DE202023106818U1

DE202023106818U1 - System zur Entwicklung einer Formulierung für Epoxy-Steroide aus Bufo melanostictus und Formulierung dafür

Info

Publication number: DE202023106818U1
Application number: DE202023106818.9U
Authority: DE
Original assignee: Kakatiya Univ; KAKATIYA UNIVERSITY
Current assignee: Kakatiya Univ; KAKATIYA UNIVERSITY
Priority date: 2023-11-18
Filing date: 2023-11-18
Publication date: 2023-12-14
Anticipated expiration: 2033-11-19

Abstract

Ein System zur Entwicklung einer Formulierung eines Epoxidsteroids aus Bufo melanostictus , bestehend aus:
ein Giftsammel-Subsystem zur Entnahme von Giftproben aus der Ohrspeicheldrüse von Bufo melanostictus ;
ein Analysemodul zur Identifizierung und Trennung von gelblichem Exsudat aus den gesammelten Giftproben;
eine Lösungsmittelabgabeeinheit, die einen präzisen Abgabemechanismus zum Einbringen einer wirksamen Menge Ethylacetat in die Formulierung umfasst;
ein Speichersubsystem, das eine Aufnahmeeinrichtung für eine Hexan-Methanol-Mischung integriert, die als zusätzliche Komponente in der Formulierung verwendet werden soll;
eine Formulierungskontrolleinheit, die so konfiguriert ist, dass sie die Zugabe von genau 10 g der Giftprobe reguliert und überwacht, um die Konsistenz der Formulierung sicherzustellen; und
ein System zur Steuerung der Lösungsmittelmischung, um ein Verhältnis von Ethylacetat und Wasser von 6:4 in der Formulierung aufrechtzuerhalten.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Offenbarung betrifft ein System zur Entwicklung einer Formulierung für ein Epoxidsteroid aus Bufo melanostictus und dessen Formulierung, insbesondere ein neuartiges Epoxidsteroid, das aus der Ohrspeicheldrüse des Bufo melanostictus extrahiert und isoliert wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Von verschiedenen Tieren produzierte Gifte und Gifte enthalten eine Fülle wirksamer Verbindungen, darunter Proteine, Peptide und Neurotransmitter. In Kombination dienen diese Substanzen als Abwehrmechanismen gegen Raubtiere und verursachen bei Verzehr oder Kontakt schwere Schäden. Gifte können entweder von bestimmten Zellen oder Geweben innerhalb der Beute erzeugt oder über deren Ernährung aufgenommen werden. Gifte hingegen werden von speziellen Drüsen oder Geweben hergestellt und von giftigen Lebewesen über Werkzeuge wie Reißzähne, Stacheln oder Nematozysten direkt in den Blutkreislauf ihrer Beute abgegeben.
Trotz ihrer Gefahren hat der Mensch diese natürlichen Toxine und Gifte in der Vergangenheit für verschiedene Zwecke genutzt. Im Laufe der Zeit wurden Toxine, Gifte und ihre Derivate für therapeutische und diagnostische Anwendungen entwickelt. Bemerkenswert ist, dass mehrere derzeit auf dem Markt erhältliche zugelassene Verbindungen auf Toxinbasis aus verschiedenen Quellen wie Kegelschnecken, Eidechsen, Blutegeln und Schlangen stammen. Einige dieser Medikamente, wie Ziconotid , Exenatid , Lixisenatid , Bivalirudin , Desirudin , Captopril, Enalapril , Tirofiban , Eptifibatid , Batroxobin und Cobratid , stammen aus natürlichen Quellen, während andere synthetische Moleküle sind.
Insbesondere Schlangen produzieren größere Mengen Gift, was zur Entwicklung zahlreicher Medikamente führte und einen Vorteil gegenüber Lebewesen verschaffte, die geringere Mengen Gift produzieren. Analysetechniken zur Charakterisierung von Giftbestandteilen kleinerer Tiere, wie der Indischen Kröte Bufo melanostictus, wurden erst kürzlich entwickelt.
Colitis ulcerosa (UC), eine entzündliche Erkrankung, ist mit erhöhten IL-6- und TNF-α-Spiegeln verbunden, die häufig durch verschiedene Faktoren verursacht werden, darunter genetische Veranlagung, immunologisches Ungleichgewicht, Exposition gegenüber Umweltgiften und Verdauungsstörungen. Konventionelle Therapien für entzündungsbedingte Erkrankungen umfassen Steroide, Immunsuppressiva, 5-Aminosalicylsäure und ergänzende Behandlungen. Allerdings erfordern anhaltende und chronische Entzündungen eine kontinuierliche ärztliche Betreuung, und bestehende Medikamente haben Nachteile, was den Bedarf an neuen Medikamenten aus natürlichen Quellen mit potenziell geringeren Risiken unterstreicht.
Komplementäre Therapien wie die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM), insbesondere die Verwendung von Chansu aus der Asiatischen Kröte (Bufo gargarizans) und der Indischen Erdkröte Bufo melanostictus, werden in Asien zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen und Atemwegsinfektionen praktiziert. Krötengift, das eine bioaktive Verbindung namens Bufodienolide enthält, weist entzündungshemmende Eigenschaften auf, insbesondere gegen Entzündungen und bösartige Erkrankungen. Die genaue Molekülstruktur dieser Verbindung in reiner Form muss noch vollständig aufgeklärt werden, aber laufende Forschungen haben ein Bufodienolid mit vielversprechender entzündungshemmender Wirkung identifiziert.
Im Gegensatz dazu Bisphenol A (BPA) ist dafür bekannt, Organtoxizität hervorzurufen und kommt aufgrund seiner zunehmenden Verwendung in verschiedenen menschlichen biologischen Flüssigkeiten vor. Chronische Erkrankungen wie Diabetes, Fettleibigkeit, Fortpflanzungsprobleme, Geburtsfehler, Brustkrebs sowie Herz-, Atemwegs- und Nierenerkrankungen werden mit der BPA-Exposition in Verbindung gebracht. Es beeinflusst Entzündungssignale in menschlichen Adipozyten und Makrophagen, seine Auswirkungen auf die Stabilität des Endometriums als Reaktion auf oxidativen Stress und Veränderungen der Entzündungssignale bleiben jedoch unklar.
Aus der Sicht der vorangehenden Diskussion wird deutlich, dass ein Bedarf besteht, Steroide aus dem Gift der Indischen Kröte zu entwickeln, weshalb ein System zur Entwicklung einer Formulierung für Epoxidsteroide aus Bufo melanostictus und dessen Formulierung erforderlich sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Offenbarung betrifft ein System zur Entwicklung einer Formulierung für ein Epoxidsteroid aus Bufo melanostictus und dessen Formulierung sowie die anschließende klinische Untersuchung des hergestellten neuen Epoxidsteroids (NES). In der vorliegenden Erfindung wurde ein neuartiges Epoxidsteroid, NES, das aus der Ohrspeicheldrüse der Indischen Kröte (Bufo melanostictus) stammt, isoliert und mithilfe von IR-, 1D- und 2D-Methoden charakterisiert. In-silico-Studien zeigten seine hohe Affinität zu TNF-α und ermittelten seine LD50. Bei Tests an Mäusen mit durch Dextran- Natriumsulfat und Bisphenol A hervorgerufener Organtoxizität im Dickdarm, in den Nieren und in der Leber zeigte NES eine dosisabhängige Unterdrückung der IL-6- und TNF-α- Spiegel, was einen erheblichen Schutz bot. Die histopathologische Untersuchung und die Immunhistologie bestätigten außerdem die Fähigkeit von NES, die Zellerholung zu fördern und die CD 68-Expression zu unterdrücken. Dies war der erste Bericht darüber, dass NES potenzielle Schutzwirkungen gegen Organtoxizitäten im Gift der Indischen Kröte aufweist.
Die vorliegende Offenbarung zielt darauf ab, ein System zur Entwicklung einer Formulierung für Epoxidsteroide aus Bufo melanostictus bereitzustellen. Das System umfasst: ein Giftsammel-Subsystem zur Entnahme von Giftproben aus der Ohrspeicheldrüse von Bufo melanostictus ; ein Analysemodul zur Identifizierung und Trennung von gelblichem Exsudat aus den gesammelten Giftproben; eine Lösungsmittelabgabeeinheit, die einen präzisen Abgabemechanismus zum Einbringen einer wirksamen Menge Ethylacetat in die Formulierung umfasst; ein Speichersubsystem, das eine Aufnahmeeinrichtung für eine Hexan-Methanol-Mischung integriert, die als zusätzliche Komponente in der Formulierung verwendet werden soll; eine Formulierungskontrolleinheit, die so konfiguriert ist, dass sie die Zugabe von genau 10 g der Giftprobe reguliert und überwacht, um die Konsistenz der Formulierung sicherzustellen; und ein System zur Steuerung der Lösungsmittelmischung, um ein Verhältnis von Ethylacetat und Wasser von 6:4 in der Formulierung aufrechtzuerhalten.
In einer Ausführungsform umfasst die Formulierungskontrolleinheit außerdem eine Temperaturkontrollkomponente, um optimale Bedingungen für den Formulierungsprozess aufrechtzuerhalten.
In einer Ausführungsform umfasst das Analysemodul eine spektroskopische Technik zur detaillierten Charakterisierung der Giftkomponenten.
In einer Ausführungsform ist die Formulierungskontrolleinheit weiterhin dazu konfiguriert, die Formulierungsparameter basierend auf den spezifischen physiologischen Eigenschaften von Bufo melanostictus anzupassen.
In einer Ausführungsform umfasst die Lösungsmittelabgabeeinheit Sensoren zur Überwachung und Aufrechterhaltung der genauen Durchflussrate von Ethylacetat während des Formulierungsprozesses.
In einer Ausführungsform umfasst der präzise Abgabemechanismus ein Mikrofluidsystem, das mit programmierbaren Pumpen und Ventilen ausgestattet ist, um eine genaue und kontrollierte Einführung von Ethylacetat in die Formulierung sicherzustellen.
In einer Ausführungsform nutzt das Analysemodul spektroskopische Techniken, einschließlich Massenspektrometrie und Infrarotspektroskopie, zur detaillierten Charakterisierung und Identifizierung von Komponenten in den Giftproben.
In einer Ausführungsform ist das Lösungsmittelmischungskontrollsystem so konfiguriert, dass es die Verhältnisse von Ethylacetat und Wasser in Echtzeit dynamisch anpasst und dabei ein präzises Verhältnis von 6:4 für optimale Wirksamkeit und Konsistenz aufrechterhält.
Die vorliegende Offenbarung zielt auch darauf ab, eine Formulierung für ein Epoxidsteroid aus Bufo melanostictus bereitzustellen. Die Formulierung umfasst: eine wirksame Menge einer von Bufo melanostictus entnommenen Giftprobe; und eine wirksame Menge Ethylacetat als Lösungsmittel, wobei die Giftprobe aus Bufo melanostictus gewonnen wird Ohrspeicheldrüse, und wobei die Formulierung 10 g des Giftes enthält und wobei die Formulierung Ethylacetat und Wasser im Verhältnis 6:4 als Lösungsmittelmischung enthält.
Ein Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, ein System zur Entwicklung einer Formulierung für Epoxidsteroide aus Bufo melanostictus und dessen Formulierung bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, das Gift der Indischen Kröte zu sammeln und Epoxidsteroid zu extrahieren.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, die Wirksamkeit von NES, einem Epoxidsteroid aus dem Gift der Indischen Kröte, bei der Abschwächung der durch bestimmte Chemikalien verursachten Organtoxizität zu bewerten.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, die dosisabhängigen Wirkungen von NES auf die Reduzierung der IL-6- und TNF-α- Spiegel in Leber, Niere und Dickdarm zu bestimmen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, die histopathologische Erholung beschädigter Zellen in mit NES behandelten Organen zu bewerten.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, den Einfluss von NES auf die Immunhistologie zu untersuchen, insbesondere seine Unterdrückung der CD 68-Expression.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, NES als potenzielles Schutzmittel gegen Organtoxizitäten zu etablieren, die durch Dextran-Natriumsulfat und Bisphenol A im Gift der Indischen Kröte verursacht werden.
Um die Vorteile und Merkmale der vorliegenden Offenbarung weiter zu verdeutlichen, erfolgt eine detailliertere Beschreibung der Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen davon, die in den beigefügten Zeichnungen dargestellt sind. Es versteht sich, dass diese Zeichnungen nur typische Ausführungsformen der Erfindung darstellen und daher nicht als deren Umfang einschränkend anzusehen sind. Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen genauer und detaillierter beschrieben und erläutert.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Offenbarung werden besser verständlich, wenn die folgende detaillierte Beschreibung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen gelesen wird, in denen in den Zeichnungen gleiche Bezugszeichen gleiche Teile darstellen, wobei:

1 zeigt ein Diagramm der allgemeinen Struktur des erhaltenen NES gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung; und
2 veranschaulicht eine Tabelle, die die Ergebnisse des molekularen Andockens gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung zeigt.

Darüber hinaus werden erfahrene Handwerker erkennen, dass Elemente in den Zeichnungen der Einfachheit halber dargestellt sind und möglicherweise nicht unbedingt maßstabsgetreu gezeichnet wurden. Beispielsweise veranschaulichen die Flussdiagramme die Methode anhand der wichtigsten Schritte, die dazu beitragen, das Verständnis von Aspekten der vorliegenden Offenbarung zu verbessern. Darüber hinaus können im Hinblick auf die Konstruktion des Geräts eine oder mehrere Komponenten des Geräts in den Zeichnungen durch herkömmliche Symbole dargestellt worden sein, und die Zeichnungen zeigen möglicherweise nur die spezifischen Details, die für das Verständnis der Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung relevant sind um die Zeichnungen nicht durch Details zu verdecken, die für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, der Nutzen aus der Beschreibung hierin zieht, leicht ersichtlich sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG:
Um das Verständnis der Prinzipien der Erfindung zu fördern, wird nun auf die in den Zeichnungen dargestellte Ausführungsform Bezug genommen und für deren Beschreibung eine spezifische Sprache verwendet. Es versteht sich jedoch, dass dadurch keine Einschränkung des Umfangs der Erfindung beabsichtigt ist, da Änderungen und weitere Modifikationen des dargestellten Systems und weitere Anwendungen der darin dargestellten Prinzipien der Erfindung in Betracht gezogen werden, wie sie einem Fachmann normalerweise in den Sinn kommen würden in der Technik, auf die sich die Erfindung bezieht.
Der Fachmann versteht, dass die vorstehende allgemeine Beschreibung und die folgende detaillierte Beschreibung beispielhaft und erläuternd für die Erfindung sind und diese nicht einschränken sollen.
Verweise in dieser Spezifikation auf „einen Aspekt“, „einen anderen Aspekt“ oder eine ähnliche Sprache bedeuten, dass ein bestimmtes Merkmal, eine bestimmte Struktur oder ein bestimmtes Merkmal, das in Verbindung mit der Ausführungsform beschrieben wird, in mindestens einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Daher beziehen sich die Formulierungen „in einer Ausführungsform“, „in einer anderen Ausführungsform“ und ähnliche Formulierungen in dieser Spezifikation möglicherweise, aber nicht unbedingt, auf dieselbe Ausführungsform.
Die Begriffe „umfasst“, „umfassend“ oder andere Variationen davon sollen eine nicht ausschließliche Einbeziehung abdecken, sodass ein Prozess oder eine Methode, die eine Liste von Schritten umfasst, nicht nur diese Schritte umfasst, sondern möglicherweise andere Schritte nicht umfasst ausdrücklich aufgeführt oder diesem Prozess oder dieser Methode innewohnend sind. Ebenso schließen ein oder mehrere Geräte oder Subsysteme oder Elemente oder Strukturen oder Komponenten, denen „umfasst...a“ vorangestellt ist, nicht ohne weitere Einschränkungen die Existenz anderer Geräte oder anderer Subsysteme oder anderer Elemente oder anderer Strukturen aus andere Komponenten oder zusätzliche Geräte oder zusätzliche Subsysteme oder zusätzliche Elemente oder zusätzliche Strukturen oder zusätzliche Komponenten.
Sofern nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, allgemein verstanden werden. Das hier bereitgestellte System, die Methoden und Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sollen nicht einschränkend sein.
Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung werden im Folgenden ausführlich unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.
Ein System (100) für die Entwicklung einer Formulierung für ein Epoxidsteroid aus Bufo melanostictus umfasst: ein Giftsammelsubsystem (102) zum Extrahieren von Giftproben aus der Ohrspeicheldrüse von Bufo melanostictus ; ein Analysemodul (104) zur Identifizierung und Trennung von gelblichem Exsudat aus den gesammelten Giftproben; eine Lösungsmittelabgabeeinheit (106), die einen präzisen Abgabemechanismus (106a) zum Einbringen einer wirksamen Menge Ethylacetat in die Formulierung umfasst; ein Speichersubsystem (108), das eine Aufnahmeeinrichtung für eine Hexan-Methanol-Mischung integriert, die als zusätzliche Komponente in der Formulierung verwendet werden soll; eine Formulierungskontrolleinheit (110), die so konfiguriert ist, dass sie die Zugabe von genau 10 g der Giftprobe reguliert und überwacht, um die Konsistenz der Formulierung sicherzustellen; und ein Lösungsmittelgemisch-Kontrollsystem (112), um ein Verhältnis von Ethylacetat und Wasser von 6:4 in der Formulierung aufrechtzuerhalten.
In einer Ausführungsform umfasst die Formulierungskontrolleinheit (110) außerdem eine Temperaturkontrollkomponente (110a), um optimale Bedingungen für den Formulierungsprozess aufrechtzuerhalten.
In einer Ausführungsform umfasst das Analysemodul (104) eine spektroskopische Technik zur detaillierten Charakterisierung der Giftkomponenten.
In einer Ausführungsform ist die Formulierungssteuereinheit (110) außerdem dazu konfiguriert, die Formulierungsparameter basierend auf den spezifischen physiologischen Eigenschaften von Bufo melanostictus anzupassen.
In einer Ausführungsform umfasst die Lösungsmittelabgabeeinheit (106) Sensoren (106b) zur Überwachung und Aufrechterhaltung der genauen Durchflussrate von Ethylacetat während des Formulierungsprozesses.
In einer Ausführungsform umfasst der präzise Abgabemechanismus (106a) ein Mikrofluidsystem (106c), das mit programmierbaren Pumpen und Ventilen ausgestattet ist, um eine genaue und kontrollierte Einführung von Ethylacetat in die Formulierung sicherzustellen.
In einer Ausführungsform nutzt das Analysemodul (104) spektroskopische Techniken, einschließlich Massenspektrometrie und Infrarotspektroskopie, zur detaillierten Charakterisierung und Identifizierung von Komponenten in den Giftproben.
In einer Ausführungsform ist das Lösungsmittelmischungskontrollsystem (112) so konfiguriert, dass es die Verhältnisse von Ethylacetat und Wasser in Echtzeit dynamisch anpasst und dabei ein präzises Verhältnis von 6:4 für optimale Wirksamkeit und Konsistenz aufrechterhält.
Eine Formulierung für Epoxidsteroide aus Bufo melanostictus umfasst: eine wirksame Menge einer Giftprobe, die aus Bufo melanostictus entnommen wurde; und eine wirksame Menge Ethylacetat als Lösungsmittel, wobei die Giftprobe aus Bufo melanostictus gewonnen wird Ohrspeicheldrüse, und wobei die Formulierung 10 g des Giftes enthält und wobei die Formulierung Ethylacetat und Wasser im Verhältnis 6:4 als Lösungsmittelmischung enthält.
In einer Ausführungsform wird die Giftprobe aus der Ohrspeicheldrüse des Bufo melanostictus (Indische Kröte) entnommen. Die Giftprobe besteht aus gelblichen Exsudaten und wird gewonnen, indem zunächst die besagten Drüsen stimuliert und dann komprimiert werden, um die besagte Probe zu erhalten.
In einer Ausführungsform wird die Menge an Ethylacetat zum Pulverisieren der getrockneten Probe, wobei Ethylacetat als Lösungsmittel verwendet wird, für sieben Tage in einer bernsteinfarbenen Flasche verwendet. Nach dem Eindampfen des Ethylacetats werden 2 g Extrakt erhalten. Eine Hexan-Methanol-Mischung wird zur Trennung des 2 g-Extrakts verwendet, um sieben Fraktionen zu erhalten. Eine Methanol-Wasser-Mischung wird zur Trennung der dritten Fraktion verwendet, um fünf weitere unterschiedliche Fraktionen zu erhalten, aus der die vierte Fraktion ausgewählt und abgetrennt wird, um das endgültige Epoxidsteroid zu erhalten.
Die Ohrspeicheldrüsen der gesammelten Kröten werden zunächst mit einer trockenen Bürste gereinigt, dann wird ein leichtes Reiben durchgeführt, um die Drüsen zu stimulieren, gefolgt von einem sanften mechanischen Druck, der mit einer sterilen Pinzette auf beide Drüsen ausgeübt wird, um die gelblichen Exsudate zu erfassen. Anschließend wird es zur Gewinnung der Drüsenflüssigkeit verwendet. Nachdem sie das besagte Gift erhalten haben, können die Kröten ihrem natürlichen Leben überlassen werden.
Nach dem Sammeln des Giftes wird es zur Extraktion und Trennung verwendet, die wie unten beschrieben durchgeführt wird.
Die 10 g des getrockneten Materials wurden zerkleinert und sieben Tage lang in einer bernsteinfarbenen Flasche mit Ethylacetat extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dann im Vakuum verdampft, um einen Extrakt (2 g) herzustellen. Sieben Fraktionen (Fr. 1 bis Fr. 7) wurden aus diesem Extrakt durch Säulenelution mit Hexan- Methanol (8.5:1.5 und 1.5:8.5 v/v) erhalten. Fr-3 (100 mg) wurde mittels Säulenchromatographie an Kieselgel in die folgenden Fraktionen aufgetrennt: Fr. A, B, C, D und E; Methanol: Wasser 8.5:1.5 bis 1.5:8.5 v/v. Fr. D (20 mg) wurde gewählt, weil es durch TLC in einen einzigen Bereich unterteilt wurde.
Das erhaltene Epoxidsteroid wird mehreren Studien unterzogen, nämlich der Insilco-Studie, der Studie zur akuten Toxizität, der Studie zur Leber-Nieren-BPA-induzierten Toxizität und der DSS-induzierten entzündlichen Kolitis-Studie, wobei diese Studien durchgeführt werden, um sein Potenzial für schützende Wirkungen zu testen. Die detaillierten Beschreibungen der genannten Studien werden im Folgenden systematisch beschrieben.
Insilco-Studien: Die Fähigkeit des NES, sich an die Ziele zu binden, wurde durch molekulare Docking-Studien zu Arzneimittel-Rezeptor-Wechselwirkungen bewertet, wobei die PDB-Ziele 2AZ5 für IL-6 und TNF-α eingesetzt wurden. Die Bindungsfähigkeit des NES wurde gemäß dem Standardverfahren16 unter Verwendung der Schrödinger-Softwareversion 2019 untersucht. Zum Zeichnen der NES-Struktur wurde Chem Bio Draw Ultra 12.0 verwendet. Der UCSF Chimera 1.10.1-Assistent nutzte die RCSB PDB, um spezifische TNF-α-Proteinstrukturen zu erzeugen, während Open Babel 2.4.0 dabei half, die Struktur in das PDB-Format zu übersetzen.
Studien zur akuten Toxizität: Die weiblichen Schweizer Albinomäuse wurden von Vyas Enterprises in Hyderabad gekauft und in einer geeigneten Quarantäne mit uneingeschränktem Zugang untergebracht. Sie wurden nach einer 10-tägigen Eingewöhnungszeit in den Versuch eingesetzt. Vor der Untersuchung wurden die Tiere zwölf Stunden lang ausgehungert. Zur Bestimmung der maximal tolerierten Dosierung (MTD) wurden 15 weibliche Schweizer Albinomäuse mit einem Gewicht von 18 bis 22 g verwendet. Alle Tests wurden gemäß den festgelegten Standards der Kakatiya- Universität durchgeführt und erhielten zuvor die Genehmigung des Institutional Animal Ethics Committee (IAEC/48/UCPSC/KU/2018) und der OECD-423-Richtlinien. Die Mäuse wurden in vier Gruppen aufgeteilt (n = 3) und erhielten unterschiedliche Dosen (2000 mg/kg, 1000 mg/kg und 500 mg/kg/ po). Über einen Zeitraum von 14 Tagen wurden Tests durchgeführt, um die Toxizität und Mortalität der Substanz zu bestimmen, Nebenwirkungen wurden aufgezeichnet und die physiologischen Daten jedes Tieres, einschließlich Veränderungen des Körpergewichts und Verhaltensänderungen, wurden aufgezeichnet.
Leber-Nieren-BPA-induzierte Toxizitätsstudien: Aus Mäusen beiderlei Geschlechts wurden vier Gruppen zu je sechs Mäusen gebildet, bestehend aus Kontrolle, BPA, NES (10 mg/kg) und NES (20 mg/kg). NES wurde in 100 Millilitern Wasser und 5 % Ethanol gelöst, um seinen Einfluss auf BPA-induzierte Schäden an Leber und Nieren zu untersuchen. Zwei Wochen lang erhielten die Mäuse der Kontrollgruppe gemäß dem Verfahren regelmäßig täglich Wassersonden. Mit Ausnahme der Kontrollgruppe erhielten alle Gruppen 14 Tage lang Trinkwasser mit 18 BPA 2 %. Den Tieren wurde eine orale NES-Behandlung verabreicht und am fünfzehnten Tag des Experiments wurden sie alle nach herkömmlichen Verfahren geschlachtet. Ihre Organe und ihr Serum wurden in vorher festgelegten Abständen entnommen und die Proben bis zur weiteren Untersuchung bei -20 °C aufbewahrt.
Studien zur DSS-induzierten entzündlichen Kolitis: In einer anderen Versuchsreihe wurden 24 Mäuse ausgewählt, und jede Gruppe bestand aus 6 Tieren. Zunächst wird der dritten Gruppe NES 10 mg/kg verabreicht; DSS wird dem zweiten gegeben; und zuletzt wird der vierten Gruppe NES 20 mg/kg verabreicht. Jedes Tier, mit Ausnahme der Kontrollgruppe, erhielt 14 Tage lang 2 % DSS, gelöst in Wasser, und NES-Dosierungen wurden gemäß dem üblichen Verfahren oral verabreicht. Die Serumproben jedes Tieres wurden am 15. Tag zusammen mit dem Dickdarmgewebe für weitere Untersuchungen einschließlich histologischer und immunhistochemischer Tests sowie der Zytokinquantifizierung entnommen.
1 zeigt ein Diagramm der allgemeinen Struktur des erhaltenen NES gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung.
In 1 lautet der IUPAC-Name des Epoxidsteroids Dihydroxy-2-methilhexadecahydronaphtho indenooxirenl-yl2H-Pyran-3-on. Die Ergebnisse der Charakterisierung des erhaltenen Epoxidsteroids zeigten, dass die isolierte Verbindung als gelber Kristall hergestellt wurde und die prozentuale Ausbeute 34 % betrug. Es wurde festgestellt, dass der Schmelzpunkt 325 ± 5 °C betrug. Eine DC-Untersuchung wurde unter Verwendung von Ethylacetat und Wasser in einer 6:4-Lösungsmittellösung durchgeführt, um einen einzelnen Fleck mit R _f = 0.91 zu erhalten. NES war ein pulverförmiges, gelbliches Molekül mit 16 Grad Ungesättigtheit. HR-ESI-MS (m/z für [M+H]+ 387.2529 (ber . 386.48) ergab die chemische Formel C23H30O5. Die Infrarotspektren von 2852 (CH, aromatisch), 2923 (CH, aliphatisch) und 1633.8 (C =O) wurden aufgezeichnet. Das ^1H -NMR zeigte eine 2H-Pyran-2-on-Einheit bei 7.32 (1H, d, J=2.8 Hz) und 6.58 (1H, brs).
Das ¹³C-NMR-Spektrum zeigte 23 Signale, von denen zwei auf sauerstoffhaltige Kohlenstoffe hindeuteten (δC 29.2 und 36.1) und fünf eindeutig auf die 2H-Pyran-2-on-Einheit zurückzuführen waren (δC 147.3, 115.2, 162.6 und 152.5). Eine gründliche mikroskopische Analyse mit COSY ergab, dass δC 115.2 neben einem quartären Kohlenstoff auch einen Methylkohlenstoff widerspiegelte. An Position 15 wurden OH-2, OH-4 und eine Epoxidgruppe basierend auf Korrelationen zwischen HMBC und HSQC nachgewiesen. Das Vorhandensein von Protonylepoxid wurde durch die HMBC-Korrelationen zwischen dem Carbonyl bei δC 162.6, dem Methylkohlenstoff bei δH 3.16 und dem Triplettmethyl bei δH 3.16 gezeigt. Gemäß der Assoziation zwischen δH 1.63 und δC115.2 befand sich dieser an C-16. Als Ergebnis wurde Methylepoxid in der NES-Struktur gefunden. Chem Draw wurde zur Berechnung der Elementaranalyse verwendet und die identifizierten Komponenten sind C, 72.43; H, 8.27; und O, 19.30 Uhr.
Das NES-PXRD-Muster zeigt einen markanten Peak bei 19.4, der der pulverförmigen kristallinen Steroidkomponente entspricht. Die Spektraldaten und die XRD-Kristallanalyse ermöglichten die Identifizierung des Moleküls als C23H30O5. Mithilfe von LC-HRMS wurde (M+H)+ identifiziert und die Existenz des Molekülions bei m/z 387.2529 verifiziert. Basierend auf der spektralen Untersuchung wurde die chemische Struktur bestimmt und der IUPAC-Name (Dihydroxy2-methilhexadeca hydronaphthoindenooxirenl-yl-2H-Pyran-3-on) vergeben.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Formulierung für ein Epoxidsteroid aus Bufo melanostictus bereit, umfassend: eine wirksame Menge einer aus Bufo melanostictus entnommenen Giftprobe; und eine wirksame Menge Ethylacetat als Lösungsmittel.
In einer Ausführungsform wird die Giftprobe von Bufo melanostictus entnommen Ohrspeicheldrüse.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Giftprobe um ein gelbliches Exsudat.
In einer Ausführungsform umfasst die Formulierung eine Hexan-Methanol-Mischung.
In einer Ausführungsform enthält die Formulierung 10 g des Giftes.
In einer Ausführungsform enthält die Formulierung Ethylacetat und Wasser im Verhältnis 6:4 als Lösungsmittelgemisch.
2 veranschaulicht eine Tabelle, die die Ergebnisse des molekularen Andockens gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung zeigt.
Unter Bezugnahme auf die Tabelle in , unter Verwendung des NES, ergab die Docking-Analyse überlegene Docking-Wechselwirkungen; der höchste Bindungswert für TNF-α gegenüber 2AZ5 betrug -7.9 Kcal/ mol, und die Ergebnisse wurden in 2D überlagert, wie in Tabelle 2 gezeigt.
Die Ergebnisse der Studien zur akuten Toxizität, der histopathologischen Studien und der immunhistochemischen Analyse werden im Folgenden systematisch beschrieben.
Akute Toxizitätsstudie: Bei der Bestimmung der MTD (Maximum Tolerated Dose) wurden die OECD 423-Richtlinien befolgt, die 500 mg/kg betrug. Bei dieser Dosis wurde keine NES-Mortalität festgestellt, da die Tiere keine toxischen Symptome zeigten. Nach einer 14-tägigen BPA-Induktion von Leber- und Nierenschäden und einer NES-Therapie wurde Blutserum zur Beurteilung von Leberfunktionstests und Nierenfunktionstests verwendet. Um den Organschutz zu demonstrieren, wurden aus jeder der ausgewählten Gruppen Serum und Gewebe aus Leber oder Nieren entnommen, und NES 20 mg/kg reduzierte die Biomarker drastisch. Darüber hinaus kam es zu einer Abnahme von Kreatinin, Harnsäure, Harnstoff, ALT, AST und ALP. Die Werte von TNF-α und IL-6 waren in der BPA-Gruppe deutlich höher als in der Kontrollgruppe. Im Vergleich zu den DSS- und BPA-Gruppen zeigten die NES-Gruppen (10 und 20 mg/kg) deutlich verringerte TNF-α- und IL-6-Werte. Serum-IL-6-Spiegel in den Nieren und der Leber von BP. Die Anzahl der belasteten Mäuse verringerte sich erheblich von 182 ± 9.403 auf 69 ± 6.63 und von 169.4 ± 9.76 auf 85.4 ± 5.712, in dieser Reihenfolge. Bei der DSS-induzierten Colitis ulcerosa kam es ebenfalls zu einem deutlichen Rückgang der IL-6-Spiegel. Darüber hinaus sanken die Serum-TNF-α- und IL-6-Spiegel im DSS-Colitis-ulcerosa-Modell nach der BPA-Exposition dramatisch von 181.6 ± 9.502 auf 93.9 ± 7.25 bzw. von 148 ± 9.502 auf 79.8 ± 6.563 bei den Tieren.
Histopathologische Untersuchungen: In den entsprechenden Kontrollgruppen war die Morphologie des Leber-, Nieren- und Dickdarmgewebes normal. Andererseits kam es in der Nieren- und Leberbehandlungsgruppe (BPA) bzw. im mit DSS behandelten Dickdarm zu äußerst schädlichen histologischen Veränderungen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass NES-Dosierungen (10 und 20 mg/kg) die Menge der infiltrierten Zellen erheblich verringerten, was darauf hindeutet, dass sie möglicherweise eine schützende Wirkung gegen die Anomalien in der Histopathologie hatten. Die Kontrollgruppe (A) und die DSS-induzierte Gruppe (E) wurden mit der Kolitis-Gruppe verglichen. Im Vergleich zur DSS-Gruppe verbesserte sich die Heilung der Schleimhautschicht nach der Einnahme von NES 10, 20 mg/kg deutlich.
Immunhistochemische Analyse: Zur histologischen Untersuchung wurden Gewebeproben aus Niere, Leber und Dickdarm in 10 % gepuffertem Formalin gesammelt. Gemäß den Anweisungen des Verfahrens wurden die Gewebe mit der Standardtechnik zur Paraffineinbettung verarbeitet und 5 m-Schnitte wurden durch immunhistochemische Färbung mit Streptavidin-Biotin-Komplex (SB) gefärbt. 20 Bei der PBS-basierten Zellmethode wurde eine 1:100-Verdünnung des monoklonalen Mausantikörpers CD68 verwendet. Zur Bewertung der immunhistochemischen Markierung jedes Antikörpers wurde eine Skala verwendet. Punktzahl 1: Weniger als 25 % des Proteins werden in entzündlichen Geweben oder Zellen exprimiert; Score2: 25-50 % der Gewebe oder Zellen weisen eine Entzündung auf; Score3: 50-75 % der Gewebe und die Expression entzündlicher Zellen weisen auf eine Entzündung hin; und Score4: Die Mehrheit der entzündlichen Zellen oder Gewebe weist eine Gewebeentzündung auf. Es gab Unterschiede in der zytoplasmatischen Immunreaktivität zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen. Im Gegensatz zu den entzündlichen, glomerulären und tubulären Zellen in den Gruppen, die BPA und DSS ausgesetzt waren, zeigten glomeruläre und tubuläre Zellen in der Kontrollgruppe zytoplasmatische Reaktionen. Die Reaktivität von Dickdarm-, glomerulären und tubulären Zellen war in der mit NES (10 mg/kg) behandelten Gruppe geringer. Beide In den mit NES (20 mg/kg) behandelten Gruppen wurden glomeruläre und tubuläre Zellreaktionen beobachtet, und ihr Dickdarmgewebe erholte sich vollständiger als das der Kontrollgruppe.
Durch Hemmung der Freisetzung entzündungsfördernder Zytokine wie IL-6 und TNF-α im Blutserum und Gewebe aus Leber, Niere und Dickdarm sowie durch Senkung biochemischer Parameter (ALT, ALP, AST, Harnstoff, Harnsäure, und Kreatinin) bestätigt die vorliegende Erfindung, dass NES gute Schutzeigenschaften aufweist. In Zukunft könnte sich NES als nützliche neue Verbindung bei der Behandlung von Entzündungen erweisen. Aus dem Gift der Indischen Kröte Bufo melanostictus wurde ein neuartiges Epoxidsteroid isoliert, das ursprünglich als Bufodienolid -Steroid identifiziert wurde. Diese Studie wurde durch NES-Docking-Experimente und die inhärente entzündungshemmende Wirkung von Bufodienolid, das TNF-α und IL-6 unterdrückt, untermauert.
Die Zeichnungen und die vorstehende Beschreibung geben Beispiele für Ausführungsformen. Fachleute werden erkennen, dass eines oder mehrere der beschriebenen Elemente durchaus zu einem einzigen Funktionselement kombiniert werden können. Alternativ können bestimmte Elemente in mehrere Funktionselemente aufgeteilt werden. Elemente einer Ausführungsform können zu einer anderen Ausführungsform hinzugefügt werden. Beispielsweise können die Reihenfolgen der hier beschriebenen Prozesse geändert werden und sind nicht auf die hier beschriebene Weise beschränkt. Darüber hinaus müssen die Aktionen eines Flussdiagramms nicht in der gezeigten Reihenfolge implementiert werden; Es müssen auch nicht unbedingt alle Handlungen ausgeführt werden. Auch solche Handlungen, die nicht von anderen Handlungen abhängig sind, können parallel zu den anderen Handlungen durchgeführt werden. Der Umfang der Ausführungsformen wird durch diese spezifischen Beispiele keineswegs eingeschränkt. Zahlreiche Variationen, ob explizit in der Spezifikation angegeben oder nicht, wie z. B. Unterschiede in Struktur, Abmessung und Materialverwendung, sind möglich. Der Umfang der Ausführungsformen ist mindestens so breit wie durch die folgenden Ansprüche angegeben.
Vorteile, andere Vorzüge und Problemlösungen wurden oben im Hinblick auf spezifische Ausführungsformen beschrieben. Die Vorteile, Vorzüge, Problemlösungen und alle Komponenten, die dazu führen können, dass ein Nutzen, ein Vorteil oder eine Lösung eintritt oder ausgeprägter wird, dürfen jedoch nicht als kritische, erforderliche oder wesentliche Funktion oder Komponente von ausgelegt werden einzelne oder alle Ansprüche.

Claims

Ein System zur Entwicklung einer Formulierung eines Epoxidsteroids aus Bufo melanostictus , bestehend aus: ein Giftsammel-Subsystem zur Entnahme von Giftproben aus der Ohrspeicheldrüse von Bufo melanostictus ; ein Analysemodul zur Identifizierung und Trennung von gelblichem Exsudat aus den gesammelten Giftproben; eine Lösungsmittelabgabeeinheit, die einen präzisen Abgabemechanismus zum Einbringen einer wirksamen Menge Ethylacetat in die Formulierung umfasst; ein Speichersubsystem, das eine Aufnahmeeinrichtung für eine Hexan-Methanol-Mischung integriert, die als zusätzliche Komponente in der Formulierung verwendet werden soll; eine Formulierungskontrolleinheit, die so konfiguriert ist, dass sie die Zugabe von genau 10 g der Giftprobe reguliert und überwacht, um die Konsistenz der Formulierung sicherzustellen; und ein System zur Steuerung der Lösungsmittelmischung, um ein Verhältnis von Ethylacetat und Wasser von 6:4 in der Formulierung aufrechtzuerhalten.
System nach Anspruch 1, wobei die Formulierungskontrolleinheit außerdem eine Temperaturkontrollkomponente umfasst, um optimale Bedingungen für den Formulierungsprozess aufrechtzuerhalten.
System nach Anspruch 1, wobei das Analysemodul eine spektroskopische Technik zur detaillierten Charakterisierung der Giftkomponenten umfasst.
System nach Anspruch 1, wobei die Formulierungskontrolleinheit außerdem dazu konfiguriert ist, die Formulierungsparameter basierend auf den spezifischen physiologischen Eigenschaften von Bufo melanostictus anzupassen.
System nach Anspruch 1, wobei die Lösungsmittel-Abgabeeinheit Sensoren zur Überwachung und Aufrechterhaltung der genauen Durchflussrate von Ethylacetat während des Formulierungsprozesses umfasst.
System nach Anspruch 1, wobei der präzise Abgabemechanismus ein Mikrofluidiksystem umfasst, das mit programmierbaren Pumpen und Ventilen ausgestattet ist, um eine genaue und kontrollierte Einführung von Ethylacetat in die Formulierung sicherzustellen.
System nach Anspruch 1, wobei das Analysemodul spektroskopische Techniken, einschließlich Massenspektrometrie und Infrarotspektroskopie, zur detaillierten Charakterisierung und Identifizierung von Komponenten in den Giftproben nutzt.
System nach Anspruch 1, wobei das Lösungsmittelgemisch-Kontrollsystem so konfiguriert ist, dass es die Verhältnisse von Ethylacetat und Wasser in Echtzeit dynamisch anpasst und dabei ein präzises Verhältnis von 6:4 für optimale Wirksamkeit und Konsistenz aufrechterhält.
Eine Formulierung für Epoxidsteroid aus Bufo melanostictus, bestehend aus: eine wirksame Menge einer aus Bufo melanostictus entnommenen Giftprobe; und eine wirksame Menge Ethylacetat als Lösungsmittel, wobei die Giftprobe aus Bufo melanostictus Ohrspeicheldrüse gewonnen wird, und wobei die Formulierung 10 g des Giftes enthält und wobei die Formulierung Ethylacetat und Wasser im Verhältnis 6:4 als Lösungsmittelmischung enthält.