DE2110436B2

DE2110436B2 - Verfahren zur Herstellung eines antileukopenischen und antikörperbildenden Thymusextrakts aus Kalbsthymus

Info

Publication number: DE2110436B2
Application number: DE2110436A
Authority: DE
Inventors: Brunetto Dr. Brunetti; Emilio Dr. Pini
Original assignee: LABORATORI FARMACO-BIOLOGICI ELLEM SpA MAILAND (ITALIEN)
Current assignee: LABORATORI FARMACO-BIOLOGICI ELLEM SpA MAILAND (ITALIEN)
Priority date: 1971-03-04
Filing date: 1971-03-04
Publication date: 1980-10-02
Also published as: DE2110436A1; DE2110436C3

Description

Die Erfindung betrifft den durch den Anspruch näher gekennzeichneten Gegenstand.

Bekanntlich gibt es verschiedene Arten der auch als Leukopenie bezeichneten krankhaften Verminderung der Leukozyten. Man unterscheidet hierbei im allgemeinen zwischen primärer, sekundärer und immunallergischer Leukopenie. Hiervon hat die sekundäre Leukopenie, die durch zytosiatische Mittel und Strahlentherapie hervorgerufen wird, eine besondere Bedeutung erlangt Zur Behandlung der verschiedenen Arten von Leukopenie wurden bisher Leberextrakte, Vitamin B₆, Folsäure und Testosteron in hohen Dosen eingesetzt. Die Nachteile dieser bekannten Mittel sind entweder eine zu geringe Wirksamkeit, insbesondere bei der Bekämpfung der sekundären Leukopenie, oder das Auftreten von lokalen oder allgemeinen Nebenwirkungen.

B. Helwig, Moderne Arzneimittel, Stuttgart 1967, Seite 836, beschreibt ein Adjuvans für die Krebstherapie, das aus einem Gemisch von Hydrolyseprodukten der Milz, des Thymus und des Knochenmarks junger Wiederkäuer besteht. Es werden jedoch weder Angaben über die Wirkungen dieses Hydrolysatgemisches, noch über die Herstellung bzw. die Art der eingesetzten Extraktionsmittel noch über die Thymusmenge im Ausgangsgemisch gemacht. Es ist auch nicht ersichtlich, ob es sich bei diesem Gemisch um ein Mittel handelt, das antikörperbildend und antileukopeniseh wirkt. Es ist anzunehmen, daß der Milzextrakt, da er an erster Stelle in der Entgegenhaltung genannt wird, auch den Hauptbestandteil dieses Extrakigemisches ausmacht. Die GB-PS 1195 980 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Thymosin und Antithymosin aus Thymusgewebe unter milden Bedingungen, bei welchem Kalbsthymus mit !^molarer Natriumchloridlösung homogenisiert, die Behandlungsflüssigkeit vom Gemisch abzentrifugiert und die abzentrifugierte Flüssigkeit auf 100⁰C erwärmt und erneut zentrifugiert wird. Die abzentrifugierte Flüssigkeit wird dann mit Aceton versetzt und das ausgefällte Thymosin durch Säulenchromatographie gereinigt, die Acetonlösung eingeengt und das erhaltene rohe Antithymosin ebenfalls durch Säulenchromatographie gereinigt Das so erhaltene Thymosin erhöht die Zahl der I.ymphozyten im Blut Es ίο handelt sich um ein reines Extraktionsverfahren, bei dem darauf geachtet wird, daß die extrahierten Substanzen möglichst nicht verändert bzw. gespalten werden. Die der US-PS 34 38 859 entsprechende GB-PS

10 23 849 betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Thymusextraktes durch Behandlung von Kalbsthymus bei 37° C für 48 Stunden in einer Lösung, die enzymatisches Lactalbuminhydrolysat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, zweibasisches Natriumphosphat, einba- sisches Kaliumphosphat, Phenolrot, Glucose, Natriumhydrogencarbonat Natriumpenicillin G, Streptomycinsulfat und Wasser enthält Der so erhaltene Thymusextrakt wirkt generell immunostimulierend und erhöht z. B. die Zahl der Lymphozyten im Bkit von Mäusen, die damit behandelt worden sind. Die GB-PS 10 23 849 enthält jedoch keinen Hinweis darüber, daß der bekannte Thymusextrakt auch zur Behandlung bzw. zur Verhütung von sekundärer Leukopenie, die z. B. durch Strahlenbehandlung des Patienten oder durch Behand-

jo lung des Patienten mit Zytostatika verursacht wird, geeignet ist

Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, ein Verfahren zur Herstellung eines hochwirksamen, antileukopenischen und antikörperbildenden Thymus-

J5 extraktes zu schaffen, der keine unerwünschten Nebenerscheinungen zeigt und überdies noch zur Behandlung von Hi pes zoster geeignet ist

Diese Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch gelöst

Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Thymusextrakt weist gegenüber dem nach Helwig (siehe oben) erhaltenen schon aufgrund der unterschiedlichen Ausgangsprodukte Eigenschaften auf, die mit denen des erfindungsgemäß hergestellten Thymusextraktes nicht vergleichbar sind. Auch wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren das Thymusgewebe im Gegensatz zum Verfahren der GB-PS

11 95 980 mit stark saurer Lösung, d. h. mit Chlorwasserstoffsäure behandelt, wodurch ein Extrakt erhalten wird, der sich sowohl in der Zusammensetzung als auch in der Wirkungsweise vom bekannten Extrakt unterscheidet, da beim erfindungsgemäßen Verfahren eine zumindest teilweise Lyse der im Thymus enthaltenen Substanzen eintritt Während der gemäß Erfindung erhaltene Thymusextrakt sowohl eine Erhöhung der Lymphozyten im Blut als auch eine allgemeine Erhöhung der Leukozyten bewirkt, erhöht der bekannte Extrakt nur die Lymphozylen. Demgegenüber zeigen die gemäß Erfindung hergestellten Extrakte nicht vorhersehbare,

bo überraschende Wirkungen.

Das nachfolgende Beispiel dient der näheren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel

h> 20 kg Thymus von frischgeschlachteten jungen Kälbern wird in Stückchen von 2 mm Durchmesser zerkleinert und bei Raumtemperatur mit 1600 bis 2400 g Chlorwasserstoffsiiure (Dichte 1,092) behandelt. Man

mischt die so behandelte Masse sorgfältig und läßt bei Raumtemperatur 18 bis 24 Stunden stehen. Nach dieser Zeit wird die Masse in eine thermostatische Kammer gebracht und dort 48 bis 72 Stunden bei 45° C gehalten. Anschließend wird zentrifugiert und die abgetrennte Flüssigkeit bei 0⁰C 72 Stunden lang stehengelassen. Hierauf wird auf 20° C erwärmt und abfiltriert.

Das FUtrat wird unter Rühren mit einer n-Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 4,4 bis 4,8 eingestellt und anschließend im Wasserbad 60 Minuten lang auf 80° C erhitzt Anschließend läßt man bis auf 20 bis 25° C abkühlen und nitriert

Das so erhaltene Filtrat wird erneut unter Rühren mit einer n-Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 9 bis 9,5 gebracht und 1 Stunde im Wasserbad auf 80° C

Tabelle I

erwärmt. Anschließend läßt man auf 20 bis 25° C abkühlen und filtriert Der pH-Wert des FUtrats wird sodann mit Hilfe einer n-Chlorwasserstoffsäurelösung auf einen pH-Wert von 6,5 bis 6,7 eingestellt

Der erhaltene Extrakt wird auf 2 bis O⁰C abgekühlt und bei dieser Temperatur 72 Stunden lang stehengelassen. Nach dieser Zeit wird auf 20 bis 25° C erwärmt und filtriert Das Fütrat wird rasch auf - 15"C abgekühlt und zur Abtrennung des gebildeten Eises zentrifugiert

Der Extrakt wird anschließend auf -20⁰C abgekühlt, bis die gewünschte Konzentration gegenüber der Ausgangsdrüse von 1 :80 bis 1 :100 erreicht ist Der konzentrierte Extrakt wird sodann (nach Abtrennung vor vorhandenem Eis) mit Glycerin in einem Verhältnis vor 1 :50 verdünnt

Anteil 1

Anteil 2 Anteil 3

Anteil 4

Anteil 5

Anteil 6

Trockenrückstand GesamtstickstofT Phosphor, anorganisch Phosphor, organisch Gesamtphosphor

Aminosäure

(als Leucin angegeben)

Adenosin Guanosin

Dieser Thymusextrakt wird gegebenenfalls im Verhältnis von 1 :4 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und die Lösung nach Filtrieren mit einem Mikroporenfilter in Ampullen zu je 2 ml aufgeteilt, die in einem Autoklav bei 120⁰C 30 Minuten lang sterilisiert werden. Die chemische Analyse verschiedener Anteile des Thymusextraktes (1 :50) ergab die in der vorstehenden Tabelle I angegebenen Werte (in mg/ml).

Die antileukopenische Wirkung des erfindungsgemäß

26,10	24,90	25,90	26,37	23,79	21,24
2,29	1,67	2,16	2,11	2,01	1,71
0,25	0,19	0,22	0,22	0,15	0,19
0,30	0,21	0,30	0,33	0,20	0,20
0,55	0,40	0,52	0,55	0,35	0,39
1,68	1,64	1,68	1,96	1,84	1,74
2,20	2,70	2,00	3,:o	2,50	2,30
1,60	1,30	1,10	1,80	1,20	1,20

hergestellten Thymusextraktes zeigte sich aufgrund folgender pharmakologischer Versuche:

(1) Bei röntgengesamtbestrahltem und mit typisch ciliärem Antigen oder eritryzytarischem menschlichen Antigen immun gemachten Kaninchen löst die Verabreichung des Thymusextraktes ein deu.'iiches antikör-

4n pererzeugendes und leukopenisches Ansprechen aus. Dies zeigen die in der nachfolgenden Tabelle Ii niedergelegten Versuchsergebnisse.

Tabelle II	Vor Bestrahlung	mit Thymus	Vor Immunisierung	mitThymus	Nach Immunisierung	mitThymus-	1,03	1,04	0,91	0,86	1,05	0,84	0,97	1,26	Änderungen in %	Thschniüswcrte)	+ 17	mit Thymus
	Kon	extrakt	Kon	extrakt	- Kon	extrakt	6980	6960	3660	3880	4920	3560	5340	8380	Kon	1,10	+ 28	extrakt
	trollen	behandelt	trollen	behandelt	trollen	behandelt	49	51	57	56	53	58	50	41	trollen	8140	- 14	behandelt
						und anschließende Immunisierung mit ciliär-typhischem Antigen	47	46	37	39	42	36	45	56		37	+ 29
			1,04	-	-	-	-	1:4608	-	1:26	1:22524		57	-	+ 46
Röntgenbestrahlung	6940						+ 15	I : 409	+ 116
Gammaglobulin	48	und Immunisierung rhit	menschlichen Frylrozylen (Du		+ 34	-27
Leukozyten, mm	47	1,50	0,83		-5	+ 44
Neutrophilen	-	7120	4240	+ 14	-
Lymphozyten		49	58	-
Antikörpergrad	46
(Titer)	-	-	+ 31
Röntgenbestrahlung	+ 128
Gammaglobulin	-31
Lcukczyten/mmc	-58
Neutrophilen	-
Lymphozyten
Antikörpergrad

(2) Bei röntgengesamtbestrahlten Ratten beschleunigt der erfindungsgemäß hergestellte Thymusextrakt die Erholung von den durch die Gesamtbestrahlung hervorgerufenen leukozytarischen Schädigungen. Beispielsweise wurden Versuche an einer Gruppe von 15 Vergleichsratten und einer Gruppe von 15 mit dem erfindungsgemäß erhaltenen Thymusextrakt (0,5-cm³-Ampullen pro Tier und Tag) behandelten Versuchstieren durchgeführt, wobei sämtliche Ratten vorher in einer einzigen Sitzung gemeinsam mit 250 r gesamtbestrahlt wurden (kV 180, mA 15 dip 60 cm; Riter 0,25 Cu+ 1Al):

Die leukozytarischen Ausgangswerte (9600 weiße Blutkörperchen) sanken am 5. Tag bei den Vergleichstieren auf 5400 und bei den behandelten Tieren auf 6400. Die behandelten Tiere hatten am 11. Tag den Ausgangswert erreicht, während die Vergleichstiere nur auf 7500 angestiegen waren. Am 18. Tag erreichten die behandelten Tiere einen Wert von 10 900, während die Vergleichstiere einen Wert von 8750 aufwiesen, also noch unter dem Ausgangswert lagen.

(3) Der nach dem erfindungsgerr.äß'_:n Verfahren hergestellte Thymusextrakt wirkt unter Anregung der phagozytären Tätigkeit des endot'.ielialen Gittersystems. Bei einer durchgeführten Un; ersuchung wurden 30 weiße Mäuse mit 25 g in 2 Gruppen von je 15 Tieren unterteilt Die erste Gruppe der Vergleichstiere wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung und die zweite Gruppe mit dem erfindungsgemäß erhaltenen Thymusextrakt behandelt. Nach 20tägiger Behandlung wurden die Tiere mit Tusche geimpft (16 mg/100 g Gewicht). Sodann wurden zwei Entnahmen von je 0,020 cm³ vorgenommen, und zwar die erste 4 und die zweite 25 Minuten nach der Impfung mit Tusche. Diese entnommenen Proben wurden in Reagensgläschen, welche 3 ml l°/biger Natriumcarbonatlösung enthielten, mit Hilfe eines Photospektrometers bei 625 ιημ abgelesen. Es wurde der phagozytarische Index K, dargestellt durch die Formel

Jede dieser Gruppen wurde ihrerseits wiederum in 3 Gruppen zu je 15 Mäusen unterteilt

Die erste Gruppe bestand aus Vergleichstieren, welche intraperitoneal zu den verschiedenen anderen Gruppen mit kleineren Dosen als 3 mg/kg Aminopterin behandelt wurden.

Die zweite Gruppe wurde je Untergruppe mit den gleichen Dosen Aminopterin wie die erste Gruppe behandelt und mit gemäß Erfindung hergestelltem

ίο Thymusextrakt (Ampullen mit Dosen von 1 ml/Tier) zwei Tage vor der Verabreichung des Aminopterins und bis zum Abschluß des Versuchs am 6. Tag. Nach Verabreichung des Aminopterins wurden die verendeten Tiere jeder Gruppe am 4„ 5. und 6. Tag gezählt Die Wirkung A des Thymusextraktes gemäß Erfindung kann mittels folgender Formel berechnet werden:

K =

logC.-logQ

T₂-T₁

ermittelt, worin C die Konzentration der Tusche und T die Zeit in Minuten bedeutet.

Die hierbei erhaltenen Werte sind in der nachfolgenden Tabelle III wiedergegeben.

Tabelle III	Anzahl der Mäuse	Behand lungs- tage	ATXlO"³
Gruppe	15 15	20 20	8,59 14,03
Versuchstiere Behandelte Mäuse

Diese Werte zeigen deutlich die Zunahme des phagozyturischen Index bei der Gruppe der mit dem erfindungsgemäß erhaltenen Thymusextrakt behandelten Tiere,

(4) Die Leukozytosewirkung des Thymusextraktes wurde hinsichtlich des Schutzes gegen die myelotoxische Wirkung des Aminopterins bei Mäusen untersucht, wobei die Verringerung des Sterblichkeits-Index berechnet wurde, is wurden hierfür beispielsweise 90 Mäuse mit einem Durchschnittsgewicht von je 30 g ausgewählt und in 2 Oruppen zu je 45 Tieren aufgeteilt.

^A-

T_{2 +} T₃

₊ C₂

^xm'

worin Ti, T₂ und T₃ die Zahl der toten Tiere nach 4, nach 4 und 5 und nach 4.5 und 6 Tage« nach Behandlung mit Aminopterin und Thymusextrakt unu Q, C₂ und C₃ die Zahl der toten Tiere am 4, 4. und 5. und am 4., 5. und 6. Tage nach der Behandlung allein mit Aminopterin bedeuten.

Der Wirksamkeitsindex A betrug 55,5, womit eine hohe Wirksamkeit des Extraktes bewiesen war.

Die klinische Wirkung des erfindungsgemäß hergestellten Thymusextraktes bei der Behandlung der primären und sekundären Leukopenie wurde durch Verwendung der auf die oben beschriebene Weise hergestellten Ampullen untersucht. Es wurden beispielsweise klinische Versuche mit 40 Patienten durchgeführt bei welchen die Leukozytenwerte nach einer Strahlungsbehandlung (Röntgentherapie, tiefe Röntgenbestrahlung mit 20OkV, Tele-Kobalttherapie, Photonen und Elektronen aus einem Betatron-Siemens 42 MeV) gesunken waren. Die Verabfolgung des Thymusextraktes erwies sich als sehr wirksam, unabhängig von der Art der schädigenden Strahlung.

Bei 90% der behandelten Patienten wurden insgesamt positive Ergebnisse erzielt Trotz der anfänglich festgestellten Neigung zur Leukopenie konnte durch Verabreichung von zwei Ampullen pro Tag die Strahlentherapie ununterbrochen tu Ende geführt werden. Hierbei erwies sich weiterhin die erfindungsgemäße Zubereitung als absolut nichttoxisch.

Weiterhin wurde die Wirkung des erfindungsgemäß hergestellten Thymusextraktes an einer Gruppe von 40

so Patienten untersucht, die an

(a) primärer Leukopenie,

(b) sekundärer Leukopenie als Folge myelotoxischer Wirkstoffe (zytostatische Mittel und Strahlungstherapie),

(c) immunoallergischer Leukopenie (durch Pyramidon)

litten.
Die Resultate zeigten, daß der in Dosen von zwei Ampullen/Tag verabreichte, gemäß Erfindung hergestellte Thymusextrakt eine starke antileukopenische Wirkung aufwies, ohne daß sich lokale oder dllgemeine Nebenerscheinungen zeigten.
Eine dritte Gruppe klinischer Versuche wurde an 22 Patienten vorgenommen, die eine sekundäre Leukopenie aufgrund myelotoxischer Behandlung (Bestrahlung und zytostatische Mittel) hatten. Diese Patienten wurden mit Dosen von je zwei Ampullen täglich

behandeil. In fast allen Fällen verhinderte der erfindungsgemäß hergestellte Thymusextrakt bei den der Einwirkung von myelotoxischen Mitteln ausgesetzten Patienten die Bildung von Leukopcnie. die dagegen bei einer Gruppe von 10 Patienten auftrat, welche mit den gleichen zytostatischen Mitteln, jedoch ohne Verabreichung des er^f;ndungsgemäß erhaltenen Thymusextraktes behandelt worden waren.

Ein abschließender klinischer Versuch zeigte die Wirkung des erfindungsgemäßen Thvmusextrakles gegenüber einer Gruppe von 27 Patienten, die mit den bekannten antileukopenischen Mitteln (wie Leberextrakten, Vitamin Bs Folsäure, Testosteron in hohen Dosen) behandelt worden waren. Während in der Gruppe der mit den bekannten Mitteln behandelten

Patienten ein durchschnittlicher Rückgang der weißen Blutkörperchen von Beginn bis Ende der myelotoxischen Behandlung um 50% /u verzeichnen war, konnte bei den mit dem erfindungsgemäßen Thymusextrakt

"· unter gleichen Bedingungen behandelten Patienten ein Rückgang von nur 16% festgestellt werden.

Der erfindungsgemäß hergestellte Thymusextrakt ist überraschenderweise auch zur Behandlung von Herpes zoster (Gürtelrose) einsetzbar. Bei einer mit 65 an

ι» Zoster erkrankten Patientin durchgeführten Untersuchung mit jiner Dosis von 500 bis 1000 mg des erfindungsgemäß hergestellten Thymusextraktes während eines Zeitraumes von 3 bis 20 Tagen wurden bei 33 Patienten sehr gute, bei 20 Patienten gute und bei 7

ι > Patienten mittelgute Heilergebnisse erzielt.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung eines antileukopenischen und antikörperbildenden Thymusextraktes aus Kalbsthymus, dadurch gekennzeichnet, daß man den Kalbsthymus zerkleinert, die zerkleinerten Teilchen mit Chlorwasserstoffsäure behandelt, das Gemisch aus Chlorwasserstoffsäure und zerkleinerten Thymusteüchen gut vermischt, die Mischung bei Raumtemperatur und dann bei 45° C 48 bis 72 Stunden stehenläßt, die Flüssigkeit aus der Mischung mechanisch abtrennt, die abgetrennte Flüssigkeit bei 0°C 72 Stunden stehenläßt, die Flüssigkeit auf 20⁰C erwärmt und filtriert, das erhaltene Filtrat auf einen pH-Wert von 4,4 bis 4,8 einstellt, auf 80° C 1 Stunde lang erwärmt, abkühlen läßt und filtriert, das erhaltene Filtrat auf einen pH-Wert von 9 bis 9,5 einstellt, 1 Stunde auf 80⁰C erwärmt, abkühlen läßt und filtriert, das erhaltene Filtrat auf einen pH-Wert von 6,5 bis 6.7 einstellt, auf 2 bis O⁰C abkühlt und 72 Stunden stehenläßt, dann auf 20 bis 25° C erwärmt und filtriert, das erhaltene Filtrat auf -15° C abkühlt, das gebildete Eis abtrennt, das Filtrat auf -20⁰C abkühlt, bis die gewünschte Konzentration gegenüber der Ausgangsdrüse von 1 :80 bis 1 :100 erreicht ist, das Eis abtrennt, das konzentrierte Filtrat mit Glycerin bis zu einem Verhältnis von 1 :50 verdünnt und das verdünnte Produkt abfiltriert.