geprüft. Als Ab3orbtionsfu.higK.cit bei 280 mju ,vurde eine Erhöhung von 0,390 O.D.-einheiten (39^ige Enz/maktivität) beobachtet.
Danach wurden 0,2 ml der Lösung A 1 ml T.7asser zugegeben und geprüft. Die Absorbtionsfähigkeit bei 280 πιμ erhöhte sich um 0,140 O.D.-einheiten (100 $ige Enzymaktivität). Der gleiche Versuch mit 0,2 ml der Losung B, wozu man 1 ml Wasser zugegeben hatte, zeigte eine Absorbtionserhöhung Λ von 0,100 O.D.-einheiten bei 280 mju (71$ige Enzymwirksamkeit).
Die vorausgehenden Zahlen zeigen, daß ine 1 : 5 Verdünnung der Kartoffelinhibit r-rkonze, ■■:·■:? ti on im wesentlichen die alkalische Protease reaktiviert.
Beispiel 2 Reversible Inhibierung alkalischer ^roceaae mittels Kartoffelinhibitor
Eine wässrige Lösung mit 0,0052 mg alkalischer Protease ä pro ml (Lösung A) wurde hergestellt und spektrophotometrisch unter Verwendung von Z-GIy ONP, wie oben angegeben, geprüft. Es wurde festgestellt, daß die Anfangshydrolysen-Geschwindigkeitskonstanten 11 χ 10~p Min war (iOQ#ige Enzymakt ivit ät).
Eine zweite wässrige Lösung wurde hergestellt, wobei diese
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-8-BAD ORiGtNAL
3,2 mg alkalische Protease und 0,032 mg kristallinen Kartof« felinhibitor pro ml enthielt (Lösung B). Diese Lösung wurde in der gleichen Weise geprüft. Die Anfangshydrolysen - Geschwindigkeitskonstante "betrug 1,58 χ 10 .Min" (14^-ige Enzymaktivität)o
-5 Danach wurden 2 ml des Substrats in 5 x 10 M Phosphat Puffer einem ml der Lösung B zugegeben und geprüft. Die An- " fangshydrolysen - G-eschwindigkeitskonstante betrug nach ent«
—3 -1
sprechender Korrektur wegen der Verdünnung 5,0 χ 10 Min
(46^-ige Enzymwirksamkeit).
Die vorausgehenden Versuchsergebnisse zeigen, dass eine 1:2 Verdünnung der Inhibitorkonzentration eine 46$-ige alkalische Proteaseaktivität wiederherstellt.
Beispiel 3 Stabilisierung von neutraler Protease in einem Enzymgemisch mittels einem Kartoffelinhibitor
Eine wässerige Lösung wurde mit einem G-ehalt von 5,27 mg B. subtilis - Enzymgemisch pro ml in tris - HCl Puffer (Lösung A) hergestellt. Das Gemisch enthielt neutrale Protease, alkalische Protease und Amylase. Die Enzymwirksamkeit betrug 1 χ 10 Einheiten/g neutrale Protease, 4,8 χ 10 Sinheiten/g alkalische· Protease und 3,5 x 10 ■ Einheiten/g Amylase.
Eine zweite Lösung wurde in ähnlicher Weise hergestellt, wobei sie jedoch zusätzlich 27,7 mg teilgereinigten Kartoffel-
. - 9 ~ 109841/1662
inhibitor pro ml enthielt (Lösung B).
Die neutrale Proteaseaktivität der Lösung wurde spektrophotometrisch bei 345 mju· mit 3-(2-Furylakryloyl)-glycyl-L-leucinamid-(FAGLA)-substrat geprüft, wie dies von Feder, "A Spectrophotometry Assay for Neutral Protease", Biochemical and Biophysical Research Communications 32, No. 2, 326 - 332 (1968) beschrieben ist. Die Lösungen wurden dauernd bei Zimmertemperatur gelagert. Die erhaltenen Werte sind als Reaktionsgeschwindigkeitskonstante der ersten M Ordnung, k, ausgedrückt, wobei diese proportional ist der neutralen Proteasekonzentration in der Lösung.
Die Lösung A hatte anfangs einen k-Wert von 9»59 x ΙΟ"4" Sek und die Lösung B einen k-Wert von 9,28 χ 10"^ Sek , wobei jeder dieser Werte eine 100%ige neutrale Proteaseaktivität anzeigt.
Nach 146 Stunden Lagerung wies die Lösung A einen k-Wert
von 1,96 χ 10~4 Sek" (21% der Anfangsaktivität) auf, wäh- ä
rend die Lösung B einen k-Wert von 9,24 x 10"^ Sek" (100%ige Aktivität) hatte.
Nach 191 Stunden hatte die Lösung A keine feststellbare neutrale Proteaseaktivität, während die Lösung B einen k-Wert von 9,51 χ 10"4 Sek"1 (iOO%ige Aktivität) aufwies.
Nach 287 Stunden wies die Lösung B einen k-Wert von 6,47 x 109 8-41/1662
- ίο -
10"4 Sek"1 (71^-ige Aktivität) auf.
Die vorausgehenden Beispiele dienen ausschliesi;lioh der Erläuterung. "Die Erfindung "beinhaltet alle Abweichungen und Änderungen, soweit diese von dem allgemeinen danken Gebrauch machen.
109841/1662 - n -

Claims (4)

Patentansprüche :
1. ^erfahren zur Stabilisierung von neutraler Protease in einem Gemisch mit einem Gehalt neutraler Protease und alkalischer Protease dadurch gekennzeichnet, dass man dem Gemisch eine wirksame Menge eines reversiblen alkalischen Proteaseinhibitors einverleibt, wobei die inhibierende Wirkung nach Verdünnung aufgehoben wird.
2. """erfahren gemäss Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man den reversiblen alkalischen Proteaseinhibitor dem Proteasegemisch in einer Konzentration im Bereich von ungefähr 50 bis ungefähr 1000 Gew.<£, bezogen auf das Gewicht der alkalischen Protease, einverleibt und dass das Enzymgemisch weiterhin ein zusätzliches Enzym enthalten kann, das durch den reversiblen Inhibitor nicht nachteilig beeinflusst wird und Calciumionen in einer Konzentration im Bereich von ungefähr 10~ M bis ungefähr 10 M verwendet werden, um die Stabilisierung der neutralen Proteaseaktivitat zu unterstützen.
3. "^erfahren gemäss Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man den p-T-"'ert des Gemische auf einen v/ert zwischen ungefähr 5,5 und ungefähr 6 zur weiteren unterstützung der Stabilisierung der neutralen Proteaseaktivitat verringert und dass man als reversiblen Inhibitor den Saft von gemahlenen hellfleischigen Kartoffeln verwendet.
- 12 -
1/16
4. Verfahren gemäss Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man als neutrales und alkalisches Proteasegemisch ein B. sub· tills Enzymgemisch verwendet, das gegebenenfalls Amylase
enthalten kann.
{5} Stabilisierte Enzymzubereitung gekennzeichnet durch ein
CJ
G-emisch von neutraler Protease und alkalischer Protease und mit dem G-ehalt von ungefähr 50 bis 1000 Gew.$, bezogen auf
das G-ewicht der alkalischen Protease, eines reversiblen alkalischen Proteaseinhibitors, von ungefähr 10 bis unge«
fahr 10 M Calciumionen, um dadurch die Stabilisierung der neutralen Proteaseaktivitat zu unterstützen und den pH-Wert des Gemische auf einen Wert zwischen ungefähr 5,5 und ungefähr 6 zur weiteren Unterstützung der Stabilität der neutralen Proteaseaktivitat einzustellen und dass die Zubereitung gegebenenfalls Amylase enthalten kann.
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