DE202023106761U1

DE202023106761U1 - System zur Entwicklung einer Formulierung für Methylsteroid aus Bufo melanostictus und Formulierung dafür

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Publication number: DE202023106761U1
Application number: DE202023106761.1U
Authority: DE
Original assignee: Kakatiya Univ; KAKATIYA UNIVERSITY
Current assignee: Kakatiya Univ; KAKATIYA UNIVERSITY
Priority date: 2023-11-16
Filing date: 2023-11-16
Publication date: 2024-01-16
Anticipated expiration: 2033-11-17

Abstract

Ein System zur Entwicklung einer Formulierung für Methylsteroid aus Bufo melanostictus, umfassend:eine Giftproben-Sammeleinheit, die so konfiguriert ist, dass sie eine wirksame Menge einer Giftprobe von Bufo melanostictus erhält; die Giftproben-Sammeleinheit umfasst einen Ohrspeicheldrüsen-Extraktionsmechanismus, der so konfiguriert ist, dass er eine körnige Flüssigkeit mit gelblicher Farbe aus den Ohrspeicheldrüsen von Bufo melanostictus erhält; und Trocknungssystem, das in das Gerät integriert ist, um die Entnahme einer getrockneten Giftprobe zu erleichtern.eine Chloroform-Versorgungseinheit, die so konfiguriert ist, dass sie eine wirksame Menge Chloroform als Lösungsmittel bereitstellt; undeine Formulierungsmischeinheit, die so konfiguriert ist, dass sie die Giftprobe und das Chloroform kombiniert, wodurch eine Formulierung für Methylsteroid entsteht, und wobei

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Offenbarung betrifft ein System zur Entwicklung einer Formulierung für Methylsteroid aus Bufo melanostictus und dessen Formulierung und insbesondere neue sekundäre Metaboliten, die aus dem Gift von Bufo melanostictus gewonnen werden, sowie klinische In-vivo-Beobachtungen und die Aufdeckung ihrer potenziellen Schutzwirkungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die im Krötengift, insbesondere in der Indischen Kröte (Bufo melanostictus), vorkommenden Bufodienolidverbindungen haben ein erhebliches pharmakologisches Potenzial gezeigt. Diese Verbindungen zeigen zusammen mit anderen bioaktiven Substanzen in Krötensekreten ein breites Spektrum therapeutischer Wirkungen, darunter zytotoxische, entzündungshemmende, antidiabetische, antibakterielle, kardiotonische, immunmodulatorische, krebsbekämpfende und antivirale Wirkungen. Die Verteilung und Menge dieser Toxine bei verschiedenen Krötenarten wird durch Umweltfaktoren beeinflusst, was die Notwendigkeit der Erforschung neuer chemischer Substanzen unterstreicht.
Zusätzlich zu den pharmakologischen Aspekten der Kröte wird die entscheidende Rolle der Leber bei der Entgiftung und dem Stoffwechsel hervorgehoben. Synthetische Giftstoffe wie Bisphenol A (BPA), das in verschiedenen Alltagsgegenständen enthalten ist, stellt eine Herausforderung für die Leberfunktion dar. BPA, das als künstliches Androgen gilt, wird mit oxidativen Schäden an Zellen und Geweben in Verbindung gebracht, die zu Erkrankungen wie Leberversagen führen. Das Ungleichgewicht zwischen der Produktion und Beseitigung freier Radikale während des Leberstoffwechsels trägt zu oxidativem Stress und nachfolgender Leberschädigung bei.
Die Informationen unterstreichen die Bedeutung der Bewältigung dieser Herausforderungen und weisen auf die Notwendigkeit innovativer Lösungen und Fortschritte auf diesem Gebiet hin, um sich vor den schädlichen Auswirkungen synthetischer Toxine zu schützen und das therapeutische Potenzial der Krötensekrete weiter zu nutzen.
In Anbetracht der vorstehenden Diskussion wird deutlich, dass ein Bedarf an einem System zur Entwicklung einer Formulierung für Methylsteroide aus Bufo melanostictus und deren Formulierung sowie zur klinischen Untersuchung des hergestellten Methylsteroids besteht, bei dem es sich um neue sekundäre Metaboliten handelt, die aus dem Gift von Bufo melanostictus (Indische Kröte) gewonnen werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Offenbarung betrifft ein System zur Entwicklung einer Formulierung für Methylsteroid aus Bufo melanostictus und dessen Formulierung. Diese Erfindung zielt darauf ab, die kürzlich identifizierten Sekundärmetaboliten zu erforschen, die aus dem Gift von Bufo melanostictus, allgemein bekannt als Indische Kröte, stammen. Die Erfindung umfasst die Isolierung und Extraktion dieser Metaboliten und die anschließende Durchführung klinischer In-vivo-Beobachtungen, um die potenzielle Schutzwirkung dieser Verbindungen zu bewerten. Eine der isolierten Verbindungen ist ein Steroid vom Bufodienolid -Typ namens 6-Methyl-Trihydoxyhexadecahydro-1-cyclopenta Phenanthren-2-H-Pyran-2-on, das mithilfe verschiedener Analysetechniken wie IR, 1D- und 2D-NMR charakterisiert wurde, P-XRD und Massenspektrometrie. Es wurde festgestellt, dass die Verbindung eine Organtoxizität in Leber und Nieren hervorruft, wenn sie sowohl Bisphenol -A (BPA) als auch einer durch Dextran-Natriumsulfat (DSS) verursachten Kolitis ausgesetzt wird. Die neu entdeckte Verbindung namens Novel Methyl Steroid (NMS), die aus der Indischen Kröte stammt, zeigte erhebliche schützende Eigenschaften, insbesondere im Hinblick auf die ALT-, ALP-, AST-, Harnstoff-, Harnsäure- und Kreatininspiegel. Diese neuartige Verbindung zeigte eine Reduzierung biochemischer Marker und die Unterdrückung entzündungsfördernder Zytokine wie IL-6 und TNF-α sowohl im Serum als auch im Gewebe von Leber, Niere und Dickdarm. Die Ergebnisse der Erfindung unterstreichen das Potenzial von NMS als wertvolles Molekül mit einzigartigen schützenden und entzündungshemmenden Eigenschaften. Das Vorhandensein einer Methylgruppe an der C23-Kohlenstoffposition wurde als Faktor identifiziert, der zu seiner verstärkten Wirksamkeit beiträgt. Diese Forschung stellt den ersten Bericht über ein neuartiges Bufodienolid -Steroid dieser Gattung dar und betont, dass NMS ein vielversprechender Kandidat für die Entwicklung innovativer schützender und entzündungshemmender Wirkstoffe ist.
Die vorliegende Offenbarung zielt darauf ab, ein System zur Entwicklung einer Formulierung für Methylsteroid aus Bufo melanostictus bereitzustellen. Das System umfasst: eine Giftprobensammeleinheit, die so konfiguriert ist, dass sie eine wirksame Menge einer Giftprobe von Bufo melanostictus erhält; die Giftproben-Sammeleinheit umfasst einen Ohrspeicheldrüsen-Extraktionsmechanismus, der so konfiguriert ist, dass er eine körnige Flüssigkeit mit gelblicher Farbe aus den Ohrspeicheldrüsen von Bufo melanostictus erhält; und Trocknungssystem, das in das Gerät integriert ist, um die Entnahme einer getrockneten Giftprobe zu erleichtern.
Das System umfasst weiterhin: eine Chloroform-Versorgungseinheit, die so konfiguriert ist, dass sie eine wirksame Menge Chloroform als Lösungsmittel bereitstellt; und eine Formulierungsmischeinheit, die so konfiguriert ist, dass sie die Giftprobe und das Chloroform kombiniert, wodurch eine Formulierung für Methylsteroid entsteht, und wobei
In einer Ausführungsform umfasst der Extraktionsmechanismus der Ohrspeicheldrüse einen Stimulationsapparat, bei dem es sich entweder um eine kontrollierte elektrische oder mechanische Methode handeln kann, der die Kröte sanft dazu anregt, ihr Gift freizusetzen.
In einer Ausführungsform umfasst die Chloroform-Versorgungseinheit: einen Chloroform-Behälter zum Speichern von Chloroform; ein Präzisions-Dosiermechanismus, der so konfiguriert ist, dass er Chloroform in genau den Mengen abgibt, die für den Formulierungsprozess erforderlich sind.
In einer Ausführungsform umfasst die Formulierungsmischeinheit: eine Mischkammer, die mit Mischwerkzeugen ausgestattet ist, um eine Giftprobe und Chloroform effektiv zu kombinieren; und in die Einheit integrierte Temperatur- und Druckkontrolleinheiten zur Regulierung der Bedingungen in der Mischkammer während des Formulierungsprozesses.
In einer Ausführungsform umfasst die Giftprobensammeleinheit einen Ohrspeicheldrüsen-Extraktionsmechanismus zur Gewinnung einer körnigen Flüssigkeit mit gelblicher Farbe aus den Ohrspeicheldrüsen von Bufo melanostictus.
In einer Ausführungsform umfasst das System außerdem eine Lösungsmittelgemisch-Zufuhreinheit, die so konfiguriert ist, dass sie eine Mischung aus Hexan und Ethylacetat in einem Verhältnis von 9:1 bereitstellt, und wobei die Formulierungsmischeinheit außerdem so konfiguriert ist, dass sie die Mischung in die Formulierung einbezieht.
In einer Ausführungsform ist die Lösungsmittelgemisch-Zufuhreinheit so konfiguriert, dass sie eine Mischung aus Ethylacetat und Methanol bereitstellt, und wobei die Formulierungsmischeinheit außerdem so konfiguriert ist, dass sie die Mischung in die Formulierung einbezieht.
Die vorliegende Offenbarung zielt auch darauf ab, eine Formulierung für Methylsteroid aus Bufo melanostictus bereitzustellen. Die Formulierung umfasst: eine wirksame Menge einer Giftprobe; und eine wirksame Menge Chloroform als Lösungsmittel, wobei die Giftprobe aus Bufo melanostictus gewonnen wird und wobei die Giftprobe eine körnige Flüssigkeit mit gelblicher Farbe ist und aus den Ohrspeicheldrüsen einer Kröte gewonnen wird und wobei die Formulierung 10 g enthält einer getrockneten Giftprobe. Die Formulierung umfasst außerdem eine Mischung aus Hexan und Ethylacetat im Verhältnis 9:1.
Ein Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, ein System zur Entwicklung von Methylsteroiden aus Bufo melanostictus und eine Formulierung dafür bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung ist die klinische Untersuchung des hergestellten Methylsteroids.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung ist die Isolierung und Charakterisierung des Steroids vom Bufodienolid-Typ, 6-Methyl-Trihydoxy-hexadecahydro-1-cyclopenta Phenanthren-2-H-Pyran-2-on, aus dem Gift der Indischen Kröte unter Verwendung fortschrittlicher Analysetechniken.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, die klinischen In-vivo-Beobachtungen zu untersuchen, um die möglichen Schutzwirkungen des neu entdeckten neuartigen Methylsteroids (NMS) auf wichtige biochemische Marker der Leber- und Nierenfunktion zu bewerten.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, den Einfluss von NMS auf proinflammatorische Zytokine, insbesondere IL-6 und TNF-α, im Serum und im Gewebe von Leber, Niere und Dickdarm zu untersuchen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, die Wirksamkeit von NMS bei der Linderung der durch Bisphenol -A (BPA) induzierten Organtoxizität und der durch Dextran-Natriumsulfat (DSS) induzierten Kolitis zu bewerten.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, die einzigartige Wirksamkeit von NMS durch die spezifische Bewertung des Beitrags der kohlenstoffhaltigen Methylgruppe C23 zu bestimmen und so sein Potenzial als neuartiges schützendes und entzündungshemmendes Mittel zu etablieren.
Um die Vorteile und Merkmale der vorliegenden Offenbarung weiter zu verdeutlichen, erfolgt eine detailliertere Beschreibung der Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen davon, die in den beigefügten Zeichnungen dargestellt sind. Es versteht sich, dass diese Zeichnungen nur typische Ausführungsformen der Erfindung darstellen und daher nicht als deren Umfang einschränkend anzusehen sind. Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen genauer und detaillierter beschrieben und erläutert.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Offenbarung werden besser verständlich, wenn die folgende detaillierte Beschreibung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen gelesen wird, in denen in den Zeichnungen gleiche Bezugszeichen gleiche Teile darstellen, wobei:

1 stellt ein Diagramm dar, das die allgemeine Struktur von NMS gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung zeigt; Und
2 zeigt eine Tabelle mit den Ergebnissen einer Docking-Studie gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung.

Darüber hinaus werden erfahrene Handwerker erkennen, dass Elemente in den Zeichnungen der Einfachheit halber dargestellt sind und möglicherweise nicht unbedingt maßstabsgetreu gezeichnet wurden. Beispielsweise veranschaulichen die Flussdiagramme die Methode anhand der wichtigsten Schritte, die dazu beitragen, das Verständnis von Aspekten der vorliegenden Offenbarung zu verbessern. Darüber hinaus können im Hinblick auf die Konstruktion des Geräts eine oder mehrere Komponenten des Geräts in den Zeichnungen durch herkömmliche Symbole dargestellt worden sein, und die Zeichnungen zeigen möglicherweise nur die spezifischen Details, die für das Verständnis der Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung relevant sind um die Zeichnungen nicht durch Details zu verdecken, die für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, der Nutzen aus der Beschreibung hierin zieht, leicht ersichtlich sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG:
Um das Verständnis der Prinzipien der Erfindung zu fördern, wird nun auf die in den Zeichnungen dargestellte Ausführungsform Bezug genommen und für deren Beschreibung eine spezifische Sprache verwendet. Es versteht sich jedoch, dass dadurch keine Einschränkung des Umfangs der Erfindung beabsichtigt ist, da Änderungen und weitere Modifikationen des dargestellten Systems und weitere Anwendungen der darin dargestellten Prinzipien der Erfindung in Betracht gezogen werden, wie sie einem Fachmann normalerweise in den Sinn kommen würden in der Technik, auf die sich die Erfindung bezieht.
Der Fachmann versteht, dass die vorstehende allgemeine Beschreibung und die folgende detaillierte Beschreibung beispielhaft und erläuternd für die Erfindung sind und diese nicht einschränken sollen.
Verweise in dieser Spezifikation auf „einen Aspekt“, „einen anderen Aspekt“ oder eine ähnliche Sprache bedeuten, dass ein bestimmtes Merkmal, eine bestimmte Struktur oder ein bestimmtes Merkmal, das in Verbindung mit der Ausführungsform beschrieben wird, in mindestens einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Daher beziehen sich die Formulierungen „in einer Ausführungsform“, „in einer anderen Ausführungsform“ und ähnliche Formulierungen in dieser Spezifikation möglicherweise, aber nicht unbedingt, auf dieselbe Ausführungsform.
Die Begriffe „umfasst“, „umfassend“ oder andere Variationen davon sollen eine nicht ausschließliche Einbeziehung abdecken, sodass ein Prozess oder eine Methode, die eine Liste von Schritten umfasst, nicht nur diese Schritte umfasst, sondern möglicherweise andere Schritte nicht umfasst ausdrücklich aufgeführt oder diesem Prozess oder dieser Methode innewohnend sind. Ebenso schließen ein oder mehrere Geräte oder Subsysteme oder Elemente oder Strukturen oder Komponenten, denen „umfasst...a“ vorangestellt ist, nicht ohne weitere Einschränkungen die Existenz anderer Geräte oder anderer Subsysteme oder anderer Elemente oder anderer Strukturen aus andere Komponenten oder zusätzliche Geräte oder zusätzliche Subsysteme oder zusätzliche Elemente oder zusätzliche Strukturen oder zusätzliche Komponenten.
Sofern nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, allgemein verstanden werden. Das hier bereitgestellte System, die Methoden und Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sollen nicht einschränkend sein.
Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung werden im Folgenden ausführlich unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt ein System (100) zur Entwicklung einer Formulierung für Methylsteroid aus Bufo melanostictus bereit, umfassend eine Giftprobensammeleinheit (102), die so konfiguriert ist, dass sie eine wirksame Menge einer Giftprobe aus Bufo melanostictus erhält; die Giftproben-Sammeleinheit (102) umfasst einen Ohrspeicheldrüsen-Extraktionsmechanismus (104), der so konfiguriert ist, dass er eine körnige Flüssigkeit mit gelblicher Farbe aus den Ohrspeicheldrüsen von Bufo melanostictus erhält; und ein in die Einheit integriertes Trocknungssystem (106), um die Entnahme einer getrockneten Giftprobe zu erleichtern. Das System (100) umfasst weiterhin eine Chloroform-Versorgungseinheit (108), die so konfiguriert ist, dass sie eine wirksame Menge Chloroform als Lösungsmittel bereitstellt; und eine Formulierungsmischeinheit (110), die dazu konfiguriert ist, die Giftprobe und das Chloroform zu kombinieren und so eine Formulierung für Methylsteroid zu erzeugen.
In einer Ausführungsform umfasst der Extraktionsmechanismus der Ohrspeicheldrüse (104) eine Stimulationsvorrichtung (104a), bei der es sich entweder um eine kontrollierte elektrische oder mechanische Methode handeln kann, die die Kröte sanft dazu anregt, ihr Gift freizusetzen.
In einer Ausführungsform umfasst die Chloroform-Versorgungseinheit (108) Folgendes: einen Chloroform-Behälter (108a) zum Speichern von Chloroform; ein Präzisionsabgabemechanismus (108b), der so konfiguriert ist, dass er Chloroform in präzisen Mengen abgibt, die für den Formulierungsprozess erforderlich sind.
In einer Ausführungsform umfasst die Formulierungsmischeinheit (110) Folgendes: eine Mischkammer (110a), die mit Mischwerkzeugen ausgestattet ist, um eine Giftprobe und Chloroform effektiv zu kombinieren; und Temperatur- und Drucksteuereinheiten (110b), die in die Einheit integriert sind, um die Bedingungen in der Mischkammer während des Formulierungsprozesses zu regulieren.
In einer Ausführungsform umfasst die Giftprobensammeleinheit (102) einen Ohrspeicheldrüsen-Extraktionsmechanismus (104) zur Gewinnung einer körnigen Flüssigkeit mit gelblicher Farbe aus den Ohrspeicheldrüsen von Bufo melanostictus.
In einer Ausführungsform umfasst das System (100) außerdem eine Lösungsmittelgemisch-Zufuhreinheit (112), die so konfiguriert ist, dass sie eine Mischung aus Hexan und Ethylacetat in einem Verhältnis von 9:1 bereitstellt, und wobei die Formulierungsmischeinheit (110) außerdem so konfiguriert ist, dass sie diese enthält Mischung in der Formulierung.
In einer Ausführungsform ist die Lösungsmittelgemisch-Zufuhreinheit (112) so konfiguriert, dass sie eine Mischung aus Ethylacetat und Methanol bereitstellt, und wobei die Formulierungsmischeinheit (110) außerdem so konfiguriert ist, dass sie die Mischung in die Formulierung einbezieht.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Formulierung für Methylsteroid aus Bufo melanostictus bereit. Die Formulierung umfasst: eine wirksame Menge einer Giftprobe; und eine wirksame Menge Chloroform als Lösungsmittel, wobei die Giftprobe aus Bufo melanostictus gewonnen wird und wobei die Giftprobe eine körnige Flüssigkeit mit gelblicher Farbe ist und aus den Ohrspeicheldrüsen einer Kröte gewonnen wird und wobei die Formulierung 10 g enthält einer getrockneten Giftprobe.
In einer Ausführungsform umfasst die Formulierung außerdem eine Mischung aus Hexan und Ethylacetat im Verhältnis 9:1.
In einer Ausführungsform wird die Giftprobe von Bufo melanostictus, einer Indischen Kröte, gewonnen.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Giftprobe um eine körnige Flüssigkeit mit gelblicher Farbe, die aus der Ohrspeicheldrüse einer Kröte gewonnen wird. Die Drüsen werden zunächst vorsichtig mit einer trockenen Bürste geschrubbt, anschließend leicht gerieben und schließlich mit einer sterilen Pinzette zusammengedrückt, um die gelbliche Giftprobe zu erhalten.
In einer Ausführungsform wird Chloroform als Lösungsmittel zum Mischen mit 10 g getrockneter Giftprobe verwendet, gefolgt von Pulverisierung und Mazeration.
In einer Ausführungsform wird ein Extrakt von 2,2 g durch Verdampfen des Chloroform-Lösungsmittels aus der Mischung erhalten.
In einer Ausführungsform umfasst die Formulierung außerdem eine Mischung aus Hexan und Ethylacetat im Verhältnis 9:1 zur Reinigung des Extrakts über eine Si-Gel-Säule, was zu sieben Fraktionen führt.
In einer Ausführungsform umfasst die Formulierung außerdem ein Ethylacetat- und Methanol-Lösungsmittelsystem zur Reinigung der vierten Fraktion durch Säulenchromatographie an Kieselgel, was zu fünf verschiedenen Subtraktionen führt.
In einer Ausführungsform umfasst die Formulierung außerdem ein Isolat, bei dem es sich um die Endverbindung, Methylsteroid, handelt, die durch eine dritte Reinigungssubtraktion erhalten wird.
In einer Ausführungsform wird das Methylsteroid einer Charakterisierung und klinischen Tests unterzogen, um mögliche Schutzwirkungen zu bewerten.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Formulierung für Methylsteroid aus Bufo melanostictus bereit, umfassend:

eine wirksame Menge einer Giftprobe; und
eine wirksame Menge Chloroform als Lösungsmittel.
In einer Ausführungsform wird die Giftprobe aus Bufo melanostictus gewonnen.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Giftprobe um eine körnige Flüssigkeit mit gelblicher Farbe, die aus der Ohrspeicheldrüse einer Kröte gewonnen wird.
In einer Ausführungsform enthält die Formulierung 10 g einer getrockneten Giftprobe.
In einer Ausführungsform enthält die Formulierung einen Extrakt von 2,2 g, der durch Verdampfen des Chloroform-Lösungsmittels aus der Mischung erhalten wird.
In einer Ausführungsform umfasst die Formulierung außerdem eine Mischung aus Hexan und Ethylacetat im Verhältnis 9:1.
In einer Ausführungsform umfasst die Formulierung außerdem eine Lösungsmittelmischung aus Ethylacetat und Methanol.

Ausgewachsene lebende Kröten mit einem Gewicht von 45 bis 50 g werden zum Zweck der Isolierung und Probenentnahme aus Warangal in der Nähe der Universität Kakatiya erworben. Das Gift der Indischen Kröte wird gewonnen, indem man zunächst die Ohrspeicheldrüse der Kröte mit einer trockenen Bürste schrubbt und dann leicht einreibt, um die Ohrspeicheldrüse zu stimulieren. Anschließend erfolgt eine mechanische Kompression beider Drüsen mit einer sterilen Pinzette, um ein gelbliches Exsudat, also eine Drüsenflüssigkeit, zu gewinnen.
Das Methylsteroid wird aus den gewonnenen gelblichen Exsudaten lebender Kröten isoliert und extrahiert. Das erhaltene Ohrspeicheldrüsensekret wird getrocknet und dann pulverisiert und sieben Tage lang mit Chloroform als Lösungsmittel in einer glühenden Flasche mazeriert. Anschließend wird das Lösungsmittel unter reduziertem Vakuum mit einem Rotationsverdampfer verdampft, um 2.2 g Extrakt zu erhalten. Sieben Fraktionen (Fr.1 bis Fr.7) wurden durch Reinigung des Extrakts über eine Si-Gel-Säule (230-400 Mesh-Merck) und Elution mit Hexan:Ethylacetat (9:1 v/v) erhalten. Fr. A bis Fr. E wurden durch weitere Reinigung der Fraktion 4 (100 mg) mittels Säulenchromatographie an Kieselgel und einem Lösungsmittelsystem Ethylacetat:Methanol (8:2 bis 2:8 v/v) erhalten . Von allen Fraktionen wurde Fraktion C (40 mg) mittels präparativer HPLC (CH3CN-H2O, 42/58, v/v, 1.0 ml/min) verfeinert, um eine bei einer Wellenlänge von 300 nm nachgewiesene Substanz abzutrennen. Mithilfe von Spektrentechniken wurde die Struktur des Produkts bestimmt und anschließend einer Charakterisierung unterzogen, um eine neue chemische Einheit zu erhalten.
In einer Ausführungsform wurden unter Verwendung der Protein Data Bank-Ziele 2L3Y bzw. 2AZ5 molekulare Docking-Studien verwendet, um die Bindungskapazität von Verbindung 1 an IL-6 und TNF-α zu untersuchen. In den Docking-Studien wurden das automatische Docking 4.2.1.5.6 und die Schrödinger-Softwareversion 2019-1 verwendet. Chem Bio Draw Ultra 12.0 wurde verwendet, um die Struktur von Verbindung 1 zu entwerfen. Die Struktur wurde mit Open Babel 2.4.0 in das PDB-Format umgewandelt. Die RCSB-PDB wurde vom UCSF Chimera 1.10.1-Assistenten verwendet, um spezifische IL-6-Proteinstrukturen zu generieren.
Es wird eine akute Toxizitätsuntersuchung durchgeführt. Schweizer Albino-Mäuse wurden von Vyas Enterprises in Hyderabad bezogen und mit einer angemessenen Quarantänezeit versehen. Vor ihrem Einsatz in der Studie durchliefen sie eine 10-tägige Eingewöhnungsphase. Die Mäuse, bei denen es sich um weibliche Mäuse handelte, wurden einer 12-stündigen Hungerperiode ausgesetzt, während sie auf akute Toxizität untersucht wurden. Das Institutionelle Tierethikkomitee (IAEC/48/UCPSC/KU/2018) erteilte seine vorherige Genehmigung für alle Tests, die in Übereinstimmung mit den festgelegten Protokollen der Universität Kakatiya durchgeführt wurden. Zur Bestimmung der maximal tolerierten Dosierung (MTD) gemäß den OECD-423-Empfehlungen wurden 15 weibliche Schweizer Albino-Mäuse mit einem Gewicht zwischen 18 und 23 g verwendet.
Um die Mäuse zu behandeln, wurden sie in vier Gruppen aufgeteilt (n = 3). Die erste Gruppe erhielt eine Standardbehandlung mit Kochsalzlösung, während die anderen beiden Gruppen eine Behandlung mit Verbindung 1 in einer Dosis von 2000 mg/kg, 1000 mg/kg NMS und 500 mg/kg NMS erhielten. Darüber hinaus wurden über einen Zeitraum von 14 Tagen Messungen zur Sterblichkeitsrate und Toxizität durchgeführt. Unter Einhaltung normaler Protokolle wurden für jedes Tier physiologische Daten, einschließlich Veränderungen des Körpergewichts und Verhaltensvariationen, aufgezeichnet und Beobachtungen durchgeführt, um mögliche schädliche Folgen zu überprüfen.
Um die Leber- Nieren-Toxizität zu ermitteln, wurden in jeder der zweiwöchigen Studien mit Kontrolltieren, BPA, NMS (10 mg/kg) und NMS (20 mg/kg) Mäuse in vier Gruppen zu je sechs Mäusen aufgeteilt. Mäusen wurde NMS verabreicht, das in 5 % Methanol gelöst und mit Wasser auf ein Volumen von 100 ml verdünnt wurde. Alle Gruppen außer der Kontrollgruppe erhielten 1 % BPA, indem sie BPA im Trinkwasser auflösten, was über einen Zeitraum von zwei Wochen zu Vergiftungen führte. Die Mäuse in der Kontrollgruppe erhielten nach der normalen Methode täglich eine Sonde mit Kochsalzlösung. Am dreizehnten Tag des Experiments starben alle Mäuse, um mit Elisa die proinflammatorischen Werte zu messen und biochemische Parameter zu analysieren. Bevor das Serum jeder Maus entnommen wurde, wurden die Mäuse einer Halswirbelverrenkung unterzogen, um ihre Organe für histologische und immunhistochemische Analysen zu entnehmen. Leber- und Nierenorgane wurden einzeln entnommen und mit einem Homogenisator in Kochsalzlösung homogenisiert. Die Organe wurden dann bei 2000 U/min zentrifugiert, um die überstehende Schicht zu sammeln und die Menge an proinflammatorischem Gewebe mithilfe von Elisa zu messen. Schließlich wurden die Organe gesammelt und für weitere Untersuchungen in gepufferten Formalinlösungen gelagert.
In einer Ausführungsform ist der Mechanismus zur Extraktion der Ohrspeicheldrüse ein Gerät, das für die humane Sammlung des Giftes von Bufo melanostictus konzipiert ist und speziell auf die Ohrspeicheldrüsen dieser Kröten abzielt. Zu diesem Mechanismus gehört typischerweise ein Stimulationsgerät, bei dem es sich entweder um eine kontrollierte elektrische oder mechanische Methode handeln kann, das die Kröte sanft dazu anregt, ihr Gift freizusetzen. Der Prozess ist nicht-invasiv und stressfrei für die Kröte, wobei eine Sammelkammer die sichere und ethische Entnahme des Giftes gewährleistet. Es sind Sicherheitsfunktionen integriert, um Schäden an der Kröte zu verhindern, und ein Kontrollsystem regelt den Zeitpunkt und die Intensität der Stimulation, um eine gleichmäßige Stimulation zu gewährleisten. Ethische Überlegungen sind von größter Bedeutung und die Einhaltung von Richtlinien, um das Wohlergehen der im Extraktionsprozess verwendeten Kröten zu gewährleisten. Forscher legen großen Wert auf die Entwicklung von Mechanismen, die die Gewinnung von Gift für wissenschaftliche Zwecke ermöglichen und gleichzeitig mögliche Schäden oder Belastungen für die beteiligten Tiere minimieren. Um die Colitis ulcerosa zu untersuchen, wurden insgesamt sechs Mäuse mit der normalen Technik in vier Gruppen aufgeteilt 17. Das Trinkwasser der Mäuse wurde mit 2 % DSS und 10 mg/kg und 20 mg/kg NMS-Lösungen zur oralen Verabreichung behandelt. Der Kontrollgruppe wurde nur eine orale Sonde mit Kochsalzlösung pro Tag verabreicht. Zwei Wochen lang erhielten die Mäuse unterschiedliche Dosierungen einer in Methanol gelösten NMS-Lösung. Mäusen wurde zwei Wochen lang Trinkwasser mit 2 % gelöstem DSS verabreicht, um eine Colitis ulcerosa zu entwickeln. Nach Abschluss des Experiments wurden die Mäuse durch Zervixluxation getötet und die Doppelpunkte zur immunhistochemischen und histologischen Analyse entfernt. Zuvor wurde Serum nach etablierten Verfahren entnommen, um die Konzentration von Zytokinen zur Kontrolle von Entzündungen zu quantifizieren.
1 zeigt ein Diagramm, das die allgemeine Struktur des NMS gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung zeigt.
In heißt die Verbindung 6-Methyl-Tri hydoxy-hexadecahydro-1-cyclopenta Phenanthren-2-H-Pyran-2-on. Nachdem sich Verbindung 1 als Kristall mit zitronengelber Farbe gebildet hatte, wurde die prozentuale Ausbeute auf 49 % ermittelt, indem die experimentelle Ausbeute durch die theoretische Ausbeute dividiert und das Ergebnis mit 100 multipliziert wurde. Unter Verwendung eines vorbeschichteten Kieselgels 60 F₂₅₄ Wenn man eine Aluminiumplatte mit einer 0.2 mm dicken DC-Platte unter Verwendung einer Lösungsmittellösung aus Ethylacetat:Methanol (6:4) vergleicht, beträgt der Rf - Wert 0.71. Der Schmelzpunkt der Verbindung betrug 285 ± 5 °C. Durch Überwachung von [M+H]+ 389.2387 ( berechnet 388.2250) wurde mittels HR-ESI-MS festgestellt, dass die chemische Formel der Verbindung C₂₃H₃₂O₅ lautet Analyse, mit 18 Grad Ungesättigtheit. Die Carbonyleinheit war im Infrarotspektrum bei 1632 cm ^-1 zu sehen, zusammen mit der aromatischen CH-Gruppe bei 2850 cm^-1 und der aliphatischen CH-Gruppe bei 2918 cm ^-1. Bei δ 6.21 (1H, d, J = 9.8 Hz), 7.91 (1H, brs) und 7.16 (1H, s) gibt es im 1H-NMR eine Einheit, 2H-Pyran-2-on-Einheiten. Die ¹³ C-NMR-Analyse der Verbindung ergab 23 Signale. Davon wurden fünf bei δ 116.2, 151.5, 148.5, 114.1 und 161.8 identifiziert, was das Vorhandensein der 2H-Pyran-2-on-Einheit erklärt, und die restlichen vier Signale bei δ 68.1, 74.5, 72.5 und 59.6, deutete auf das Vorhandensein von sauerstoffhaltigen Kohlenstoffen hin. Eine gründliche COSY-Analyse beschleunigte dies und deutete auf einen quartären Methylkohlenstoff bei δ74.50 hin. Mithilfe von HSQC- und HMBC-Korrelationen wurden starke Beweise für die Existenz von Me-23, OH-2, OH-11 und dem sauerstoffhaltigen Methyl an C-23 erbracht. Die Assoziation zwischen den Methylen- und Triplett-Methyl-Kohlenstoffgruppen bei δ 27.5 bzw. δ 0.97 wurde im HMBC-Spektrum angezeigt. Darüber hinaus lieferte das Carbonylgruppensignal bei δ 173.8 einen zusätzlichen Beweis dafür, dass die Struktur eine Propionylgruppe enthielt. Auch die Korrelation zwischen 85.45 und δ 161.8, die den Standort bei C-23 anzeigte, lässt sich durch diesen Zusammenhang erklären.
Die kristalline NMS-Pulver- Indolverbindung weist im PXRD-Muster einen starken Peak bei 24.4 auf. Basierend auf den Spektrendaten und der XRD-Kristallanalyse der Verbindung wurde die Struktur des Moleküls als C₂₃H₃₂O₅ abgeleitet. [M+H] + wurde durch LC-MS identifiziert und das Vorhandensein eines Molekülions bei m/z 389.2387 bestätigt. Basierend auf diesen Spektrendaten wurde seine Struktur als 6-Methyltrihydroxyhexadecahydro-1-cyclopentaphenanthren-2-H-Pyran-2-on bestimmt. Die Eigenschaften der Verbindung sind unten angegeben:

IR (KBr , cm- 1) : 2850 (CH, aromatisch), 2918 (CH, aliphatisch), 1632 (C=O), 3534 (OH). 1HNMR400MHZ(DMSO-d6): 0.213-0.272(d, 4H, aliphatisches CH), 0.813-0.831(d,3H, aliphatisches CH), 1.199- 1.238(t-4H, aliphatisches CH), 1.402-1.476(m, 3H, Methyl-AR-CH), 1.638-1.684 (m, 2H, aliphatisch, CH), 1.779-1.814 (m, 2H, aliphatisch 2H), 1.895-1.915 (d, 4H, aliphatisch CH), 1.955-2.004 (t, 2H, aliphatisch, CH), 3.404-3.519 (m, 4H, aliphatisch, CH), 7.014-7.095 (d, 1H, aromatisch, CH), 7.215-7.255 (d, 1H, aromatisch, CH)13CNMR (300 MHz ) δ:18.8, 24, 25, 28, 32, 35, 36, 42, 48, 49, 51, 55, 59, 61, 68, 72, 116, 130,139,145,176. Masse (m/z) (ESI-MS): 389.2387[M+H] ⁺

2 zeigt eine Tabelle mit den Ergebnissen einer Docking-Studie gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung.
Das entwickelte NMS wurde für die Docking-Untersuchung verwendet, die verbesserte Docking-Wechselwirkungen mit maximalen Bindungswerten von - 8.2 Kcal/ mol für IL-6 und 6.2 kcal/ mol für TNF-α gegenüber 2AZ5 für TNF-α zeigte und lieferte die zweidimensional überlagert wurden.
Die klinische Prüfung oder Untersuchung des entwickelten NMS ergab, dass NMS (20 mg/kg) eine signifikantere entzündungshemmende Wirkung aufwies als die niedrige Dosierung (10 mg/kg). Die entzündungshemmenden Eigenschaften von NMS wurden durch seine Wirkung auf die Reduzierung entzündungsfördernder Zytokine wie IL-6 und TNFa, die Verhinderung von BPA, DSS-induzierter Mortalität und die Verringerung der Infiltration entzündlicher Zellen weiter verstärkt. Den Ergebnissen aller drei Modelle zufolge hatten hohe Dosen stärkere Wirkungen als niedrige Dosen. Weitere Hinweise aus den Ergebnissen legen nahe, dass es sich bei NMS um eine einzigartige Bufalin -ähnliche Verbindung handelt. Es wurde festgestellt, dass seine Wirksamkeit im Vergleich zu Bufalin und Telcinobufagin durch das Vorhandensein einer Hydroxylgruppe an C-11 und einer Methylgruppe an C-23 beeinflusst wird.
Die Zeichnungen und die vorstehende Beschreibung geben Beispiele für Ausführungsformen. Fachleute werden erkennen, dass eines oder mehrere der beschriebenen Elemente durchaus zu einem einzigen Funktionselement kombiniert werden können. Alternativ können bestimmte Elemente in mehrere Funktionselemente aufgeteilt werden. Elemente einer Ausführungsform können zu einer anderen Ausführungsform hinzugefügt werden. Beispielsweise können die Reihenfolgen der hier beschriebenen Prozesse geändert werden und sind nicht auf die hier beschriebene Weise beschränkt. Darüber hinaus müssen die Aktionen eines Flussdiagramms nicht in der gezeigten Reihenfolge implementiert werden; Es müssen auch nicht unbedingt alle Handlungen ausgeführt werden. Auch solche Handlungen, die nicht von anderen Handlungen abhängig sind, können parallel zu den anderen Handlungen durchgeführt werden. Der Umfang der Ausführungsformen wird durch diese spezifischen Beispiele keineswegs eingeschränkt. Zahlreiche Variationen, ob explizit in der Spezifikation angegeben oder nicht, wie z. B. Unterschiede in Struktur, Abmessung und Materialverwendung, sind möglich. Der Umfang der Ausführungsformen ist mindestens so breit wie durch die folgenden Ansprüche angegeben.
Vorteile, andere Vorzüge und Problemlösungen wurden oben im Hinblick auf spezifische Ausführungsformen beschrieben. Die Vorteile, Vorzüge, Problemlösungen und alle Komponenten, die dazu führen können, dass ein Nutzen, ein Vorteil oder eine Lösung eintritt oder ausgeprägter wird, dürfen jedoch nicht als kritische, erforderliche oder wesentliche Funktion oder Komponente von ausgelegt werden einzelne oder alle Ansprüche.

Claims

Ein System zur Entwicklung einer Formulierung für Methylsteroid aus Bufo melanostictus, umfassend: eine Giftproben-Sammeleinheit, die so konfiguriert ist, dass sie eine wirksame Menge einer Giftprobe von Bufo melanostictus erhält; die Giftproben-Sammeleinheit umfasst einen Ohrspeicheldrüsen-Extraktionsmechanismus, der so konfiguriert ist, dass er eine körnige Flüssigkeit mit gelblicher Farbe aus den Ohrspeicheldrüsen von Bufo melanostictus erhält; und Trocknungssystem, das in das Gerät integriert ist, um die Entnahme einer getrockneten Giftprobe zu erleichtern. eine Chloroform-Versorgungseinheit, die so konfiguriert ist, dass sie eine wirksame Menge Chloroform als Lösungsmittel bereitstellt; und eine Formulierungsmischeinheit, die so konfiguriert ist, dass sie die Giftprobe und das Chloroform kombiniert, wodurch eine Formulierung für Methylsteroid entsteht, und wobei
System nach Anspruch 1, wobei der Extraktionsmechanismus der Ohrspeicheldrüse einen Stimulationsapparat umfasst, bei dem es sich entweder um eine kontrollierte elektrische oder mechanische Methode handeln kann, der die Kröte sanft dazu anregt, ihr Gift freizusetzen.
System nach Anspruch 1, wobei die Chloroform-Versorgungseinheit umfasst: ein Chloroform-Reservoir zur Aufbewahrung von Chloroform; ein Präzisions-Dosiermechanismus, der so konfiguriert ist, dass er Chloroform in genau den Mengen abgibt, die für den Formulierungsprozess erforderlich sind.
System nach Anspruch 1, wobei die Formulierungsmischeinheit Folgendes umfasst: eine Mischkammer, die mit Mischwerkzeugen ausgestattet ist, um eine Giftprobe und Chloroform effektiv zu kombinieren; und in das Gerät integrierte Temperatur- und Druckkontrolleinheiten zur Regulierung der Bedingungen in der Mischkammer während des Formulierungsprozesses.
System nach Anspruch 1, wobei die Giftproben-Sammeleinheit Folgendes umfasst: ein Extraktionsmechanismus der Ohrspeicheldrüse zur Gewinnung einer körnigen Flüssigkeit mit gelblicher Farbe aus den Ohrspeicheldrüsen von Bufo melanostictus.
System nach Anspruch 1, das außerdem eine Lösungsmittelgemisch-Zufuhreinheit umfasst, die so konfiguriert ist, dass sie eine Mischung aus Hexan und Ethylacetat in einem Verhältnis von 9:1 bereitstellt, und wobei die Formulierungsmischeinheit außerdem so konfiguriert ist, dass sie die Mischung in die Formulierung einbezieht.
System nach Anspruch 1, wobei die Lösungsmittelmischungs-Zufuhreinheit so konfiguriert ist, dass sie eine Mischung aus Ethylacetat und Methanol bereitstellt, und wobei die Formulierungsmischeinheit weiterhin so konfiguriert ist, dass sie die Mischung in die Formulierung einbezieht.
Eine Formulierung für Methylsteroid aus Bufo melanostictus, bestehend aus: eine wirksame Menge einer Giftprobe; und eine wirksame Menge Chloroform als Lösungsmittel, wobei die Giftprobe aus Bufo melanostictus gewonnen wird und wobei die Giftprobe eine körnige Flüssigkeit mit gelblicher Farbe ist und aus den Ohrspeicheldrüsen der Kröte gewonnen wird und wobei die Formulierung 10 g enthält getrocknete Giftprobe.
Formulierung nach Anspruch 8, die außerdem eine Mischung aus Hexan und Ethylacetat im Verhältnis 9:1 umfasst.