DE2000820A1 - Mundpflege-Produkte mit einem Gehalt an neutraler Prothease - Google Patents

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF

PATENTANWÄLTE β MÜNCHEN 2. HILBLESTRASSE

• Pr. Um Dtyl-Irifl. Kopf. I MQwchwi 8, Hllblwtrofl« 20 ·

BuZticiMn

19

9. Januar 1970

Anwaltsakte-Nr. 19 224

Monsanto Company .800 North Lindbergh Boulevard St. Louis, Miss. 63166/ USA

"Mundpflege-Produkte mit einem Gehalt an neutraler

Protease"

Die Erfindung betrifft Mundpflege-Zubereitungen mit einem Gehalt an Enzymen und insbesondere Mundpflege-Zubereitungen mit einem Gehalt an neutraler Protease.

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Es sind viele unerwünschte Affektionen bekannt, welche von einer ungenügenden Zahnhygiene herrühren, wie Zahnkaries, Infektionen, periodontale Krankheiten, etc. Einer dieser Zustände, der sich sehr rasch nach ein- bis zweitägigem Michtbürsten der Zähne entwickelt, ist die Bildung einer weichen Masse an der Zahnoberfläche, welche als Belag erwähnt zu v/erden pflegt. Der Belag scheint in IP mehreren Stufen zu entstehen, wovon die erste eine Ablagerung von Speichelschleirastoff en auf der Zahnot^rfläche ist, welche anschließend überzogen v/ird un". später tief von Bakterien durchdrungen wird, v/elche in Cav iiuncihöhle zugegen sind. Diese Bakterien pflanzen sie Ί kontinuierlich fort und in Abhängigkeit von der Bakterienart können sie Nebenprodukte ausscheiden, v/elche schädlich für die Zähne und das Zahnfleisch sind. Eine gu^e Nflhr-

stoffquelle für ihre Portpflanzung sind irgendwelche I
A ! Nahrungsteilchen, welche im Mund verbleiben. Während der späteren Stufen der Belag-Bildung wird die Ablagerung gleichfalls mit merklichen Mengen von Hydroxylapatit imprägniert, welcher allmählich unter Steinbildung verhärtet. Meistens pflegt ein Zahnarzt diesen Stein durch Abkratzen zu entfernen.

Es wurden verschiedene Versuche zur Eindämmung der Bela_;~- Bildung gemacht, beispielsweise die Einbeziehung von

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1-Aiz; .Λ-Ιlischungen in herkömmliche Mundpflege-Produkte. Dieije Produkte enthielten Multi-Enzym-Komponenten, wie E.B. Proteasen, Lipasen und Amylasen zur Spaltung oder Zersetzung der verschiedenen Komponenten der Belages, wie Proteil.e, Stärke und Fette. Jedoch werden viele dieser Idschungen aus Tieren und Pflanzen erhalten und im Hinblick auf das große, für Dental-Produkte benötigte VoIufaen sind sie nicht in genügenden '!engen verfügbar, und ferner sind die Kosten dieser Mischungen wegen der begrenzten Lieferbarkeit hoch. Andere Mischungen, verfügbar aus ükroorganisi.ien, besitzen Komponenten, von denen die eine wiederum eine andere unter Herabsetzung der Aktivi-. tat der Enzyme inaktivieren kann. Desgleichen weisen vieT.e Mischun^an Komponenten mit extremen ρ -Werten für oinu optimale Aktivität auf, wodurch deren Wirksamkeit i:. Bereich der lundhöhle herabgesetzt wird.

Line Mundpflege-Zubereitung, welche nur ein einzelnes unzyn enthalt, das wirksam hinsichtlich einer Verzögerung de: Ul iuriis oder einer Entfernung des 3elages ist, würde ua'.ii r einen Fortschritt des Standes der Technik bear,!, en.

In übereinstiiuT-ung r.it der vorliegenden Erfindung wurde _;:;*■ "*u>-d:"-r., daß Zubereitungen, welche eine neutrale Protease

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-H-

und einen für die Mundhöhle pharmakologisch annehmbaren Träger enthalten, wirksam in der Verzögerung der Bildung oder in der Entfernung eines Belages sind. In diesen Zubereitungen sind nicht mehr als Spurenmengen an alkalischer Protease und Amylase vorhanden. Es ist völlig unerwartet, daß ein einzelnes, in eine Mundpflege-Zubereitung einbezogenes Enzym genauso oder noch wirksamer als eine Mischung von in diesen Zubereitungen enthaltenen I Enzymen sein würde. Darüber hinaus ist ein einzelnes Enzym nicht empfindlich gegenüber einem Angriff durch > andere Enzyme, wie dies der Fall bei Enzym-Mischungen sein kann. ·

Eine neutrale Protease, wie sie in dieser Anmeldung ver- ,

wendet wird, bezieht sich auf ein Metallo-Enzym, welches ^! y seine optimale Aktivität bei einem p_H~Wert von etwa 6 *·' bis etwa 8 besitzt, wird inhibiert durch Metall-Chelatbildner, jedoch nicht angegriffen durch solche Inhibitoren, wie Diisopropylfluorphosphat (DPP), und hydrolysiert Substrate, wie z.B. Purylacryloylglycyl-L-leucinamid (PAGLA), besitzt jedoch keine Aktivität gegenüber Estern, wie z.B. p-Nitrophenylacetat oder N-CBZ-Glycinp-nitrophenylester. Ein Metallo-Enzym ist eines, welches ein für die Aktivität erforderliches Metall enthält. Die alkalische Protease, wie sie in der vorliegenden

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ORtQtNALlNSPECTBJ

Anmeldung verwendet wird, bezieht sich auf ein Enzym, welches'seine optimale Aktivität bei einem p„-Wert von etwa 8 bis etwa 11 entfaltet, das durch DPP inhibiert wird, jedoch nicht durch Metall-Chelatbildner und welches eine Aktivität gegenüber Estern, wie z.B. N-CBZ-GIycinp-nitrophenylester, jedoch nicht gegenüber PAGLA, besitzt.

Die in der vorliegenden Erfindung brauchbare neutrale Protease kann von Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen gewonnen werden. Es wird bevorzugt, neutrale Proteasen mikrobiellen Ursprungs zu verwenden, weil diese in beträchtlichen Mengen auf ökonomische Weise hergestellt werden können. Diese Mikroorganismen können entweder vorwiegend neutrale Protease oder eine Mischung von neutraler Protease und anderen Enzymen produzieren.

Beispiele umfassen Bacillus-, Aspergillus- oder Streptomyces-Mikroorganismen, wie z.B. verschiedenartige B. subtilis-Stämme, wie z.B. B. subtilis-Stamm NRRL B-3411 (U.S. Department of Agriculture Collection, Peoria, 111.), B. subtilis-Stamm NRRL 644, B. subtilis-Stamm IAM 1523 (Japanese Culture Collection), von denen alle eine Mischung von Proteasen und Amylaee erzeugen. Andere Organismen umfassen B. therraoproteolyticus, Streptomyces

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OR!O«NAt

griseus, Aspergillus oryzae, Streptomyces rectus, Streptomyces naraensis und B. subtilis var amylosacchariticus, von denen alle entweder eine Mischung von Protease und Amyiase oder nur neutrale Protease erzeugen. Der Streptomyces griseus-Stamm K-I erzeugt vorwiegend neutrale Protease.

Eine besonders gute Quelle für neutrale Protease ist eine Enzym-Mischung, die durch den B. subtilie-Stamm NRRL Β-3^11 erzeugt wird. Ein Verfahren zur Herstellung dieses Organismus und der Enzyme daraus wird in der US-Patentschrift 3 031 380 beschrieben. Das durch diesen Organismus erzeugte enzymatisch aktive Material wurde allgemein als aus neutraler Protease, alkalischer Protease und Amyiase bestehend befunden. Es sind gewöhnlich etwa 700 000 bis etwa 1,5 Millionen Kasein-Einheiten an neutraler Protease-Aktivität pro Gramm isolierten Peststoffes und etwa 350 000 bis 500 000 Kasein-Einheiten an alkalischer Protease-Aktivität pro Oramm vorhanden, wie dies durch die Kasein-Verdauungsmethode (nachstehend beschrieben) bestimmt wird. Ee sind etwa 300 000 bis etwa 500 000 Einheiten an Amylase-Aktivität vorhanden, bestimmt nach der Bernfeld-Methode, welche nachstehend beschrieben wird. Wie in der zitierten Patentschrift ausgeführt wird, werden die relativen Verhältnisse von Protease zu Amyiase

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in Abhängigkeit von den exakten Wachstumsbedingungen der Mikroorganismen variieren, jedoch wurde gefunden, daß die neutrale und alkalische Protease und die Aniylase in zumindest beträchtlichen Mengen produziert werden, beinahe ohne Rücksicht auf Veränderungen des Kulturmediums und anderer Bedingungen des Wachstums der MikroorGanismen.

Ks sind verschiedene analytische Methoden zur Bestimmung der Enzym-Aktivität verfügbar, und es' kann z.B. die· Protease-Aktivität durch wohlbekannte Protein-Verdauungsmethoden unter Verwendung von Protein-Substraten, wie z.B. von Kasein, Hämoglobin, Rinder-Serumalbumin oder Gelatine bestimmt werden. Entsprechend solchen Versuchen katalysiert eine Protease die Hydrolyse eines Proteins (z.B. von Kasein) in einer bestimmten Zeiteinheit unter kontrollierten Bedingungen von Teuperatur, p^-Wert und Substrat-Konzentration; die Reaktion wird durch Zugabevon TrichloTcssißsäure gestoppt und die Lösung filtriert. Die solubilisierten Bruchstücke in dem Filtrat werden entweder durch Hessen der Extinktion im Ultraviolett-Bereic3i bestimr.it oder sichtbar durch Reaktion mit Folinphenol· Reagenz ger.acht und die Extinktion im sichtbaren Bereich (venessen und die Enzym-Aktivität in Form von ii . .'iouivalenten ausgedrückt. Dieses Verfahren ist

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BAD ORIGINAL

vollständiger im Journal of General Physiology, 30, (19^7) 291 und in .Methods of Enzymology, Vol. 2, New York: Academic Press 1955» 33 beschrieben.

In dieser Anmeldung soll in dem Fall, wo die neutrale Protease-Aktivität in Kasein-Einheiten ausgedrückt ist, verstanden 3ein, daß eine derartige Aktivität bei einem p„-Wert von 7 bestimmt ist und in dem Fall, wo die alkalische Protease in Kasein-Einheiten ausgedrückt ist, soll verstanden sein, daß eine derartige Aktivität bei einem p„-Wert von 10 bestimmt wurde.

Andere Verfahren zur Bestimmung der Protease-Aktivität machen Gebrauch von Substraten mit niederem Molekulargewicht in spektrophotometrischen Untersuchungen, z.B. ist das Substrat FAGLA spezifisch für neutrale Protease und es wird zur Bestimmung der Aktivität der neutralen "Protease verwendet, wie dies in Biochemical Biophysical Research Communications, 32, 326 (1968), beschrieben ist.

Die Amylase-Aktivität wird allgemein durch die wohlbekannte Dinitrosalicylsäure-Methode von Bernfeld, beschrieben in Methods of Enzymology, Academic Press, 1955, Vol. I, Seite 149, bestimmt. Gemäß diesem Test katalysiert

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COpV

2000320

Amylase die Hydrolyse von Stärke zu reduzierendem Zucker bei einer gegebenen Zeit und Temperatur. Die Reaktion wird gestoppt und die Farbe durch Zugabe von Dinitrosalicylsäure entwickelt. Die optische Dichte der Lösung wird nach einer Standard-Kurve, hergestellt mit bekannten Mengen von Maltosehydrat, abgeschätzt. In dieser Anmeldung ist in den Fällen, wo Aktivitätseinheiten von Amylase festgesetzt sind, darunter zu verstehen, daß die Bernfeld-Technik zur Bestimmung einer derartigen Aktivität angewandt wurde.

Die neutralen Proteasen besitzen als Gruppe genommen eine, von den alkalischen Proteasen, als Gruppe genommen, verschiedenartige Spezifizität. Zum Beispiel besitzen alkalische Proteasen Esterase-Aktivität, offensichtlich infolge ihree Wirkungsmechanismus und nicht infolge ihres p„-Optimum3, wohingegen die3 bei neutralen Proteasen ni-cht der Fall ist. Versuche, welche diese Tatsache beweisen, 3ind vollständiger in Arch. Biochem. Biophy3. 123» (1968) 572, beschrieben. Da die Spezifizität von neutralen und alkalischen Proteasen verschiedenartig 3ind, werden verschiedene Werte erhalten werden, wenn z.B. in den Untersuchungen Hämoglobin oder Rinder-Serumalbumin anstelle von Kasein eingesetzt wird. Beispielsweise haben eine neutrale. Protease, erhalten aua B. thermoproteolyticua

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und eine alkalische Protease, erhalten aus B. subtilis, Aktivitäten von 12 800 000 und 3 500 000 Einheiten/g, der Reihe nach, falls Kasein das Substrat ist; wenn jedoch bei sonst gleichen Bedingungen Hämoglobin eingesetzt wird, sind die Aktivitäten 240 000 und 400 000 Einheiten/g, der Reihe nach, d.h., die Aktivitäten von beiden sind geringer gegenüber Hämoglobin. Dementsprechend kann die Angabe der Enzym-Einheiten in verschiedenen Typen von Einheiten erfolgen und deshalb können bei den Anwendungen Enzyme auf Basis von gleichem Gewicht, gleicher Kasein-Aktivität oder gleicher Hämoglobin-Einheit, etc. verwendet werden.

Verschiedene Techniken können zur Abtrennung von neutraler Protease aus Enzym-Mischungen angewandt werden, wie z.B. die Ionenaustauschchromatographie, beschrieben im Journal of Biological Chemistry, 239, 3706 (1964) und in Agr. Biol. Chem. 30, 651 (I966). Eine andere Methode wird in der schwebenden Anmeldung No. 752 460, eingereicht am 14. August 1968 und auf den gleichen Rechtsnachfolger wie die vorliegende Anmeldung übertragen, offenbart. Das Ausgangsmaterial für diese Technik ist wasserklares Gärungsbier, enthaltend die Enzym-Mischung, erhalten durch Filtration oder Zentrifugieren, oder einen wässerigen Extrakt der Enzym-Mischung, erhalten durch Wiederauflösen

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ORIGINAL INSPECTS)

der rohen, lösungsmittelgefällten Enzym-Mischung. Die ' Amylase wird durch Lösungsmittel-Praktionierung in Anwesenheit eines Calciumsalzes oder durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung, gefolgt durch Stärke-Absorption, in Anwesenheit von wässerigem Äthanol zur Entfernung der letzten Spuren von Amylase, entfernt. Pigment wird durch Adsorption unter Verwendung von DEAE-Cellulose oder anderer Anionaußtauscher-Harze entfernt. Die zwei in Lösung zurückbleibenden Proteasen werden durch selektive Adsorption unter Verwendung von Hydroxylapatit als Adsorber fraktioniert. Die neutrale Protease wird adsorbiert und nachfolgend eluiert, wohingegen die alkalische Protease nicht adsorbiert wird.

Andere Methoden zur Stabilisierung von neutraler Protease in der Mischung können unter Verwendung von spezifischen Inhibitoren, wie z.B. von DPP oder einem Kartoffel-Inhibitor zur Inaktivierung der alkalischen Protease und sorgfältiger Lösungemittel-Fraktionierung zur Entfernung der Amylase durchgeführt werden.

Die neutrale Protease wird in einer solchen Menge verwendet, daß die Mundpflege-Zubereitungen der vorliegenden Erfindung etwa 50 Kasein-Aktivitätseinheiten bis etwa 800 000 Kasein-Aktivitätseinheiten pro Gramm der Mundpflege-Zubereitungen und vorzugsweise etwa 100 Kasein-

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Aktivitätseinheiten bis etwa 400 000 Kasein-Aktivitätaeinheiten pro Gramm der Mundpflege-Zubereitungen enthalten. Die Mundpflege-Zubereitungen geben beim allgemeinen Gebrauch eine einseine Gebrauchsdoaia von etwa 1000 Xasein-Einheiten neutraler Protease-Aktivität bis etwa 40 000 Kasein-Einheiten neutraler Protease-Aktivität und vorzugsweise etwa 5000 Kasein-Einheiten neutraler Protease-Aktivität bis etwa 20 000 Kasein-Einheiten neutraler Protease-Aktivität ab. Zum Beispiel wird ein Tropfen eines Mundwasser-Konzentrates mit etwa 200 0OO Kasein-Einheiten an neutraler Proteaee-Aktivität pro Gramm des Konzentrates mit etWt 50 ecm bis 100 ecm Wasser Ver dünnt und gibt als Mundwasser verwendet etwa 10 000 Einheiten neutraler Protease-Aktivität pro Einzel-Anwendung ab. In einem anderen Beispiel gibt eine Zahnpasta τοη etwa 8000 Kasein-Einheiten an neutraler Protetar-Aktivität pro Gramm Zahnpasta bei der Verwendung turn Bürsten der tähne etwa 8000 Kasein-Einheiten neutraler Protease-Aktivität pro Einsel-Anwendung ab. In noch einem anderen Beispiel geben 50 ecm eines Mundwassers, welches etwa 400 Kasein-Einheiten an neutraler Protease-Aktivität pro Gramm Mundwasser aufweist, bei der Verwendung etwa 20 000 Einheiten neutraler Proteaee-Aktivität pro Eineel-Anwendung ab.

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COPY

In den oralen Zubereitungen der vorliegenden Erfindung sind nicht mehr als Spuren-Mengen pro Gramm Zubereitung an alkalischer Protease und Amylase zugegen. Eine Spuren-Menge ist als weniger als 50 000 Kasein-Einheiten an alkalischer Protease-Aktivität und 50 000 Einheiten an Amylase-Aktivität pro 1 000 000 Kasein-Einheiten an neutraler Protease-Aktivität definiert. Es wird vorgezogen, weniger als 20 000 Kasein-Einheiten an alkalischer Protease-Aktivität und 20 000 Einheiten an Amylase-Aktivität pro 1 000 000 Kasein-Einheiten an neutraler Protease-Aktivität zu haben.

Die Anwendung oder der Gebrauch der Zubereitungen der Erfindung erfolgt, selbstverständlich in herkömmlicher Weise, indem man eine wirksame Menge an neutraler Protease-Zubereitung in Kontakt mit der Mundhöhle oder mit dem für eine besondere Anwendung interessierenden Teiles derselben bringt.

Die Produkte, in welchen neutrale Protease mit vorteilhaften Wirkungen verwendet werden kann, schließen Zahncremen, Zahnpulver, Mundwässer, Mundwässer-Konzentrate, Gurgelwä3ser, Kaugummis, flüssige Konzentrate etc. ein. Beispiele von typischen Rezepturen werden in der nachstehenden Tabelle I gegeben.

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copy

Tabelle I

	Paste	Pulver	Flüssig- keiten	Gummi
Komponente	51» %	95 %
Poliermittel	20 %	ι ;i	10 ;{
Anfeuchter	2 %
Verdickungs mittel oder Bindemittel	2 %	3 %	2 ^ ·	G %
Grenzflächen aktive Stoffe	20 %		68 %
Wasser	0,52	0,12		12 Si
Süßstoffe			20 JS	56 %
Alkohol	0,52	0,9#		H %
Aromastoffe				20 ^
Basis-Gummi

Poliermittel umfassen Tricalciumphosphat, Dicalciumphosphat und Calciumpyrophosphat. Anfeuchter umfassen Glycerol, Sorbitol oder Propylenglykol. Erläuternde Verdickungsmittel und Bindemittel umfassen Natriumcarboxymethylcellulose, Traganth-Gummi, Carrageenan-Gummi und Vinyl-PoIymere. Grenzflächenaktive Stoffe umfassen quartäre Ammoniumverbindungen und Dioctylnatriumsulfosuccinat. Süßstoffe umfassen Glucose oder künstliche Süßstoffe, wie z.B. Saccharin. Aromastoffe umfassen Anisol, Spearmint-Öl oder

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ORfGJNAL INSPECTED

Nelkenöl. Das Basis-Gummi umfaßt Chicle oder synthetische Harze.

Diese Hundpflege-Zubereitungen können in üblicher Weise, B.B. gemäß der Beschreibung in Kirk und Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, Ί, New York: Interscience, (195¹I) 928 bis 931, hergestellt werden.

Die Wirksamkeit der neutralen Protease kann durch in vitro- oder in vivo-Methoden bestimmt werden. Ein in vitro-Test ist vorteilhafter dadurch, daß keine Versuchsgegenstände und keine merklichen Mengen an Material erforderlich sind und er in einem viel kürzeren Zeitraum durchgeführt werden kann. Ein wirksamer Test wird durch Herstellung eines synthetischen Belages, Deponieren eines Films dieses Belages auf einer Glasplatte, Zugeben einer Enzym-Lösung auf den Film und Prüfung auf Film-Entfernung durchgeführt. Auf diese Weise, kann eine große Anzahl von Enzymen auf Belag-Entfernung „geprüft werden.

Zusammenfassend darf somit gesagt werden, daß die vorliegende Erfindung Mundpflege-Zubereitungen betrifft, welche neutrale Protease und einen Träger enthalten, beispielsweise ein Mundwasser-Konzentrat, enthaltend eine neutrale Protease, erzeugt durch B. subtilis.

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009830/1964 ., λ -_f ν ORfQlNAL INSPECTED

- 1 -ι -

Die folgenden 3ei3piele werden zur Erläuterung und keinesfalls zur Beschränkung dieser Erfindung vorgelegt. Alle Teile bedeuten Gewichtsprozente, bezogen auf die Gesamtzubereitung, es sei denn, daß etwas anderes ausdrücklich ■gesagt wird.

Beispiel 1

Neutrale Protease wird durch Impfen einer Kultur von B. subtili3 HRRL No. 3*111 in eine sterile Aufschlämmung von Getreidekörnern oder anderem Nährmaterial (wie z.B. Reiskleie, Maismehl, Fischmehl, Weizenkleie, Enzose (etwa 50 bis 802 Dextrose und der Rest höhere Saccharide, welche die getrockneten Mutterlaugen, die von der Dextrose-Herstellung duch enzymatische Hydrolyse von Maisstärke übrigbleiben, darstellen), lösliche Destillat-Rückstände, Mais-Einweichflüssigkeit etc.), enthaltend Protein, Kohlehydrate, Mineralien und Wachstumsfaktoren, erhalten, wobei der Behälter gerührt und durch sprudelndes Einleiten von steriler Luft durch die geimpfte Aufschlämmung belüftet wird. Der p_H-Wert kann-geregelt sein oder sich selbst überlassen bleiben, um seinen eigenen naturgemäßen p„-Wert zu erreichen. Aliquote Teile des Bieres werden zu verschiedenen Zeiten für Prüfungszwecke entfernt und, nachdem die Enzym-Produktion offensichtlich ein Maximum erreicht hat,

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das Wachstum beendet und anschließend neun (S) Liter des Gärungsbieres durch Z'entrifugation geklärt und anschließend mit 200 g DEAE-Cellulose (Diäthylaminoäthylcelluloseacetat ergibt einen p„-Wert von 6,4) bei einem p^-Wert von 6,4 30 Minuten lang zur Entfernung irgendwelchen Pigmentes gerührt. Das Cellulose-Harz wird durch Filtration entfernt und das Filtrat wiederum mit einer weiteren 100 g-Menge von DEAE-Cellulose in der gleichen Weise behandelt. 80 g Calciumacetat werden zu dem Filtrat von 8 Litern zugegeben, der powert auf 7»5 eingestellt und 2 240 g Ammoniumsulfat unter Rühren zugefügt. Nach Rühren bei 5°C während 30 Minuten wird der Niederschlag durch Filtration entfernt und eine weitere 900 g-Menge Ammoniumsulfat zu dem überstand zugegeben und der.Niederschlag durch Zentrifugieren gesammelt und in etwa 1 Liter einer 0,1^-igen Calciumacetat-Lösung wieder aufgelöst. 100 g gepulverte Weizenstärke- und 120 ml Äthanol werden zugegeben, die Lösung 20 Minuten lang gerührt und filtriert. 2 Liter kaltes (5°) Aceton wird ' zu dem Filtrat zugegeben und der¹ Niederschlag durch Zentrifugieren gesammelt, wiederum in 500 ml von 0,1^-igem CaI-ciumacetat gelöst und lyophilisiert.

250 mg dieses teilweise gereinigten Enzym-enthaltenden Feststoffes werden in 25 ml 0,02^-iger Calciumacetat-Lösung gelöst, der p_H-Wert auf 7»2 eingestellt und die Lösung auf

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eine 1,2 χ 7,Ocm-Säule von Hydroxylapatit aufgebracht, und mit 0,l#-igem Calciumacetat gewaschen. Nachdem die Enzym-Lösung auf der Säule mit ein wenig Calciumacetat-Lösung gewaschen worden ist, wird die Säule mit 0,2 M-Phosphatpuffer vom p„-Wert 7,0 e.luiert. Das eluierte Protein-Material (geprüft durch die Extinktion bei 280 mm) wird bei 5° gegen eine O,ljS-ige Calciumacetat-Lösung über Nacht dialysiert, zentrifugiert und lyophilisiert.

Das obiger Verfahren ergab anschließend 17 g eines teilweise gereinigten Enzym-enthaltenden Peststoffes. Zehn 250 mg-Teile dieses Peststoffes wurden unter Verwendung von Hydroxylapatit in der angezeigten Weise gereinigt und ergaben etwa 570 mg einer neutralen Protease, welche eine Aktivität von etwa 12,5 x 10 Kasein-Einheiten pro Gramm aufwies.

Ein Mundwasser-Konzentrat wird durch Zugabe einer neutralen Protease zu einer Mischung aus 80 Gew.-Ji Glycerin, und 20 Gew.-% Alkohol hergestellt, so daß die Aktivität etwa 8OOO Kasein-Einheiten/ccm der Mischung beträgt. Diese Mischung wird als ein Konzentrat hergestellt, welches bei der Anwendung zu verdünnen ist und als Mundwasser angewandt wird. · .

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ORIGINAL INSPECTED

Die Wirkung der neutralen Protease auf den Belag wird durch Abschätzen der Belagfläche auf den Zähnen der Versuchspersonen vor, während und nach dem Gebrauch eines Mundwassers; enthaltend die obige Mischung, bestimmt. Eine Versuchsgruppe von Freiwilligen wurde ausgesucht und deren Zähne überprüft und die Belagfläche durch ein numerisches Bewertungsverfahren einmal während 2 aufeinanderfolgenden Wochen zur Festsetzung eines Belag-Standardwertes für jeden für die j Bilanz des Versuches abgeschätzt. Zunächst wurden die Zähne fachmännisch gereinigt, um alle weichen Ablagerungen zu entfernen. Die Versuchspersonen verwenden dann täglich während eines Zeitraumes von 6 Wochen ungefähr 50 ecm Wasser mit einem Gehalt von 20 Tropfen der obigen Mischung als Mundwasser. Ihre Zähne werden in wöchentlichen Intervallen auf die GröAe dee Belages überprüft.

Die Belagfläche wird mit Hilfe einer erschließenden Tafel, hergestellt durch die Amural Company, abgeschätzt. Jeder sichtbare Zahn wird in 6 Segmente eingeteilt, 3 in der oberen Hälfte und 3 in der unteren Hälfte. Für jedes Segment wird eine Bewertung von 1 gegeben für eine Spur von Ablagerung, eine Bewertung von 2 für eine Ablagerung, welche weniger als die Hälfte des Segmentes bedeckt und eine

Bewertung von 3 für eine Ablagerung, welche mehr als die Hälfte bedeckt. Auf diese Weise wird eine Gesamtbewertung · für jeden sichtbaren Zahn nach jeder überprüfung abgeleitet. '

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Eine andere Gruppe von· Freiwilligen unterzog sich der gleichen Prozedur, jedoch enthielt das von diesen Versuchspersonen verwendete Mundwasser eine Enzym-Mischung, bestehend aus etwa 8000 Kasein-Einheiten an neutraler Protease, JJOOO Kasein-Einheiten an alkalischer Protease und 4000 Einheiten an Amyläse. Diese Enzym-Mischung wird in der gleichen Weise von B. subtilis NRRL B-3^11 erhalten, mit der Ausnahme, daß die alkalische Protease und die Amyläse nicht entfernt" werden. Die Belagsbewertung für jeden sichtbaren Zahn wird dann bestimmt.

Ein Hundwasser-Konzentrat, enthaltend neutrale Protease, wurde" gemäß dem obigen Verfahren hergestellt und an 8 Versuchspersonen verteilt. Diese Versuchspersonen verwendeten die Zubereitung in der erwähnten Weise und deren Belagsbewertungen sind in Tabelle II widergegeben. Ein anderes Mundwasser-Konzentrat wurde hergestellt, welches die Enzym-Mischung gemäß dem obigen Verfahren enthielt und an 8 Versuchspersonen abgegeben, welche die obige Anwendungsvorschrift befolgten. Deren Belagsbewertung ist in Tabelle III wiedergegeben.

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Tabelle II

	Verbleibender Anteil des ursprünglichen Belages nach 6 Wochen	Prozentuale Reduktion nach 6 Wochen
Versuchsperson Nr.	62	38
1	37	63
2	35	65
3	38	62
4	62	38
5	27	73
6	33	67
7 '	35	65
8	Tabelle III
	Verbleibender Anteil des ursprünglichen Belages nach 6 Wochen	Prozentuale Reduktion nach 6 Wochen
Versuchsperson Nr.	53	47
1	38	62
2 .	34	66
3	33	61
4	42	58
5	30 ..	70
6	40	60
7	40	60
8

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Aus den vorstehenden Daten ist leicht zu ersehen, daÄ die neutrale Protease den Belag wesentlich verringert.

Andere geeignete Mundwasser-Konzentrate wurden hergestellt, indem man die neutrale Protease des Beispiels 1, bei der

gleichen Aktivitätsstufe durch eine neutrale Protease, erhalten von B. subtilis NRRL No. 9¹Il, eine neutrale Protease von B. subtilis IAM No. 1523 (Japanese culture collection), eine neutrale Protease erzeugt durch Streptomyces griseus, eine neutrale Protease, erhalten von B. thermoproteolyticus und eine neutrale Protease, erhalten von B. Äubtilis var amylosacchariticus, ersetzt.

Beispiel 2

Um die Wirksamkeit von verschiedenen neutralen Protease-Enzymen zu untersuchen, wurde ein synthetischer Belag hergestellt. Eine Gruppe von Freiwilligen, welche ihre Zähne 2 Tage nicht gebürstet hatte, bürstete sich mit einer

sauberen trockenen Zahnbürste und sammelte den Speichel und die Zahnbürsten in einem sterilen Pläschchen.

Zur übertragung der Speichelproben auT sterile Plattenkultureri von Nähr-;Agar (Difco, 31 g/Liter, sterilisiert und in sterile Plastik-Petrischalen gegossen) wurde eine geglühte Impföse verwendet.

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Die geimpften Platten wurden bei 37⁰C 48 Stunden lang inkubiert und ein reichliches, mikrobielles Wachstum be^ obachtet. Visuell unterschiedliche Kolonien wurden entfernt, Objektträger mit Färbungen nach Gram hergestellt und geprüft. Ausgewählte Kolonien wurden auf sterile Nähr-Agar-Schrägkulturen für eine Beibehaltung in einer Kultursammlung sekundärkultiviert.

Große Mengen an ausgewählten Qrganismen wurden durch Impfen einer .Platinöse voll der Organismen aus den Schrägkulturen in Kolben mit steriler Nährbouillon (Difco, 9 g/Liter, 100 ml in 500 ml Stauflaschen (baffled flasks)) und Inkubieren in einer rotierenden Schüttelapparatur (New Brunswick Scientific Co.) bei 37° 3 Tage lang, erhalten. Die ^! Organismen wurden dann durch Zentrifugieren bei 5° in rostfreie Stahlflaschen (Sorvall, SS-3 Zentrifuge mit GSA-

Kopf, 9 600 Upm während 30 Minuten.) gesammelt und in dem ^: Minimal-Volumen Wasser zur Überführung in einen Glasbehälter wieder'suspendiert. Die gemischte Aufschlämmung von oralen Mikroorganismen wird im Kühlraum aufbewahrt.

Der Speichel wird in einem Becherglas gesammelt und mit einem gleichen Volumen der gekühlten bakteriellen Suspension vermischt. Sucrose wird zugegeben, um eine Endkonzentration von 1% zu erhalten.

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Ein ml der bakteriellenVSpeichel-Mischung wird auf eine 17,78 χ 17,78 cm (7 χ 7 inch) Glasplatte (mit durch Sandstrahlen angerauhter Oberfläche) placiert und die Mischung mit einem gebogenem Glasstab, verwendet für das Ausstreichen von Bakterien auf Platten, ausgestrichen. Der Film wird so lang ausgestrichen, bis er durch visuelle überprüfung als einheitlich beurteilt wird.

Die Platte wird' dann durch Inkubation bei 37°C über Nacht getrocknet. Enzym-Lösungen werden in destilliertem Wasser hergestellt und 1 Tropfen einer jeden Enzym-Lösung sorgfältig auf die Platte placiert und die Platte wieder bei 37°C während einer halben Stunde inkubiert. Die Platten werden dann über einem Bunsen-Brenner zur wiederholten Trocknung des Filmes sanft erwärmt. Die Filme werden durch sorgfältiges Gießen einer 1^-igen wässerigen Lösung von Kristallviolett (lg/100 ml) auf die Platte gefärbt. Nach Färben während 5 Minuten wird der Überschuß der Farbe abgegossen und die Platte behutsam in ein Bad mit kaltem Leitungswasser eingetaucht, sanft geschwenkt, anschließend entfernt und zur Beobachtung luftgetrocknet.

Das obige Verfahren wurde an den in Tabelle IV gezeigten Enzymen mit den dort angeführten Resultaten durchgeführt.

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Tabelle IV . Die Wirkung von Enzymen auf die Entfernung von synthetischem Belag

Ein Tropfen Enzymlösung, enthaltend unten angegebene Einheiten, wird auf die Belag-Platte getropft.

Ergebnisse sind angegeben als - (keine Pilmentfernung)

bis +++ (vollständige Pilmentfernung)

Enzym

Aktivität
u/mg (Substrat)

Verdünnung mg/ml

Ergebnis

O
O

to

B, subtilis NRRL B-3411, Neutrale Protease

B. subtilis NRRL B-3411, Alkalische Protease

B..subtilis var amyloäacchariticus,

Neutrale Protease

B. thermoproteolyticus, Neutrale Protease

B. subtilis NRRL B-3411,

Anyläse

110 (Albumin)
270 (Albumin)

195 (Albumin)
240 (Albumin)
15 000 (Stärke)

0,5
0,5
1

ro

CD CD O OO

Aus den obigen Daten kann leicht entnommen werden, daß die neutralen Proteasen Belag entfernen.

Beispiel 3

Eine Zahnpasta wird hergestellt, enthaltend etwa 7000 Kasein-Einheiten von neutraler Protease-Aktivität pro Gramm Zahnpasta. Die neutrale Protease wird durch B. subtilis NRRL B-3^11 hergestellt und wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Die Zahnpasta enthält zusätzlich zu dem Enzym die folgenden Bestandteile:

Sorbital-Wasser Mischung 43 %

Traganthgummi

Saccharin

Dioctylnatriumsulfosuccinat Dicalciumphosphatdihydrat

Insgesamt 100 %

Geeignete Zahnpasten werden hergestellt, indem man für die vorstehende neutrale Protease bei der gleichen Aktivitätsschwelle eine neutrale Protease, erhalten aus B. thermoproteolyticus und eine, erhalten aus B. subtilis NRRL einsetzt.

1	,5 %
1	,6 %
1	,1055
Rest

009830/1964

ORIGINAL fNSPECTEO

Beispiel *J

Eine Kaugummi-Zubereitung wird hergestellt, enthaltend etwa 2000 Kasein-Einheiten an neutraler Protease pro Gramm Kaugummi. Die neutrale Protease wird durch B. subtilis B-3^11 erzeugt und wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Zusätzlich zu der neutralen Protease enthält das Kaugummi :

Teile

Chicle · 100 ·

Gelatine kO

Wasser 60

Aromastoffe 20

Sucrose Rest

Insgesamt 520

Andere geeignete Kaugummis werden durch Ersatz der vorstehend erwähnten Protease bei der gleichen Aktivitätsschwelle durch eine neutrale Protease," erzeugt durch B. subtilis IAM 1523 und eine neutrale Protease, erzeugt durch B. thermoproteolyticus, hergestellt.

Beispiel 5 Ein Zahnpulver wird hergestellt, enthaltend 7000 Kasein-

- 28 009830/1964

Einheiten an neutraler.Protease pro Gramm Pulver. Die neutrale Protease wird durch B. subtilis NRRL Β-3Ί11 erzeugt und wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 erhalten. Zusätzlich zu der neutralen Protease enthält das Zahnpulver :

Teile

Carboxymethylcellulose 5,0 Dioctylnatriumsulfosuccinat 15»0 Pfefferminzöl 4,5 Dicalciumphosphatdihydrat Rest

Insgesamt 500

Ein anderes geeignetes Zahnpulver wird durch Ersatz der obigen neutralen Protease bei der gleichen Aktivitäteschwelle durch eine neutrale Protease, erzeugt durch B. subtilis var amylsacchariticus, hergestellt.

009830/1964 " ²⁹ "

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Mundpflege-Zubereitung, enthaltend einen für die Mundhöhle pharmakologisch annehmbaren Träger und eine neutrale Protease, welche in einer Menge anwesend ist, um etwa 50 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa 800 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen und"wobei die erwähnte Zubereitung nicht mehr als eine Spurenmenge von Amylase. oder alkalischer Protease enthält.

   2. Zubereitung nach.Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease in einer Menge anwesend ist, um etwa 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa 400 000 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.

   3..· Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, j

   daß die erwähnte neutrale Protease duroh einen Mikroorganismus erzeugt wird.

   4. Zubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Mikroorganismus ein Bacillus-Mikroorganis raus, AspergillUe-Mikroorganiemus und/oder Streptomyces-

   f I

   Mikroorganismus ist. ,

   009930/1994

   - 3o -

   ORIGINAL INSPECTS)

   5. Zubereitung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease durch einen Mikroorganismus der Gruppe B. subtilis, Streptomyces griseus, B. thermoproteoliticus, Aspergillus oryzae, Streptomyces rectus und/oder Streptomyces naraensis erzeugt wird.

   6. Zubereitung nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease durch einen B; subtilis aus der Gruppe B. subtilis NRRL B-3411, B. subtilis NRRL 644, B. subtilis IAM 1523 und/oder B. subtilis var amylosacchariticue erzeugt wird.

   7. Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease durch B. subtilis NRRL B-3411 erzeugt wird.

   8. Zubereitung nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease in einer Menge anwesend ist, um etwa 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa 400 000 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.

   9. Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease ih einer Menge anwesend ist, um etwa 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa J

   009130/1964

   - 31 - .

   ORIGINAL INSPECTED

   i|OO 000 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.

   Io.. Zubereitung nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease durch B. subtilis NRRL erzeugt wird.

   11. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Träger aus der Gruppe der Zahnpasten, Zahnpulver, Mundwässer, Mundwässer-Konzentrate, flüssigen Konzentrate und/oder Kaugummis ausgewählt ist.

   12. Zubereitung gemäß Anspruch 11, dadurch, gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease in einer Menge anwesend ist, um etwa 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa l|00 000 Kaeein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.

   13* Zubereitung nach Anspruch 3* dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Träger aus der Gruppe von Zahnpasten, Zahnpulver, Mundwässer, Mundwässer-Konzentrate, flüssige Konsentrate und/oder Kaugummis ausgewählt ist.

   1*1. Zubereitung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Träger aus der Gruppe von Zahnpasten,

   009830/19)54

   - 32 -

   Zahnpulvern, Hundwässern, Mundwässer-Konzentraten, flüssigen Konzentraten und/oder Kaugummis ausgewählt ist.

   15. Zubereitung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Träger aus der Gruppe von Zahnpasten, Zahnpulvern, Mundwässern, Mundwässer-Konzentraten, flüssigen Konzentraten und/oder Kaugummis ausgewählt ist.

   16. Zubereitung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease durch B. subtilis NRRL B-3^11 erzeugt wird.

   17. Zubereitung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Träger eine Zahnpasta ist.

   18. Zubereitung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Träger ein Mundwasser-Konzentrat ist.

   19. Zubereitung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease in einer Menge anwesend ist, um etwa 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa ¹IOO 000 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.

   20. Zubereitung nach Anspruch l6, dadurch gekennzeichnet,

   - 33 009830/1964

   daß die erwähnte neutrale Protease in einer Menge anwesend ist, um etwa 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa 400 000 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.

   21. Zubereitung nach Anspruch 17 ₃ dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease in einer Menge anwesend ist, um etwa 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa 400 000 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.

   22. Zubereitung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease in einer Menge anwesend ist, um 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa 400 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.