DE2013347A1

DE2013347A1 -

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Publication number: DE2013347A1
Application number: DE19702013347
Authority: DE
Priority date: 1969-03-28
Filing date: 1970-03-20
Publication date: 1970-11-19
Also published as: GB1260995A; FR2040060A5; JPS49509B1; IT948505B

Description

PATENTANWALT DR.-IKG. LOTTERHOS

•000 FRANKFURT (MAIN)

ANNASTRASSE 19 FERNSPRECHER· (0Ö11) 555061 TELEGRAMMEi LOMOSAPATENT LANDESZENTRALBANK 4/951 DRESDNER BANK FFM., Nr. 524749 POSTSCHECK-KONTO FFM-IiCT

FRANKFURT (MAIN), 18.3..197o

. Y/Kl ·

Ajinomoto Co., Inc., 7» 1-chome, Takara-cho, Chuo-ku, Tokyo, Japan, .

Verfahren zur fermentative η Produktion von Ir-Ühr eonin·

Die Erfindung bezieht sioh auf die Produktion von L-Threonin durch mikrobielle Fermentation und insbesondere aus Acetationen als hauptsächlichen Kohlenstofflieferanten·

L-Threonin ist eine der wesentlichen Aminosäuren und wird als Nahrungsmittel und Nahrungsergänzung benutzt. Bislang wurde es durch mikrobielle Fermentation von Nährmedien produziert) die Homoserin als ©in Substrat enthielten. Ss ist weiterhin bekannt, dass sich !-Threonin - wenn auch in sehr geringer Menge - bei dei mikrobielleη Fermentation von Nährmedien bildet, die Sohlenhydrate, wie Glucose oder Saccharose, als Hauptkohlenstofflieferanteil enthalten·

He- wurde Jetzt gefunden, dass viele Mikroorganismen die Fähigkeit haben, extracellular L»^fJhi8onin bsi der Fermentation von Nährmedien zu bilden, in denen die Acetationen den Hauptkohlenstofflieferanten bilden* So lassen sich L-Threoninkonaentrationen von 3 bis 4g/ loo.oom durch die Umwandlung von 15 - 2o % des Aoetation erueiehen, wenn

spezielle Arbeitsbedingungen aufrecht erhalten werden, wie weiter unten beschrieben wird. Bedeutende Mengen anderer Aminosäuren werden gleichzeitig nicht gebildet, und das gebildete L-Threonin lässt sich leicht aus dem Nährmedium isolieren·

Eaiigaäure oder deren lösliche Salze mit z. B. Kalium, Natrium, Ammonium oder Calcium können Lieferanten der Aoetationen sein. Beispiele für geeignete Stickstoff-Lieferanten für die Fermentation gemäss Erfindung sind: Harnstoff, Ammoniak sowie Ammoniumsalze, wie Ammoniumohlorid-, -sulfat oder -oarbonat. Ammoniumacetat kann als Lieferant sowohl für Kohlenstoff als auch für Stickstoff ' dienen. Das Fermentationsmedium sollte auch anorganische

Ionen und organische Wachstumsbeschleuniger, wie Vitamin B^, Hefeextrakte, Maisquellwaaaer, Sojabohnenproteinhydrolysat, Fischmehl, digeriertes Fischmehl (digested fish meal), Caseinhydrolysat u. dgl., die gewöhnlich für die Mikroorganismen nützlich sind, enthalten.

Folgende vier Bedingungen müssen für eine erfolgreiche L-Threoninproduktion gemäss Erfindung eingehalten werden:

(1) Die eingesetzten Mikroorganismen müssen die Fähigkeit haben, L-Threonin in einem Nährmedium zu produzieren, d_as Aoetationen als Hauptlieferant für assimilierbaren Kohlen-

t stoff enthält.

(2) Aoetat- und Ammoniumionen müssen in Abständen oder kontinuierlich während dtr Fermentation als Essigsäure oder deren Salze und als Ammoniak oder dessen Salzt oder gemeinsam ale Ammoniumaoetat zugeführt werden·

(3) Die Acetationenkonzentration muss während der Fermentations dauer in dem Fermentationsmedium*von 1,5 Gew.% gehalten werden.

' (4) Ptz pH-Wert dta Medium« muss zwischen 7,0 und 8,5 gehalten werden.

•unterhalb

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Bessere Ausbeuten erhält man, wenn man Kohlenhydrate, Glucose, Stärkehydrolysate oder Melassen in Abständen oder kontinuierlich während des Fermentation als sekundäre Kohlenstofflieferanten in sehr viel gelingeren Mengen als die Acetatiönen zuführt.

Pie gemäss Erfindung eingesetzten Mutantenstämme werden insbesondere mittels der konventionellen Siebtechnik auf Grund ihrer Fähigkeit Acetationen zu metabolisieren unter den künstlich induzierten Mutanten gefunden,, von denen bekannt ist, dass sie aus Kohlenhydraten als Kohlenstoff lief erant L-Threonin zu produzieren vermögen.

Die Mutanten «erden z» B. als gegenüber a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure (dinem Analogon von Threonin) resistente Mutanten mittels der üblichen artificiellen Mutanten-Induzierungsmethode aus einen Ursprungs(parentstamm der Genera Br e viba cter ium, Corynebact er ium, liier oc occus, Microbaoterium, Arthrobacter erhalten. Sie werden insbesondere dann gebildet, wenn man Zellen der Species Brevibacterium flavum und Corynebacterium acetoacidophilum der mutagenen Bestrahlung oder Chemikalien in konventioneller Weise aussetzt.

Folgende Mutantenstämme stellen Beispiele für geeignete Mikroorganismen dar und sind frei erhältlich von einer der Hinterlegungsstellen:

Brevibacterium flavum ATOC 21269 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 2127o.

Bei Durchführung des Verfahrens gemäss Erfindung wird ein sonst konventionelles Fermentationsmedium, das zunächst weniger als 4 % und vorzugsweise weniger als 2 % Acetationen enthält, mit einem geeigneten Mikroorganismus be#impft und während der Fermentation durch Schütteln oder Belüftung aerobe Bedingungen aufrechterhalten* Sind die anfänglich verfügbaren Acetationen verbraucht, werden die Acetationen und der Stickstofflieferant kontinuierlich oder in Ab-

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standtu wählend der Kultivierung in solchem Uasse ergänzt) dass die Acetatkonzentration in dem Medium innerhalb einer ' - oberen Grenze von 1,5 % oder 1,5 g / 1oo ecm und der pH-Wert «wischen 7,o und 8,5 gehalten wird.

Die Aoetatlconzentr ation und der pH-Wert werden in höchat einfacher Weise dadurch geregelt, dass man dem Fermentationsmedium eine Lösung aus Essigsäure und Ammoniumaoetat/einer Menge von o,o5 - 1,o Mol, Torzugsweise von o,1 - o,4- Mol, pro Mol Essigsäure und so wenig Wasser als zweokmässig zufügt, um das Medium nicht unnötig zu verdünnen· Liegt das Molverhältnis innerhalb des angegebenen Bereichs, wird die Aoetationenkonzentration automatisch innerhalb der P gewünschten Grenzen gehalten, wenn man den pH-Wert regelt·

Uebersohüssige Essigsäure hindert das Wachstum der Mikroorganismen und bei unzureichendem Zusatz an assimilierbarem Kohlenstoff bildet sich L-Thieonin nur in geringer Menge.

Werden gasförmiges oder wässriges Ammoniak oder Harnstoff als Stickstofflieferanten mit Essigsäure als Hauptkohlenstofflieferanten benutzt, müssen sowohl der pH als auch die Acetationenkonzentration sorgfältig überwacht und geregelt werden. In jedem Pail sollte die Essigsäure als wässrige Lösung mit mindestens 5° Gew.% Säure zugeführt werden.

Pie Kohlenhydrate, die das Wachstum der Mikroorganismen verbessern, können zusammen mit den Acetationen oder separat zugeführt werden. Die Isolierung des L-Threonins aus dem kultivierten Medium kann nach bekannten Methoden erfolgen, s. B. indem man die Bakterienzellen abfiltriert oder abaentrifugiert und das L-Threonin mittels eines Kationenaustauscherharzes vom H-Typ, partielles Eindampfen des Eluats unter vermindertem Druck und Ausfällen des Produktes aus dem Konzentrat isoliert. Das in dem kultivierten Medium angereicherte L-Threonin wird duroh Mikrobioversuoh (miorobroassay) unter Benutzung von ßtrepto-r ·

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coccus faecalis (ATCO 8ο43) berechnet.

DasVerfahren dex Erfindung soll durch die folgenden; Beispiele näher erläutert, hierauf aber nicht beschränkt «erden.

Beispiel 1 .

CBxevibacterium flavum ATCO 21269 wurde ein Saatkulturmedium folgender Zusammensetzung beimpft:

St är ke hydr οlya at · (Glue öse aouivale nt) Ammoniumacetat KH₂PO₄

MgS0₄.7H₂0

Mn⁺⁺ So jab ohnenpr öteinhydr oly aat Biotin Thiaminhydrochlorid Harnstoff 1,5 g / loo ecm ο »3 6 / 1'oo ecm ο»15 g / loo ecm o,o4 g / loo ecm

2 ρ «p.m.

2 ρ .ρ »m.

3,o asm / 1oo ecm 5o γ / Liter 300 γ / Liter o,2 g/ 1oo com

pH 8,o

Das Medium wurde 12 Stunden bei- 31 ,-5⁰O unter Schütteln und aeroben Bedingungen der Inkubation unterworfen.

Bin Fermentationsmedium wurde aus folgenden Bestandteilen hergestellt:

Ammoniumacetat

Natriumacetat . . ' ■.

KH^PO,,

MgSO

.. ++ Mn

Sojabohnenproteinhydrolysat Biotin Thiaminhydrochlorid Harnstoff o,8 g / 1oo ecm ο,41 g / loo ecm o,1 g / 1oo ecm o,o4 g / 1oo com

2 p.p.m.

1,o scm/ 1oo ecm 5ο γ / Liter 1-0OO γ / Liter ο „2 g / com

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15 oom der Saatkultui gab mau zu sterilisierten 500 ocm-Anaätzen des Fermentationsmediums in Glasfermentern und unterwarf das beimpfte Fermentationsmedium bei 3I,5⁰C unter Bühren von 135o Upm und Belüftung mit 1/2 Vol. Luft pro Minute der Inkubation.

Als sechs Stunden nach Beginn der Kultivierung der pH-Wert des Mediums auf nahezu 8,2 stieg, führte man 4o%ige wässrige Essigsäure und gasförmiges Ammoniak in automatisch geregeltem Maas ein, um die Acetationenkonzentration in dem Medium gerade unterhalb von 1,5 Gew.% und den pH zwischen 7,5 und 8,o zu halten.

Nach 48 Stunden hatten sich 1,91 g / I00 ocm L-Threonin in dem Kulturmedium - durch Verbrauch von Essigsäure in einer Menge von 18 Gew.% des initialen Fermentationsmediums - angereichert. Sie Essigsäure war somit in einer Ausbeute von 12,5 % in L-Threonin übergeführt worden.

3,6 g rohes, kristallines L-Threonin wurden aus 350 ecm Kulturmedium mittels konventioneller Methoden durch Adsorption des L-Threonins aus dem zentrifugieren Medium an einem Ionenaustauscherharz und Kristallisation aus dem Eluat nach Eindampfen unter vermindertem Brück gewonnen.

Beispiel 2

Fünf ölasfermenter wurden mit 300 ccm-Ansätzen eines Fermentationsmediums der weiter unten angegebenen Zusammensetzung beschickt und 1o Minuten bei 11o°C sterilisiert.

Ammoniumacetat 0,8 g / loo ocm

Natriumacetat o,41 g / I00 com

Stärkehydrolysat (Glucose äquivalent) 1,0 g / I00 ocm

Ammoniumsulfat υ,5 g / loo ecm

KH₂PO₄ o,1 6 / I00 ecm

MgSO₄.7H₂O o,o4 g / I00 ecm

Fe⁺⁺ 2 p.p.m.

Mn⁺⁺ 2 p.p.m.

Sojabohnenproteinhydrolysat 1,o ecm/ i_Oo com

Biotin 5o γ / Liter

O O 9 8 4 7 .'1 O C:. ^{0RIG1NÄL INSPECTED}

Thiaminhydrochlorid . 1οοο γ / Liter

Harnstoff ο,2 g / loo oom

pH 7*2

Alle Ansätze der Fermentationsmedien wurden mit 15 ecm der Saatkultur von Beispiel 1 beimpft und die Fermentationsmedien unter den Bedingungen des Beispiels 1 der Inkubation unterworfen»

Der pH-Wert der Fermentationsmedien stieg in allen Fermentern innerhalb von 6 Stunden nach der Beimpfung auf etwa 8,4. Er wurde in allen Fermentern durch Zusatz wässriger 6o%iger Essigsäurelösung, die Ammoniumacetat (amm.ac.) in verschiedenen Holverhältnissen - auf die Essigsäure (ac.ac.) bezogen - enthielt, auf weniger als 7,8 (gewöhnlich auf etwa 7,6) gehalten, wieues in Tabelle angegeben ist. Dieselbe Mischung wurde automatisch, wenn der pH-Wert wieder auf 7,7 stieg, jedem Fermenter in genügend grosser Menge zugeführt, um den pH-Wert auf 7»6 herabzusetzen. Die Zugaben wurden nach 47 Stunden gestoppt.

Nach 48 Stunden wurde in allen Fermentern das Bakterienwachstum durch Messung der optischen Dichte (O.D.) bei 562 πτμ in einer mit 26 Vol. Wasser verdünnt en Probe bestimmt. Desgleichen wurde das vorhandene L-Threonin bestimmt und der Umwandlungsgrad von Kohlenstofflieferanten (Acetationen und Glucose) in Threonin berechnet. Die Ergebnisse sind in !Tabelle 1 aufgeführt.

	: o,o5	Tabelle 1	L-Threonin	Umwandlungs- grad %
	j o,18 : o,4o	O.D.	I00 1 »4-5 g/ccm	11,6
Molverhältnis ac.ac. / amm.ac.	: 0,60	1,25	4,05 g/lääi 2,78 g/ocPm	2o,8 11,9
1	: 1,00	1,55 1,27	1,8o g/iPo'm	8,4
1 1	1,25	,. . ~ I00 1 »47 g/o cm	7,4
1	1,18
1

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Beispiel 3

Ansätse des in Beispiel 1 beschriebenen Saatkultuxmediums wurden mit Corynebacterium acetoacidophilum ATCO 2127ο beimpft und die Saatkulturen 12 Stunden bei 31⁰G unter Schütteln und aeroben Bedingungen der Inkubation unterworfen·

Ansätze des Fermentermediums des Beispiele 2 wurden mit 15 oom der entsprechenden Saatkulturen beimpft und - wie in Beispiel 2 - unter Zugabe der zuerst erwähnten Essigsäure-Aomoniumacetatlösung (Molverhältnis 1 : ο,25) der Inkubation unterworfen. Naoh 48 Stunden hatten sich 2,81 g / 1oo oom (Umwandlungsverhältnis 14,2 %) !-!Threonin " in dem Kulturmedium angereichert .J~5» 5 g kristallines

L-Threonin wurden aus 56o com Kulturmedium in konventioneller Weise gewonnen.

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Claims

Pat ent ansprüche

1. Verfahren zur Bildung von !-Threonin, dadurch, gekennzeichnet «dass ein L-Threonin produzierender Mikroorganismus in einem Nährmedium, das Acetationen als Hauptlieferant für assimilierbaren Kohlenstoff und einen Lieferanten für assimilierbaren Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen so lange kultiviert wird, bis sich in dem Medium eine wesentliche Menge L-Threonin angereichert hat, das aus dem Medium isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass während der Kultivierung die Acetationen und der Stickstofflieferant in dem Medium zur Aufrechterhaltung einer effektiven Acetationenkonzentration von weniger als 1,5 Gew.% und eines pH-Wertes zwischen 7»o und 8,5 in dem Medium ergänzt werden· '

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Ergänzung der Acetationen und des Stickstofflieferanten dem Medium eine wässrige Essigsäure lösung mit o,o5 - 1,o Mol Ammoniumacetat pro Mol Essigsäure zugeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Stickstofflieferant gasförmiges Ammoniak, wässriges Ammoniak oder Harnstoff verwendet wird.

5* Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismen solche eingesetzt werden, die aus vegetativen Zellen von Brevibaoterium flavum und Corynebacterium acetoacidophilum nach Unterwerfung unter mutagenen Bedingungen und Auswahl der Mutanten erhalten wurden, die Threonin in einem Aoetationen als Hauptkohlenstofflieferanteη enthaltenden Hährmedium zu bilden vermögen«

6. Verfahren nach Anspruch 1, daduroh gekennzeichnet, dass ala Mikroorganismus Brevibacterium flavum ATCO 21269

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7* Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Coxynebactarium acetoacidophilum ATCC 2127o eingesetzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, 2, $, 4-, 5, 6, 7, dadurch gekennzeichnet, dass das eingesetzte Nährmedium als zusätzlichen Lieferanten für assimilierbaren Kohlenstoff Kohlenhydrate, wie Glucose, Stärkehydrolysate oder Melassen enthält.

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