DE19949735A1 - Prozessieren von Proben in Lösungen mit definiert kleiner Wandkontaktfläche - Google Patents
Prozessieren von Proben in Lösungen mit definiert kleiner WandkontaktflächeInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft das Prozessieren von kleinsten Probenmengen, also das Ausführen von chemischen oder enzymatischen Reaktionen, von Aufreinigungen oder von analytischen Untersuchungen, in kleinsten Flüssigkeitsmengen in der Größenordnung von einem Mikroliter und darunter, insbesondere für sehr große Anzahlen von Proben in simultanen Prozessen. DOLLAR A Die Erfindung besteht darin, die bei kleinsten Flüssigkeitsmengen disproportional wachsenden Behälterwandkontaktflächen mit ihren größtenteils schädlichen Einflüssen durch die Verwendung von stehenden (oder hängenden) Tröpfchen als Mikroreaktoren für das Prozessieren zu verringern, wobei die Tröpfchen auf benetzungsfreundlichen (lyophilen) Ankern in ansonsten benetzungsfeindlichen (lyophoben) Oberflächen aufsitzen und daher eine wohldefinierte Wandkontaktfläche besitzen. Die Anker können in gewünschter Weise passiviert oder aber oberflächenaktiv gemacht werden, letzteres, um bestimmte Prozessierungsschritte zu unterstützen. Es ist auch möglich, elektrische, optische, fluidische oder andere mikrostrukturierte Elemente in den Träger zu integrieren, um das Prozessieren zu unterstützen. Die Erfindung betrifft das grundlegende Verfahren der Prozessierung im aufsitzenden Tröpfchen und entsprechend ausgestaltete Träger.
Description
Die Erfindung betrifft das Prozessieren von kleinsten Probenmengen, also das Ausführen von
chemischen oder enzymatischen Reaktionen, von Aufreinigungen oder von analytischen Unter
suchungen, in kleinsten Flüssigkeitsmengen in der Größenordnung von einem Mikroliter und
darunter, insbesondere für sehr große Anzahlen von Proben in simultanen Prozessen.
Die Erfindung besteht darin, die bei kleinsten Flüssigkeitsmengen disproportional wachsenden
Behälterwandkontaktflächen mit ihren größtenteils schädlichen Einflüssen durch die Verwen
dung von stehenden (oder hängenden) Tröpfchen als Mikroreaktoren für das Prozessieren zu
verringern, wobei die Tröpfchen auf benetzungsfreundlichen (lyophilen) Ankern in ansonsten
benetzungsfeindlichen (lyophoben) Oberflächen aufsitzen und daher eine wohldefinierte Wand
kontaktfläche besitzen. Die Anker können in gewünschter Weise passiviert oder auch oberflä
chenaktiv gemacht werden, letzteres, um bestimmte Prozessierungsschritte zu unterstützen. Es
ist auch möglich, elektrische, optische, fluidische oder andere mikrostruktierte Elemente in den
Träger zu integrieren, um das Prozessieren zu unterstützen. Die Erfindung betrifft das grundle
gende Verfahren der Prozessierung im aufsitzenden Tröpfchen und entsprechend ausgestaltete
Träger.
Es ist charakteristisch für die moderne Biochemie und Molekularbiologie, dass Proben zu
Hunderten oder sogar Tausenden simultan prozessiert werden. Unter "Prozessieren" soll hier
ganz allgemein das Ausführen von chemischen oder enzymatischen Reaktionen, von physikali
schen Veränderungen wie Ausfällen oder Binden an Teilchen oder Oberflächen, von pH-
gesteuerten, elektrochemischen oder thermischen Veränderungen wie beispielsweise Denatu
rierung von DNA, von Beseitigen von Lösungsbestandteilen durch Waschungen oder Ionen
austausch bis hin zu analytischen Untersuchungen vielfältigster Art verstanden werden. Es
kann sich dabei um eine einzige komplexe Probe handeln, die gleichzeitig vielen verschiedenar
tigen Prozessierungen unterworfen wird, beispielsweise Tausenden von verschiedenartigen
SNP-Analysen (SNP = Single Nucleotide Polymorphism), um eine detaillierte Genotypisierung
zu erhalten. Es kann sich aber auch um Tausende von verschiedenartigen Proben handeln, die
simultan, doch voneinander streng getrennt einem einzigen Prozessierungsverfahren unter
worfen werden. Beispielsweise können Tausende von Gewebeproben verschiedener Herkunft
auf ein einziges, fehlgebildetes Protein hin untersucht werden, um eine bestimmte Krankheit in
vielen Patienten simultan zu diagnostizieren. Auch Mischformen sind möglich, charakteristisch
bleibt aber das simultane, vielspurige Prozessieren.
Ein sichtbarerer Exponent dieser Entwicklung ist die sogenannte Mikrotiterplatte mit ihren
zunächst 96, dann 384 und jetzt 1536 Reaktionsgefäßen. In jüngster Zeit wurde eine Nano-
WellTM-Platte mit 3456 Reaktionsgefäßen vorgestellt. Eine Erhöhung dieser Anzahl ist nur eine
Frage der Zeit und der zur Verfügung gestellten Werkzeuge für das Prozessieren. Für die
bisher üblichen Mikrotiterplatten sind entsprechende Pipettier- und Bearbeitungsroboter mit
Ablagesystemen für viele Mikrotiterplatten, mit Multipipettenköpfen und Mehrfachdispenser
systemen entwickelt worden.
Ein anderer sichtbarer Exponent ist die Entwicklung von Prozessierungs-Chips, die sich die
Entwicklung elektronischer Mikrochips mit ihrer zunehmenden Beherrschung von Mikro
strukturen auch für die Miniaturisierung der biochemischen Prozessierung zunutze macht. Die
Entwicklung hier ist vielfältig, vom relativ einfachen Aufbringen von Tausenden von immobili
sierten Reaktionspartnern wie DNA-Fragmenten oder Antikörpern bis hin zu miniaturisierten
Laboratorien auf den Chips (so genannte "Lab-on-the-chip"-Technologie).
Als Beispiel sei hier die Entwicklungen von DNA-Chips zur hochparallelen Genexpressions
analyse oder für die klinische Diagnose genannt. Solchen Chips wird in der nahen Zukunft eine
besonders hohe wirtschaftliche Bedeutung zugemessen. In den USA wird für DNA-Chips ein
Marktvolumen von über eine Milliarde Dollar bereits für das Jahr 2001 erwartet. Es ist zu
erwarten, dass in naher Zukunft auch Proteinchips hergestellt werden, die verglichen mit DNA
eine größere Funktionalität aufweisen. Naheliegende Anwendungen sind hier Antikörperchips
für die schnelle und multiple Krankheitsdiagnose. Für Proteinchips ist ein ebenbürtiger, wenn
nicht noch größerer Markt zu erwarten, wie für DNA-Chips.
Die benötigten Mengen an Probenmolekülen für die chemische, enzymatische und analytische
Prozessierung sind dabei immer geringer geworden, die Prozessierung ist längst vom Nano
molbereich in den Pico-, Femto- und sogar Attomolbereich vorgedrungen. Nachteilig ist aber,
dass mit der fortschreitenden Verkleinerung der prozessierten Flüssigkeitsmengen der relative
Wandanteil der umschließenden Cavitäten in Bezug auf das Volumen immer größer wird.
Damit werden chemische und physikalische Einflüsse der Cavitätswände auf das Prozessie
rungsgeschehen immer kritischer. Ein einziger Quadratmillimeter Wand kann ein volles Pico
mol an biochemischem Analyt in einer monomolekularen Schicht adsorptiv binden und unter
ungünstigen Umständen der weiteren Behandlung vollständig entziehen.
Die Ausbildung der Oberflächen von biochemischen Gerätschaften ist entscheidend für den
analytischen Erfolg in der biochemische Spurenanalytik. Als ein Beispiel für den störenden
Einfluss adsorptiver Gefäßwände sei hier die massenspektrometrische Analyse eines Proteins
aus einer Trennung durch 2-dimensionale Gel-Elektrophorese angeführt, jedoch herrschen
nicht nur in der Proteomik, sondern auch in den weiteren Gebieten der Genetik und der Meta
bolomik ähnliche Verhältnisse.
Die Proteine werden nach ihrer Trennung im Gel angefärbt, kleine Gelstücke mit dem Protein
von Interesse werden um den Färbepunkt herum ausgeschnitten oder ausgestanzt. Die Gelstü
cke werden in ein kleines Gefäß gegeben und dort entfärbt. Auffüllen mit einer Enzymlösung
(beispielsweise Trypsin) führt zu einem gezielten Verdau an durch das Enzym vorgegebenen
Schnittstellen. Die Verdaupeptide haben bei Anwendung von Trypsin ein mittleres Molekular
gewicht von etwa 1000 atomaren Masseneinheiten. Diese Peptide können im Gel diffundieren,
sie wandern durch Diffusion langsam aus dem Gel in die umgebende Flüssigkeit und können,
nach Entnahme einer Flüssigkeitsmenge und Übertragung auf einen Probenträger, massenspek
trometrisch untersucht werden.
Dabei interessieren nicht nur die sehr konzentriert vorkommenden Proteine, die in Mengen von
etwa 10 bis 100 Picomol im Gel enthalten sind. Es interessieren häufig besonders die Proteine
kleiner Konzentrationen, die nur mit 10 bis 100 Femtomol vorhanden sind. Wenn nun ein
Verdaupeptid von beispielsweise 20 Femtomol Menge in 20 Mikroliter umgebende Flüssigkeit
austritt, werden die einzelnen Verdaumoleküle dabei in der Flüssigkeit umherschwimmen und
dabei auch mit der Wand des Gefäßes in Berührung kommen. Diese Flüssigkeitsmenge von 20
Mikrolitern hat in einem kleinen Gefäß von etwa drei Millimetern Durchmesser eine Wandbe
rührungsfläche von etwa 40 Quadratmillimetern. Ist diese Wand adsorptiv für eines der Ver
daupeptide, so kann sie sich leicht monomolekular mit diesem Verdaupeptid bedecken. Dabei
kann sie in einer einzigen monomolekularen Bedeckungsschicht insgesamt etwa 40 Picomol an
Verdaupeptid des Molgewichts von 1000 atomaren Masseneinheiten aufnehmen, also etwa das
2000-fache dessen, was in unserem Beispiel überhaupt in der Lösung zur Verfügung steht.
Selbst wenn die Adsorptivität der Gefäßwand durch geeignete Maßnahmen auf ein Tausendstel
reduziert werden könnte, würde immer noch das interessierende Verdaupeptid vollständig
adsorbiert werden können, und es wäre durch keine Maßnahme mehr wieder in Lösung zu
bringen.
Das hier gerechnete Beispiel von 20 Mikrolitern Probelösung betrifft aber eine Probenmenge,
die heute als groß erachtet wird. Geht man auf einen Mikroliter oder sogar 100 Nanoliter über,
so steigen die Einflüsse der Wandkontakte nochmals dramatisch an.
Es ist eine oft gehörte Meinung, die Adsorptivität einer Wand könne durch Hydrophobisierung
herabgesetzt werden. Das ist falsch. Für die Herabsetzung der Adsorptivität genügt es nicht,
die Oberfläche benetzungsabweisend (hydrophob) für die Analytlösung zu machen, im Gegen
teil, die Hydrophobie bindet hydrophobe und amphiphile Analytmoleküle in größerem Maße.
Die zwanzig Aminosäuren, aus denen alle Proteine bestehen, haben ganz verschiedenartige
Eigenschaften. Drei der Aminosäuren sind basisch, zwei sind sauer, sieben sind zwar chemisch
neutral, aber durch OH-, SH- oder CONH2-Gruppen hydrophil. Acht Aminosäuren aber, also
40% aller Aminosäuren, sind neutral und hydrophob. Sie haben alkylierte oder aromatische
Seitenketten und zeigen lipophilen Charakter.
Die Verdaupeptide unseres Beispiels werden einen mehr oder weniger großen Anteil an diesen
hydrophoben Aminosäuren enthalten. Befinden sich mehrere hydrophobe Aminosäuren neben
einander in der Polymerkette des Peptids, so zeigt sich hier eine deutlich überwiegende Hydro
phobie, oder zumindest eine Amphiphilie mit tensidem Charakter. Diese Peptide binden sich
entweder durch sogenannte "hydrophobe Bindungen" aneinander und hydrophilisieren sich so
gegenseitig nach außen (was bei den geringen Konzentrationen in nur sehr geringem Maße
eintritt) oder sie sammeln sich (wie Tenside) bevorzugt an der Oberfläche der Lösungsflüssig
keit. Treffen sie auf eine hydrophobe Wandfläche, so werden sie auch hier durch hydrophobe
Bindungen adsorbiert. Dieser Effekt ist die Grundlage der hydrophoben Assoziations-Chroma
tographie.
Für diese hydrophoben Analytpeptide ist es besser, ein Gefäß mit stark benetzbarer Oberfläche
zu benutzen, also eine eher stark hydrophile Oberfläche. Diese Oberfläche ist in der Regel mit
ziemlich fest gebundenen Wassermolekülen belegt. Es besteht daher auch nicht die Gefahr
einer Adsorption von hydrophilen Analytmolekülen, zumal diese in der Regel auch in der
Lösung mit Wassermolekülen umgeben sind. Gefäße mit hydrophilen Oberflächen bieten aber
die Gefahr von Randverschmutzungen an der Grenzfläche des Flüssigkeitsspiegels. Die
hydrophile Oberfläche führt zu sich ständig ausweitender Benetzung, zu einem Kriechen der
Flüssigkeit. Durch Volumenveränderungen, beispielsweise durch leichtes Eintrocknen, kann es
hier zu Ablagerungen, Auskristallisationen, Verkrustungen und anderen Randerscheinungen
kommen, denen vernünftig nur durch laufend steigende Flüssigkeitsmengen während des Pro
zessierens zu begegnen ist. Gerade für das Prozessieren von immer kleineren Probenmengen in
immer kleineren Flüssigkeitsmengen sind diese Randerscheinungen sehr nachteilig.
Es ist die Aufgabe der Erfindung, Verfahren und Vorrichtungen für das Prozessieren von
Proben in kleinen Flüssigkeitsmengen von etwa einem Mikroliter und darunter zu finden, die
die Gefäßwandkontaktflächen in ihrer Größe sehr klein halten, dabei aber diese Flächen unab
hängig von Schwankungen des Flüssigkeitsvolumens exakt definieren, und es so erlauben,
diese kleinen Gefäßwandkontaktflächen durch Oberflächenpräparationen definiert in die Pro
zessierung einbeziehen zu können.
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Vorrichtungen für das Prozessieren von Pro
benmolekülen in kleinen Mengen von Flüssigkeiten. Die Erfindung besteht darin, die Probe in
einem Tropfen zu prozessieren, der frei auf einem benetzungsfreundlichen (hier ganz allgemein
als lyophil bezeichneten) Anker in einer benetzungsfeindlichen (lyophoben) Umgebung einer
Unterlage steht oder an ihm hängt.
Der durch Oberflächenspannung zusammengehaltene Tropfen, der lyophile Anker, der lyopho
be Rand des Ankers und das den Tropfen umgebende Gas bilden also einen Mikroreaktor für
das Prozessieren. Die Unterlage wird hier Träger genannt. Der Träger kann beispielsweise eine
Platte in Größe einer Mikrotiterplatte, aber auch ein Chip sein, beispielsweise auf Silizium-,
Glas-, oder Kunststoftbasis. Der Chip kann neben den Ankern auch elektronische, fluidische
oder andere mikrostrukturierte Elemente enthalten. Bei richtiger Wahl des Tröpfchenvolu
mens, der Ankergröße, und des Lyophobie-Unterschiedes zwischen Anker und Umgebung
benetzt das Tröpfchen sehr scharf nur den Anker, nicht aber die lyophobe Umgebung. Im
Gegensatz zur Lever-Methode eines frei schwebenden Tröpfchens existiert bei dem erfin
dungsgemäßen Verfahren eine kleine, definiert große und definiert benetzte Wandfläche, die
durch geeignete Funktionalisierung in die Prozessierung einbezogen werden und bestimmte
Aufgaben übernehmen kann.
Die Erfindung betrifft sowohl das Verfahren der Prozessierung im aufsitzenden Tropfen wie
auch die Träger mit lyophilen Ankern bestimmter Belegungs- und Ausführungsarten in lyopho
ber Umgebung als Vorrichtung für dieses Prozessieren. Der Anker ist dabei bevorzugt ein
ebener Teil einer ebenen Oberfläche des Trägers, kann aber auch für besondere Zwecke eine
konvexe oder konkave Form haben. Wesentlich für die Erfindung ist die Konstanz der Benet
zungsfläche, die durch den Anker vorgegeben ist. (Träger mit hydrophilen Ankern in hydro
phober Umgebung für das Aufbringen von MALDI-Proben für die Massenspektrometrie,
jedoch ohne jedes chemisch-physikalische Prozessieren außer Trocknen, sind aus DE 197 54
978 bekannt. Eine Belegung der hydrophilen Anker mit Ionenaustauschern ist als DE 199 23
761 angemeldet.)
Es kann auf einem Träger eine außerordentlich hohe Anzahl an erfindungsgemäßen Mikrore
aktoren für die Prozessierung untergebracht werden. Selbst bei relativ großen Volumina von
500 Nanolitern, die Tropfen mit etwa einem Millimeter Durchmesser ergeben, können auf
einem Träger der Größe einer Mikrotiterplatte mit einem Rasterabstand von 1,5 Millimetern
3456 Tropfen untergebracht werden. Moderne Piezodispenser können aber wohl definierte
Tröpfchen wesentlich geringerer Volumina erzeugen, so dass auch noch wesentlich höhere
Tröpfchendichten erreichbar sind. Mit Tröpfchen von je 170 Nanolitern, die einen Durchmes
ser von etwa 0,7 Millimetern haben, ist bei 1,125 Millimter Rasterabstand eine Belegung mit
6144 Mikroreaktoren möglich.
Nach erstem Probenauftrag erfolgt die weitere Zugabe von Substanzen wie Lösungsmitteln,
Reaktionslösungen oder Regulationssubstanzen vorzugsweise berührungslos, um zusätzliche
Wandkontakte und damit verbundene Störungen auszuschließen. Hierfür eignen sich prinzipiell
folgende Methoden: (a) die Zugabe von beliebigen Lösungen durch berührungsloses Dispensie
ren, (b) die Zugabe reinen Lösungsmittels mittels Kondensation aus übersättigter Dampfphase
durch den Einsatz einer Feuchtigkeitskammer oder eines unten beschriebenen Verteilerdeckels,
(c) die Zugabe von gasförmigen Reaktanten oder Regulationssubstanzen aus der umgebenden
Gasphase, und (d) die Zugabe von Reaktionslösungen oder Lösungsmitteln durch einfaches
Aufsprühen, wobei sich die Flüssigkeit von den lyophoben Flächen auf die lyophilen Flächen
und somit zu den Probentröpfchen zurückzieht. Bei Mikrodispensern werden analog zur Tin
tenstrahldrucktechnik kleinste Flüssigkeitstropfen berührungslos auf das Zielsubstrat platziert,
wobei sich wohldefinierte Tröpfchen mit Volumina von etwa 50 bis 100 Picoliter erzeugen
lassen. Nicht berührungsfreies Auftragen kann (e) durch einfaches Tauchen der Träger gesche
hen, beispielsweise um einen Grundauftrag mit Reaktanten vor dem eigentlichen Probenauftrag
zu erhalten, aber auch (f) durch Vielfachpipettenköpfe, (g) durch Stempel ("Pin-Tools") oder
(h) durch fluidische Schaltungen auf dem Chip, die dem Tröpfchen Flüssigkeiten durch den
Anker hindurch zuführen können. Durch die unten beschriebene Kontaktübertragung von
Tröpfchen von einem Träger zum anderen können auch nicht berührungsfreie Auftragungsar
ten auf saubere Zwischenträger ohne Verschmutzung der Pipetten, Stempel, oder fluidischen
Zubringerkanäle eingesetzt werden. (Aus DE 196 28 178 ist das Auftragen von Proben mit
Vielfachstempeln oder Vielfachpipetten auf MALDI-Probenträger in Mikrotiterplattengröße
bekannt).
Durch vorsichtiges Umdrehen von Trägern können die dann hängenden Tropfen auch in di
rektem Kontakt oder durch gezieltes Abschütteln synchron von einem Träger zum anderen
übertragen werden, so dass verschieden funktionalisierte Träger nacheinander oder nicht be
rührungsfreie Zubringersysteme ohne Verschmutzungsgefahr benutzt werden können.
Die lyophilen Anker können in vielfältiger Weise funktionalisiert werden. So können Analyt
moleküle an geeignet präparierten Ankern durch Adsorption (beispielsweise an C18-präparier
ten Ankern), durch chemische Bindungen, durch Hybridisierung (DNA) oder durch Antikör
perbindungen vorübergehend oder dauernd immobilisiert werden. Im immobilisierten Zustand
können sie Reaktionen unterworfen, hybridisiert, enzymatisch verlängert oder verkürzt, oder
einfach nur durch Waschen von Bestandteilen der Reaktionslösung befreit werden. Es können
beispielsweise aber auch Schichten zur langsamen Abgabe von Reaktantmolekülen oder zum
Fangen schädlicher Reaktionsprodukte oder bestimmter Verschmutzungen aufgebracht wer
den, beispielsweise können Ionenaustauscher zum Einfangen von Metallionen dienen. Die
Anker können aber auch in ihrer physikalischen Ausformung in besonderer Weise für die Ana
lyse vorbereitet sein, beispielsweise durchsichtig oder spiegelnd für spektrometrische Untersu
chungen, oder sogar mit elektronischen, fluidischen, optischen und/oder mikromechanischen
Elementen versehen auf einem Chip für oberflächenanalytische oder optische Verfahren.
Die Tröpfchen können in gesättigtem Lösungsmitteldampf über längere Zeit vor dem Ein
trocknen bewahrt werden. Mit eng schließenden Deckeln lassen sich die Träger auch inkubie
ren, oder sogar, etwa für PCR-Amplifikationen, Temperaturzyklen unterwerfen. Die Deckel
können auch mit Einrichtungen für die gleichmäßige Zuführung gasförmiger Reaktant- oder
Regulationssubstanzen versehen sein.
Teiltrocknungsprozesse in trockener Luft erzeugen in den Tröpfchen sehr schnelle und unre
gelmäßige Wirbelströmungen, diese bilden einen äußerst effektiven Mischprozess, der für die
Beschleunigung von Reaktionen ausgenutzt werden kann.
Die Proben können teils in flüssigem, teils in getrocknetem Zustand in vielfältiger Weise analy
siert werden, beispielsweise colorimetrisch, absorptionsspektrometrisch (auch im UV oder IR),
fluoreszenzspektrometrisch, radiographisch oder massenspektrometrisch. Insbesondere können
auch sehr empfindliche oberflächenanalytische Verfahren eingesetzt werden, wie beispielsweise
"Surface Plasmon Resonance" oder "Surface Acoustic Waves".
Durch Trocknen oder Einfrieren können die Proben auch für längere Zeit lagerfähig gemacht
werden.
Abb. 1A zeigt einen Tropfen (1) auf der lyophoben Oberfläche (3) eines Trägers (2) mit
dem sich ausbildenden Randwinkel α. Abb. 1B zeigt einen Tropfen (1) des selben Volu
mens auf einem lyophilen Anker (4), der jetzt vollkommen benetzt wird, wodurch ein kleinerer
Randwinkel α gebildet wird. Dieser auf dem Anker aufsitzende Tropfen bildet den Mikrore
aktor, der dem erfindungsgemäßen Verfahren zu Grunde liegt. Abb. 1C zeigt, wie eine
gut lyophile Ankerfläche auch noch vollkommen benetzt wird, wenn sich das Volumen des
Tropfens (1) etwa durch Eintrocknen stark verringert hat; dabei hat sich der Randwinkel α
sehr stark verändert. Diese Größenkonstanz der Wandkontaktfläche ist ein wesentliches Merk
mal der Erfindung.
Abb. 2 zeigt eine Reihe von Tropfen (1) auf lyophilen Ankern eines Trägers (2), mit
einem Deckel (5), der ein Gasführungssystem (6) zur gleichmäßigen Zuführung der Gase oder
Dämpfe zu den einzelnen Tropfen und zu ebenso gleichmäßiger Abführung enthält.
Abb. 3 zeigt die gravitätsunterstützte Übertragung vieler hängender Tropfen gleichzeitig
von einem oberen Träger auf einen unteren Träger. Ein Rahmen (7) führt die Träger und hält
sie zunächst auf Abstand (Abb. 3A). Das Zusammendrücken der Federn (8) im Rahmen
(7) bewirkt die Kontaktnahme der Tropfen mit dem unteren Träger (Abb. 3B). Nach
vorsichtigem Entspannen der Federn (8) befindet sich der Hauptteil der Tropfen auf der unte
ren Platte (Abb. 3C). Mit der Anordnung lassen sich auch stehende Tropfen übertragen,
indem man die Platten erst im zusammengedrückten Zustand (wie in Abb. 3B) umdreht.
Die Sandwichanordnung nach Abb. 3B eignet sich bei geeigneter Ausführung der Träger
auch für eine Durchstrahlung der Tröpfchen, beispielsweise für absorptionsspektrometrische
Messungen.
Sitzt ein Tropfen auf einer Oberfläche wie in Abb. 1A mit einem Randwinkel a größer als
90° auf, das heißt, ist seine Benetzungsfläche kleiner als der Tropfendurchmesser, so spricht
man von einer benetzungsfeindlichen Oberfläche für diese Flüssigkeit. Diese Benetzungsfeind
lichkeit wird hier ganz allgemein als Lyophobie bezeichnet, in einer Erweiterung des Begriffs,
wie er in der Kolloidchemie für Partikel in einer Flüssigkeit gebraucht wird. Entsprechend wird
hier unter lyophil auch benetzungsfreundlich verstanden, der Randwinkel α ist dann kleiner als
90°.
Für eine benetzungsfeindliche Oberfläche sind die Anziehungskräfte der Moleküle der Flüssig
keit auf ein Oberflächenmolekül der Flüssigkeit größer als die Anziehungskräfte der festen
Oberfläche auf dieses Molekül. Der Randwinkel α wird durch die Oberflächenspannungen σ
der Flüssigkeit und des Festkörpers und durch die Grenzflächenspannung γ beschrieben:
cosα = (σfest - γfest-flüssig)/σflüssig.
Für sehr lyophobe Oberflächen in Bezug auf die verwendete Flüssigkeit ist die Benetzungsflä
che sehr klein und der Randwinkel sehr groß, bezogen auf gleiche Tröpfchengröße ist die
Benetzungsfläche kleiner als für weniger lyophobe Oberflächen. Da die Oberflächenspannung
der flüssigen Phase auch von der Größe des Tröpfchens abhängt, ist für kleine Tropfen eine
Benetzungsfläche zu beobachten, die im Verhältnis zum Tropfendurchmesser kleiner ist als für
größere Tropfen.
Versieht man die Festkörperoberfläche wie in Abb. 1B mit einem benetzungsfreundlichen
(lyophilen) Fleck, dessen Durchmesser größer ist als die Benetzungsfläche des Tropfens auf
der lyophoben Oberfläche, so wird der Tropfen genau diesen Fleck benetzen und an der
Grenzfläche zur lyophoben Oberfläche einen Randwinkel α ausbilden, der kleiner ist als der
Randwinkel ohne lyophilen Fleck. Dieser lyophile Fleck wird hier Anker genannt. Der Anker
ist vorzugsweise rund ausgebildet. Dieser Fleck braucht nicht wirklich lyophil im absoluten
Sinne zu sein, um diese Wirkung zu erzeugen; es genügt, dass er weniger lyophob ist als die
Umgebung. Seine geringere Lyophobie muss einen Randwinkel besitzen, der kleiner ist als der
des auf dem Fleck aufsitzenden Tropfens. Die Begriffe der Lyophilie und Lyophobie sind also
relativ zueinander zu sehen, die Grenze von 90° für den Randwinkel als Abgrenzung zwischen
Lyophobie und Lyophilie gilt hier nicht unbedingt.
Die Erfindung besteht nun darin, die Probe in einem Flüssigkeitstropfen zu prozessieren, der so
auf einem lyophilen Anker in einer lyophoben Umgebung einer Unterlage steht, dass er den
lyophilen Anker vollkommen benetzt, aber nicht die lyophobe Umgebung. Dieser erwünschte
Benetzungszustand kann leicht durch richtige Wahl des Tröpfchenvolumens, der Ankergröße,
und des Lyophobie-Unterschiedes zwischen Anker und Umgebung erreicht werden. Das Vo
lumen des Tröpfchen oder Mikroreaktors kann dabei unter Einhaltung der Benetzungsbedin
gung in sehr weiten Grenzen schwanken, wie aus den Abb. 1B und 1C ersichtlich.
Dieser durch Oberflächenspannung zusammengehaltene Tropfen, sein lyophiler Anker, der
lyophobe Rand um den Anker und das den Tropfen umgebende Gas bilden den Mikroreaktor
für das Prozessieren, wobei die Wechselwirkung des lyophoben Umgebungsrandes mit dem
Tropfen in der Praxis vernachlässigt werden kann, da sie nur wenige Moleküle in linearer
Anordnung betrifft. Bei porösen Ankern gehört das Porenvolumen mit zum Mikroreaktor, die
bei porösem Anker willkürlich vergrößerte Oberfläche kann für besondere Arten der Prozessie
rung, wie beispielsweise Ionenaustausch, oder für die Speicherung größerer Mengen an Ana
lytmolekülen genutzt werden.
Es sind in jüngster Zeit mehrere Verfahren zur Erzeugung extrem hydrophober Oberflächen
bekannt geworden, die sich für diese Erfindung einsetzen lassen. Neben der bereits bekannten
Beschichtung mit perfluorierten Substanzen wie PTFE (beispielsweise mit Teflon gibt es
Beschichtungen mit Lotos-Effekt (W. Barthlott und C. Neinhuis, "Purity of the sacred lotus, or
escape from contamination in biological surfaces", Planta 202 (1997), 1) oder mit organisch
anorganischen Sol-Gel Nanocompositmaterialien (DE 41 18 184), siehe beispielsweise R.
Kasemann, H. Schmidt, S. Brück, Bol. Soc. Esp. Ceram. Vid. 31-6, Vol. 7, (1992), 75. Die
Nanocompositmaterialien lassen sich auf Metallen, Glas oder Kunststoffen als wenige Mikro
meter dünne, kratzfeste Schichten einbrennen. Formteile aus geeigneten Kunststoffen wie
beispielsweise Polyethylen lassen sich oberflächlich in einem durch elektrische Entladung er
zeugten Fluorplasma perfluorieren. Auch Beschichtungen mit Teflon-artigen Materialien lassen
sich durch Zugabe keramischer Bestandteile höchst kratzfest machen.
Für die vorliegende Erfindung ist bedeutsam, dass die noch vor einigen Jahren herrschende
Lehre, die Oberflächen könnten in eine lineare Skala zwischen hydrophil (= lipophob oder auch
oleophob) und hydrophob (= lipophil oder auch oleophil) eingeteilt werden, heute als überholt
anzusehen ist. Sowohl die perfluorierten Oberflächen wie auch Bedeckungen mit Nanocompo
sitmaterialien sind nicht nur hydrophob, sondern gleichzeitig auch lipophob und ganz allgemein
lyophob für eine Reihe von wasserversetzten organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen oder
Acetonitril.
Das Prozessieren findet im Allgemeinen in waagerechter Ausrichtung der Unterlage statt, und
zwar mit den Ankern auf der Oberseite. Es ist aber auch möglich, in hängenden Tropfen auf
der Unterseite des Trägers zu prozessieren. Auch dann wird hier von "Unterlage" für die
Tröpfchen und ihre Anker gesprochen. Die Unterlage für die lyophilen Ankern auf lyophober
Oberfläche wird hier Träger genannt.
Die Erfindung betrifft dabei sowohl das Verfahren der Prozessierung im ankergebundenen
Tropfen, wie auch die Träger mit lyophilen Ankern bestimmter Belegungsarten in lyophober
Umgebung als Vorrichtung. Der Träger kann aus beliebigem Material sein, beispielsweise aus
Metall, Glas oder Kunststoff. Die Oberfläche kann glatt, aber auch porös sein. Auch die Form
ist beliebig; der Träger kann beispielsweise eine dünne Folie, eine Platte in Größe einer Mikro
titerplatte, aber auch ein mikrostrukturierter Chip sein. Träger in der Größe von Mikrotiter
platten haben den Vorteil, von kommerziell erhältlichen Pipettierrobotern prozessiert werden
zu können. Ein Chip hingegen kann auch elektronische, fluidische oder andere Mikrostrukturen
tragen, beispielsweise zur Unterstützung von analytischen Verfahren oder elektrochemischer
Prozessierungsschritte. So können auf dem Chip in den Ankern beispielsweise Dioden für die
Anregung der Fluoreszenz von Analytmolekülen in den Mikroreaktoren und Detektoren für
ihren Nachweis enthalten sein. Auch Detektoren für Messungen der Chemolumineszenz, die
bei Zugabe von Chemikalien bestimmte Analytmoleküle oder auch nur Analytmolekülformen
nachweisen kann, können eingebaut werden. Das Konzept des "Lab-on-the-Chip" lässt sich mit
den erfindungsgemäßen Mikroreaktoren, die sich von außen gut beladen lassen und somit das
Konzept in eine dritte Dimension öffnen, in wertvoller Weise erweitern, vor allem auch da
durch, dass durch die außenliegenden Mikroreaktoren eine höhere Prozessierungsdichte er
zeugt werden kann.
Die Träger sind zweckmäßigerweise mit automatisch lesbaren individuellen Kennungen verse
hen, die eine Verwechslung ausschließen und eine sehr genaue Verfolgung und Protokollierung
der Proben und ihrer Prozessierung in den Bearbeitungsrobotern erlauben. Die Kennungen
können beispielsweise aufgedruckte Barcodes oder auch eingearbeitete Transponder sein, die
von den Bearbeitungsrobotern gelesen werden können.
Der Erstauftrag vieler verschiedenartiger Proben, die vielen einzelnen Probengefäßen aus meh
reren Probentabletts entnommen werden müssen, auf einen Träger geschieht im Allgemeinen in
Pipettenrobotern unter Wechsel der Pipettenspitzen Probe nach Probe und ist nicht unproble
matisch, da der Probenauftrag in der Regel lange dauert und die Tröpfchen bei offener Be
triebsweise leicht eintrocknen. Das kann man aber auch ausnutzen, indem man die Proben
absichtlich trocknen lässt, gegebenenfalls in Schutzgas. Dadurch wird in der Regel der Träger
mit den Proben lagerfähig, ohne dass sich die Proben zersetzen oder sonst verändern. Die
Proben lassen sich später durch Zugabe von gleichartigen Reaktionsflüssigkeiten, die mit Viel
fachsystemen simultan und schnell erfolgen kann, weiter zeitparallel prozessieren. Sind die
Proben nicht trocken lagerfähig, so kann man die Proben auch auf einen gekühlten Träger
aufbringen, auf dem sie kurz nach dem Aufbringen einfrieren.
Nach erstem Probenauftrag müssen in der Regel Flüssigkeiten, manchmal auch Gase zugege
ben werden, wie Lösungsmittel, Lösungen mit Substanzen für chemische oder enzymatische
Reaktionen, Steuerungssubstanzen für den Ablauf der Prozessierung (beispielsweise zur Ände
rung der pH-Werte), Puffersubstanzen und so weiter. Die weitere Zugabe erfolgt vorzugsweise
berührungslos, um zusätzliche Wandkontakte und damit verbundene Störungen auszuschlie
ßen. Hierfür eignen sich prinzipiell folgende Methoden:
- a) die Zugabe von beliebigen Lösungen durch berührungsloses Dispensieren, wobei mit Piezo- oder Solenoid-Mikrodispensern oder auch Bubble-Jet-Systemen analog zur Tintenstrahl drucktechnik kleinste, aber wohldefinierte Flüssigkeitstropfen im Bereich von 50 bis 100 Pico liter Volumen berührungslos auf das Zielsubstrat platziert werden,
- b) die Zugabe reinen Lösungsmittels mittels Kondensation aus übersättigter Dampfphase durch den Einsatz einer Feuchtigkeitskammer oder eines unten beschriebenen Verteilerdeckels,
- c) die Zugabe von gasförmigen, löslichen Reaktant- oder Regulationssubstanzen (zum Bei spiel Ammoniak, Kohlendioxid, Stickoxide) aus der umgebenden Gasphase, die auch durch ein entsprechendes Deckelsystem zugeführt werden können, und
- d) die Zugabe von Reaktionslösungen oder Lösungsmitteln durch einfaches Aufsprühen, wobei sich die Flüssigkeit von den lyophoben Flächen auf die lyophilen Flächen und somit zu den Probentröpfchen zurückzieht.
Nicht berührungsfrei kann durch folgende Verfahren aufgetragen oder zugefügt werden:
- a) durch einfaches Tauchen der Träger, beispielsweise um einen Grundauftrag mit Reaktanten vor dem eigentlichen Probenauftrag zu erhalten,
- b) durch synchrones Pipettieren mit Vielfachpipettenköpfen, wobei die Pipettenspitzen zweck mäßigerweise stark lyophob zu wählen sind, um die Tropfen gut absetzen zu können,
- c) durch Stempeln, beispielsweise mit "Pin-Tools", bei denen die Flüssigkeiten an Nadelspit zen hängen, oder
- d) durch fluidische Schaltungen auf dem Chip, die dem Tröpfchen Flüssigkeitsmengen durch den Anker hindurch zuführen und entnehmen können.
Die Zugabe von Flüssigkeiten kann erfolgen, um Flüssigkeitsverluste durch Verdampfung
auszugleichen und somit das Volumen der erzeugten Reaktionsräume zeitlich konstant zu
halten, um Reaktionsmittel hinzuzugeben oder um die Reaktionsvolumina zeitlich gezielt zu
verändern. Die Veränderbarkeit der Reaktionsvolumina erlaubt die kontinuierliche zeitliche
Anpassung der Reaktionsvolumina an den Verlauf darin ablaufender chemischer Stoffumset
zungen. Es lassen sich somit zum Beispiel lineare Abnahmen durch Abdampfen, exponentielle
Anstiege, oder periodische Verläufe realisieren.
Statt der Lösungen können auch wässrige Suspensionen oder Aufschlämmungen aufgetragen
werden, die zum Beispiel Gelstückchen (mit Proteinen aus gelelektrophoretischen Trennun
gen), Gewebeproben, Viren, Zellen, Zellaggregate oder kleine feste oder gelartige Partikel für
Affinitätsaufreinigungen, Anreicherung oder oberflächenkatalysierte Stoffumsetzung enthalten.
Es ist ein wichtiger Gesichtspunkt der Erfindung, dass mit dem Entfernen der aufgebrachten
Flüssigkeitströpfchen auch die Reaktionsräume wieder verschwinden. Diese sind somit in ihrer
Natur temporäre Gebilde und unterscheiden sich damit grundlegend von starren Behältnissen.
Die Träger sind im Prinzip wiederverwendbar, wenn sie sich von allen Analyt- und/oder Reak
tantmolekülen genügend gut reinigen lassen.
Werden viele Reaktionsräume auf einem gemeinsamen Träger erzeugt, bestimmt der kleinste
Abstand zwischen benachbarten Räumen deren maximale Ausdehnung, und damit das maxi
male Reaktionsvolumen. Die Reaktionsräume können Volumina im Bereich von zehn Picoliter
bis maximal etwa zehn Mikroliter umfassen und in großer Zahl auf ein und denselben Träger
aufgebracht werden. Die Positionskoordinaten der Reaktionsräume sind durch das Design der
Oberfläche fest vorgegeben. Es können auf einem Träger außerordentlich hohe Anzahlen an
Mikroreaktoren für die Prozessierung untergebracht werden. Selbst bei relativ großen Volumi
na von 500 Nanolitern, die Tropfen mit einem Millimeter Durchmesser ergeben, können auf
einem Träger der Größe einer Mikrotiterplatte mit einem Rasterabstand von 1,5 Millimetern
3456 Tropfen untergebracht werden. Moderne Piezodispenser können aber Tröpfchen wesent
lich geringerer Volumina erzeugen.
Die hier definierten Mikroreaktoren in Tröpfchenform sind der Gefahr des Austrocknens aus
gesetzt. Man muss sie daher in besonderer Weise schützen, beispielsweise, indem man den
gesamten Träger in einen Raum gesättigten Dampfdrucks für das Lösungsmittel hält. Im All
gemeinen wird es sich bei biochemischer Prozessierung um Wasser als den Hauptbestandteil
der Lösung handeln. Dann muss besondere Vorsicht walten, da Wasserdampf leichter als Luft
ist, die wassergesättigte Luft nach oben strebt und trockenerer Luft Platz macht.
Sehr kleine Tröpfchen haben einen sehr hohen Dampfdruck, der weit über den Sättigungs
dampfdruck des Lösungsmittels hinausgehen kann. Bei Benutzung solcher winzigen Mikrore
aktoren müssen daher besondere Maßnahmen ergriffen werden, die die Tröpfchen selbst in
gesättigten Dampfräumen vor zu schneller Verdunstung retten. Beispielsweise können dazu in
bekannter Weise Zusätze zu der Lösung verwendet werden, die den Dampfdruck der Lösung
herabsetzen. Man kann dadurch sogar ein Gleichgewicht mit dem umgebenden Dampfraum so
herstellen, dass sich die Tröpfchengröße selbst einstellt und erhält. Andererseits ist es auch
möglich, durch Zugabe von schlecht verdampfbaren amphiphilen Substanzen in geringsten
Mengen eine Oberflächenschicht auf den Tröpfchen zu erzeugen, die den Durchtritt des Lö
sungsmittels und damit eine Verdunstung vermindert, wenn nicht sogar verhindert.
In jedem Fall aber ist es günstig, die Träger während des Ablaufs längerdauernder Prozessie
rungsschritte mit dicht schließenden Deckeln zu versehen, wie in Abb. 2 dargestellt.
Sollen beispielsweise Temperaturzyklen für PCR-Amplifikationen durchlaufen werden, so ist
eine solche Deckelung zwingend. Umfasst der Deckelraum etwa zwei Millimeter über einem
Träger in der Größe einer Mikrotiterplatte, so nimmt die Luft im Deckelraum bei Erwärmung
von 50 auf 90 Grad Celsius etwa 8 Milligramm Wasser auf, die bei Abkühlung wieder an die
Tröpfchen zurückgegeben werden. Befinden sich hier 1536 Tröpfchen zu je einem halben
Milligramm, so sind Verdunstung und Wiederkondensation kaum zu bemerken. Da jedoch der
Dampfdruck von der Tröpfchengröße abhängt, kann es bei vielen Zyklen sehr leicht zu Un
gleichgewichten kommen, größere Tröpfchen nehmen dann auf Kosten der kleineren Tröpf
chen zu. Hier kann es zweckmäßig sein, den Deckel mit Kammern zu versehen, die jeweils
einzelne Tröpfchengruppen oder sogar einzelne Tröpfchen umschließen.
Der Deckel für die Träger kann aber auch Zu- und Abführungssysteme für Gase und Dämpfe
enthalten, wie sie ebenfalls in Abb. 2 dargestellt sind. Dabei kann ein Verteilungssystem
im Deckel dafür sorgen, dass ein gleichmäßiges Erreichen aller Tröpfchen gewährleistet wird.
So können beispielsweise Ammoniak, Kohlendioxid oder Stickstoffoxide für Steuerung des
pH-Wertes zugeführt werden, ohne dass einzelne Tröpfchen in der Nähe einer Zuführungsöff
nung übersättigt und andere nicht erreicht werden.
Durch einen Teiltrocknungsprozess in trockener Luft beginnen in den Tröpfchen sehr schnelle
und unregelmäßige Jet- und Wirbelströme zu fließen, diese bilden einen äußerst effektiven
Misch- und Umrührprozess, der die Reaktionen in den Mikroreaktoren beschleunigt. So kön
nen insbesondere alle Flüssigkeitsmoleküle in kurzer Zeit einmal mit der Ankeroberfläche in
Berührung gebracht werden, wenn bestimmte Oberflächenprozessierungen an den Ankern
erfolgen sollen. Die dadurch verkleinerten Tröpfchen können durch Dispensersysteme berüh
rungslos wiederaufgefüllt oder mit weiteren Reaktantlösungen versehen werden. Die trockene
Luft für diesen Prozess kann ebenfalls über das Verteilsystem im Deckel zugeführt werden,
ebenso wie die dampfgesättigte Luft zum Anhalten des Teiltrocknungsprozesses.
Für das Übertragen der Tröpfchen von einem Träger auf einen anderen können Vielfachpipet
ten eingesetzt werden, es bieten sich aber auch andere Methoden an. Durch vorsichtiges Um
drehen von Trägern, eventuell nach Einfrieren, können die dann hängenden Tropfen auch
durch direkten Kontakt schwerkraftunterstützt von einem Träger zum anderen übertragen
werden, wobei durch einen Rahmen eine genaue Justierung von Position und Abstand ge
währleistet werden kann, wie in Abb. 3 gezeigt. Eine Federung im Rahmen mit Abstands
stopp erlaubt eine manuelle Handhabung der vorsichtigen Kontaktherstellung mit anschließen
dem Ablösen. Besonders einfach gelingt das Umdrehen der Träger, wenn sie sich im zusam
mengepressten Zustand wie in Abb. 3B befinden. Dabei beginnt man mit stehenden
Tröpfchen auf einer Geberplatte, bringt die Empfängerplatte von oben in Kontakt, dreht das
Plattensandwich um, und hebt die jetzt oben befindliche Geberplatte vorsichtig ab. Je nach der
Größe der Anker und ihrer Lyophilität werden schwerkraftunterstützt unterschiedliche Anteile
der Tröpfchen übertragen, es lässt sich aber eine gute Reproduzierbarkeit der übertragenen
Volumina erreichen.
Diese simultane Übertragung von vielen Tröpfchen kann auch genutzt werden, Reaktionsmittel
aus Vielfachpipetten auf probenbeladene Träger ohne Verschmutzung der Pipetten aufzutra
gen. Es wird dabei die Reaktionslösung mit der Vielfachpipette erst auf einen sauberen Träger
mit lyophilen Ankern aufgetragen, und die Tröpfchen dieses Trägers werden dann durch die
beschriebene Kontaktübertragung in einem Schritt auf die probenbeladene Trägerplatte über
tragen. Durch diese einfache Technik ist es möglich, die bisher bereits entwickelten Pipetten
köpfe mit 96 oder sogar 384 Pipetten weiter vollkommen verschmutzungsfrei zu benutzen.
Auch die Entwicklung von Pipettenköpfen mit 1536 Pipetten ist denkbar und brauchbar. Eine
solche Entwicklung könnte sogar von der Erfindungsidee Gebrauch machen, indem mikro
strukturierte Träger mit lyophilen Ankern und fluidischem Flüssigkeitstransport durch die
Trägerplatte zu den Ankerflächen versehen werden. Da sehr oft viele Träger mit der gleichen
Reaktionsflüssigkeit versehen werden müssen, ist eine solche Entwicklung lohnend. Ein Bei
spiel ist die Reaktionsflüssigkeit für PCR-Vervielfältigungen von DNA, die ohne die spezifi
schen Primer aufgetragen werden kann und somit für alle PCR-Prozesse immer gleich ist.
Die zusammengepresste Stellung der Platten, wie in Abb. 3B gezeigt, kann auch für elek
trophoretische Übertragungen von Substanzen genutzt werden, wenn Flüssigkeit und eventu
elle Isolierschichten auf den Ankern geeignet sind, Elektrolyse zu vermeiden. Durch eine star
kes elektrisches Feld zwischen den Trägern können oberflächengebundene Substanzen von
einer Trägerplatte zur anderen transferiert werden. Frei gelöste Substanzen können zu den
Ankern eines Trägers geführt werden. Es können aber auch Proteine aus Gelstückchen durch
Elektrophorese auf die Anker eines Trägers überführt werden.
Die Sandwichanordnung zweier Träger nach Abb. 3B kann auch für eine PCR-Verviel
fältigung verwendet werden, da sich dadurch die Wärmezuführung zu den Tröpfchen stark
beschleunigen lässt.
Eine Sandwichanordnung von zwei Trägern ohne Tröpfchenkontakt in genügendem Abstand
kann auch für die berührungslose Übertragung der Tröpfchen durch einen einmaligen Schüttel
vorgang verwendet werden. Gerichtetes Beschleunigen und Abbremsen kann die Tröpfchen
durch ihre Trägheit gezielt synchron ablösen und auf die gegenüberstehenden Anker bringen.
Roboter können diese Bewegungen mit großer Präzision ausführen.
Diese Verfahren der einfachen Übertragung der Tröpfchen erlauben den Einsatz unterschied
lich funktionalisierter Träger. Zum Beispiel kann zuerst ein transparenter Träger für optische
Detektionsmethoden eingesetzt werden und danach ein metallischer, elektrisch leitender Träger
für MALDI-MS Analysen.
Die lyophilen Anker der Träger können ebenfalls in vielfältiger Weise durch Präparationen
funktionalisiert werden. So können Analytmoleküle an geeignet mit Akzeptormolekülen präpa
rierten Ankern durch Adsorption, durch Affinität, durch chemische Bindungen, durch Hybridi
sierung (DNA) oder durch Antikörperbindungen vorübergehend oder dauernd immobilisiert
werden. Peptide können beispielsweise aus geeigneten Pufferlösungen pH-gesteuert an C18-
präparierten Ankern adsorbiert und durch Veränderung des pH-Wertes oder durch organische
Lösungsmittel wieder desorbiert werden. Im immobilisierten Zustand können die Analytmole
küle Reaktionen unterworfen, hybridisiert, enzymatisch verlängert oder verkürzt, oder einfach
nur durch Waschen von Reaktantlösungen befreit werden. Es können beispielsweise aber auch
Schichten zur langsamen Abgabe von Reaktantmolekülen oder zum Fangen schädlicher Reak
tionsprodukte oder bestimmter Verschmutzungen aufgebracht werden, beispielsweise können
Ionenaustauscher zum Einfangen von Metallionen dienen.
Die immobilisierten Moleküle können zum Beispiel mit Pufferlösungen, die sie immobil halten,
in ähnlicher Weise gewaschen werden, wie das heute durch den Einsatz von "Magnetic Beads"
bekannt ist. Das Waschen kann in einzelnen Tröpfchen auf den Ankern geschehen, aber auch
gemeinsam in einem Bade oder unter einer Dusche für alle Anker eines Trägers.
Die Anker können aber auch durch besondere Ausgestaltung für besondere Arten von Analy
sen benutzt werden. Die Anker auf Siliziumchips können beispielsweise direkt mit elektroni
schen Schaltungen für Oberflächenanalysenverfahren wie "Surface Plasmon Resonance" oder
"Surface Acoustic Waves" ausgelegt werden. Für optische Methoden können die Anker (even
tuell die ganzen Träger) durchsichtig oder spiegelnd ausgeführt werden. Die Proben können
teils in flüssigem, teils in getrocknetem Zustand in vielfältiger Weise analysiert werden, bei
spielsweise colorimetrisch, absorptionsspektrometrisch (auch im UV oder IR), fluores
zenzspektrometrisch, radiographisch oder massenspektrometrisch. Es können bestimmte Re
aktionen durch Chemolumineszenz oder Thermolumineszenz, oder DNA-Hybridisierungs
schmelzpunktkurven durch Farbumschläge gemessen werden. Besonders im zusammenge
pressten Zustand nach Abb. 3B zwischen zwei durchsichtigen Trägern (oder auch nur mit
durchsichtigen Ankern versehenen Trägern) ist eine gute Durchstrahlung der Tröpfchen mög
lich, zum Beispiel für Absorptionsmessungen.
Gegenüber gefäßgebundener Prozessierung hat das hier vorgestellte Verfahren den einzigarti
gen Vorteil, dass die Wandkontaktfläche über weite Veränderungsbereiche des Volumens der
Flüssigkeit hin immer gleich groß bleibt. Damit wird vermieden, dass es Gefäßwandränder gibt,
die durch Kriechen der Flüssigkeit, durch Trockenfallen oder durch ausdehnungsbedingte
Wandkontaktveränderungen adsorbierte oder auskristallisierte Reste der Reaktionslösung
tragen. Dadurch wird auch die Nachweisempfindlichkeit verschiedener Detektionstechniken
verbessert, da Hintergrundsignale aufgrund unspezifischer Adsorption von Probenmolekülen
außerhalb der für die spezifische Anbindung präparierten Fläche ausgeschlossen werden. Dies
verbessert das Signal-zu-Rauschverhältnis und damit die Nachweisempfindlichkeit.
Durch Trocknen oder Einfrieren können die Proben auch für längere Zeit lagerfähig gemacht
werden. Bei geeigneter Ausführung der Trägerunterfläche als Deckel für die jeweils darunter
liegenden Träger lässt sich - wie bei Mikrotiterplatten - eine hohe Packungsdichte für die
Lagerung erreichen.
Neben den bisher schon aufgeführten Vorteilen hat das erfindungsgemäße Prozessieren aber
auch die Vorteile großer Einfachheit und geringer Kosten. Die Prozessierungen können weit
gehend auf bereits heute erhältlichen Pipettenrobotern ausgeführt werden, wenn nur erst einmal
die erfindungsgemäßen Träger zur Verfügung stehen. Die geringen Prozessierungsvolumen
senken die Kosten für die einzusetzenden Chemikalien.
Zwei Beispiele sollen das Prozessieren im Detail darstellen. Beide Beispiele sind dem Bereich
der Massenspektrometrie entnommen, es ist jedoch dem biochemischen oder molekularbiologi
schen Fachmann ein Leichtes, diese Beispiele auf die von ihm benötigten Prozessierungs- und
Analysenschritte zu übertragen.
Das erste Beispiel betrifft das bereits oben geschilderte Verfahren zur Analyse eines Proteoms.
Zunächst werden die Eiweiße eines Zellverbandes 2D-gelelektrophoretisch getrennt, mit einem
Färbemittel angefärbt, die den nachfolgenden Verdau nicht stört, und in einer automatisch
arbeitenden Vorrichtung aus dem Gel in runden Gelstückchen von 0,5 bis 0,8 Millimeter
Durchmesser ausgestochen. Die feuchten Gelstückchen werden vom Stanzroboter automatisch
auf den lyophilen Ankern einer erfindungsgemäßen Trägerplatte abgelegt, wo sie kleben blei
ben. In einer einfachen, nicht besonders verfeinerten Ausführung befinden sich 1536 lyophile
Anker mit jeweils 0,6 Millimeter Durchmesser in stark lyophober Umgebung auf einem verni
ckelten Aluminiumträger in Größe einer Mikrotiterplatte. In der Mitte der unbelegten Nickel
anker befinden sich jeweils C18-Belegungsflecken mit Durchmessern von etwa 200 Mikrome
tern für das spätere Adsorbieren der Verdaupeptide. Der Ring hydrophilen Nickels um die
hydrophobe C18-Belegung herum gewährleistet den Kontakt der später aufzubringenden
Flüssigkeit mit dem Anker.
Die feuchten Gelstückchen werden jetzt zunächst vorsichtig angetrocknet. Dabei findet eine
Dickenschrumpfung der aufliegenden Gelstückchen statt. Die anschließende Zugabe einer
Trypsinlösung mit entsprechenden Puffern (beispielsweise durch eine simultane Kontaktüber
tragung von einer zuvor mit Vielfachpipette beladenen Trägerplatte) lässt die Gelstückchen
wieder aufquellen, wodurch das Verdauenzym Trypsin zu den Proteinen im Gel gebracht wird.
Ein Überschuss an Flüssigkeit im Gesamtvolumen von 500 Nanolitern lässt die Gelstückchen in
den ein Millimeter dicken Tröpfchen aufschwimmen.
Die Trägerplatten werden dann mit dicht abschließenden Deckeln versehen und für etwa 12
Stunden in einem Wärmeschrank bei 37 Grad Celsius aufbewahrt. Dabei werden die Proteine
durch das Trypsin verdaut, die Verdaupeptide diffundieren aus dem Gel aus und werden
schließlich auf der C18-Insel adsorbiert. Ein Teiltrocknungsvorgang am Ende der Verdauzeit
lässt die Tröpfchen noch einmal kräftig durcheinanderwirbeln, so dass alle freischwimmenden
Peptide an der C18-Insel eingefangen werden. Die Gelstückchen werden jetzt einfach abgewa
schen, die im adsorbierten Zustand gewaschenen Peptide werden getrocknet.
Eine Lösung von α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure in 30% Acetonitril und Wasser desorbiert
die Verdaupeptide und baut sie in die als MALDI-Matrix dienenden Kriställchen der Zimtsäure
ein, die sich während des Trocknens bilden. Die getrocknete Trägerplatte ist nun fertig für die
Aufnahme eines MALDI-Flugzeitmassenspektrums der Verdaupeptide. Aus deren genau be
stimmten Massen lässt sich das Protein in einer Proteinsequenzdatenbank in üblicher Weise
suchen.
Ein Proteom mit etwa 4500 Proteinen lässt sich in etwa vier bis fünf Stunden automatisch aus
stechen und auf den drei erforderlichen Trägern präparieren. Wenn Verdau und Extraktion der
Peptide über Nacht erfolgen, können die Verdaupeptide am nächsten Tag automatisch im
Massenspektrometer gemessen werden, wozu bei heute erhältlicher Technik etwa 12 Stunden
erforderlich sind. Die Identifizierung erfolgt in Echtzeit während der Spektrenaufnahme der
nächsten Probe. Nicht eindeutig bestimmte Proteine können anschließend durch die Aufnahme
von PSD-Tochterionenspektren einzelner Verdaupeptide endgültig bestimmt werden, wozu
etwa weitere 12 Stunden notwendig sein werden. Verluste durch wandadsorbierte Peptide
treten mit der erfindungsgemäßen Technik praktisch nicht auf.
Diese Methode mit erfindungsgemäßer Prozessierung hat folgende Vorteile:
- 1. Die Analyse eines Proteoms kann in etwa zwei bis drei Tagen abgeschlossen werden, wodurch weitgehend vermieden wird, dass sich die empfindlichen Proteine, die sich nur in der natürlichen Umgebung in ihrer Zelle stabil halten, zersetzen und damit nicht mehr analysiert werden können.
- 2. Die Analyse ist außerordentlich einfach, sehr schnell und durch die geringen Volumina mit geringem Verbrauch an Chemikalien auch preiswert.
- 3. Gegenüber bisher üblicher Prozessierung in Gefäßen gibt es eine wesentlich höhere Wiederfindungsrate für die einzelnen Verdaupeptide eines Proteins. Besonders die stark hydrophoben Peptide gingen bei bisheriger Technik häufig durch Wandeinflüsse verlo ren; sie wurden in der massenspektrometrischen Messung gar nicht mehr gefunden. Da die Proteomforschung sich in zunehmender Weise auf die Abweichungen zwischen re alen Proteinen und den Sequenzen der Proteindatenbanken konzentriert, sind diese Verluste an Verdaupeptiden nicht mehr hinzunehmen.
Das zweite Beispiel betrifft die Analyse des Genoms auf bestimmte Mutationen hin, die als so
genannte SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) vorliegen. Im menschlichen Genom gibt es
mindestens 2 Millionen solcher SNPs. Sie charakterisieren Anlagen zu Krankheiten oder lassen
Unverträglichkeiten für Medikamente erkennen. Sie können aber auch erkennungsdienstlich
zur Erkennung von Täter- oder Vaterschaft verwendet werden. Etwa 40 geeignet ausgesuchter
SNPs bestimmen als genetischer Fingerabdruck eindeutig einen Menschen oder ein Tier.
Für die Messung solcher genetischer Fingerabdrücke werden jeweils 1536 lysierte Mundabstri
che als DNA-Proben von einem Pipettierroboter aus Normfläschchen auf jeweils 40 Träger
platten pipettiert. Je eine der vier Millimeter starken Trägerplatten aus dünn vergoldetem
Aluminium mit 1536 unbelegten Goldankern in stark lyophiler Umgebung dient zur simultanen
Messung je einer bestimmten Mutation in den 1536 Proben. Es wird dann auf alle Platten eine
Lösung dispensiert, die die Polymerase für die nachfolgende PCR-Vervielfältigung, die Nuc
leotidtriphosphate und die notwendigen Puffer und Aktivatoren enthält. Dazu kann die oben
beschriebene Technik der indirekten Übertragung mit Kontaktträgern benutzt werden, die
durch Vielfachpipetten beladen wurden. Die mutationsspezifischen Primer werden für jede
Trägerplatte getrennt aufgetragen, beispielsweise durch eine Bubble-Jet-Druckerleiste. Die
Platte wird mit einem Aluminiumdeckel abgedeckt, und mit vier anderen Platten, die unter
gleichen Temperaturbedingungen prozessiert werden können, auf eine Heizplatte gelegt. Ein
zweite Heizplatte kann auf die Deckel platziert werden, um eine gleichmäßige Erwärmung zu
gewährleisten. Diese Sandwichanordnung wird nun den Temperaturzyklen zwischen etwa 50°
und 90° Celsius unterworfen, die für die PCR-Vervielfältigung notwendig sind. Wegen der
guten thermischen Leitfähigkeit und der geringen thermischen Masse braucht ein Zyklus hier
nur etwa anderthalb Minuten, die üblichen 30 Zyklen also eine dreiviertel Stunde. Die DNA-
Proben der 40 Trägerplatten können also in dieser einfachen Anordnung in etwa 8 Stunden
amplifiziert sein.
Statt Heizplatten zu verwenden, können auch etwas dickere Träger- und Deckelplatten mit
eingebauten Heiz- und Kühlsystemen verwendet werden. So kann beispielsweise ein einfaches
Durchflusssytem für Heiz- und Kühlwasser in den Trägern und ihren Deckeln installiert sein.
Auch Temperaturfühler lassen sich integrieren, um eine gute Temperaturregelung zu gewähr
leisten.
Umfasst der Deckelraum etwa zwei Millimeter über einem Träger in der Größe einer Mikroti
terplatte, so nimmt die Luft im Deckelraum bei Erwärmung von 50 auf 90 Grad Celsius etwa 8
Milligramm Wasser auf, die bei Abkühlung wieder an die Tröpfchen zurückgegeben werden.
Befinden sich hier 1536 Tröpfchen zu je einem halben Milligramm, so sind Verdunstung und
Wiederkondensation kaum zu bemerken.
Die Proben auf den Trägerplatten werden nach ihrer PCR-Vervielfältigung auf neue Träger
platten übertragen, die mit Ankern versehen sind, die die DNA-Amplifikate binden können, so
dass sie in ionenfreiem Wasser gewaschen und von allen bisherigen Reaktionslösungsbestand
teilen befreit werden können. Die anschließend getrockneten Proben werden dann mit einem
verdampfbarem Lösungsmittel wieder gelöst (beispielsweise mit einem Wasser-Acetonitril-
Gemisch) und auf den inzwischen gereinigten Träger für die PCR-Vervielfältigung rücküber
tragen. Nach dem Trocknen der DNA-Amplifikate werden nun Primer, Polymerase, terminie
rende und nichtterminierende Nucleotidtriphosphate und Puffer für eine beschränkte, mutati
onsspezifische Primerverlängerung aufgebracht, die nach einigen weiteren Temperaturzyklen
zu DNA-Produkten führt, deren Länge die Mutation wiederspiegelt. Übertragung auf einen
Waschträger, der auch gleichzeitig für die Zugabe der Matrix für die Ionisierung durch matrix
unterstützte Laserdesorption (MALDI) eignet, Waschen und Matrixzugabe schließt die Pro
zessierung ab, die für die 40 Trägerplatten noch einmal etwa 8 Stunden in Anspruch nehmen
wird.
Die Proben können in einem modernen Massenspektrometer mit automatischer Plattenzufüh
rung in einem Messtakt von nur zwei Sekunden vermessen werden, was etwa 48 Stunden
Maschinenzeit ohne Personalzeit in Anspruch nimmt. Somit können 1536 genetische Finge
rabdrücke in nur zwei Personalschichten gemessen werden.
Fachleute erwarten, dass sich dieses Verfahren der beschränkten Primerverlängerung multiple
xieren lässt; es ist bereits eine beispielhafte Zehnfachmultiplexierung veröffentlicht worden.
Werden nur jeweils vier SNPs in einer Prozessierungsprobe gleichzeitig gemessen, so lassen
sich damit über 3000 genetische Fingerabdrücke in einer Personalschicht (8 Personalstunden)
und einem Maschinentag messen.
Ein Vorteil dieser Prozessierung im stehenden Tröpfchen liegt aber neben der Einsparung von
Personaleinsatz auch in der Einsparung von Chemikalien und Enzymen. Die bisher angewand
ten PCR-Reaktionen waren auf Minimalvolumen von 5 Mikrolitern beschränkt. Damit ist eine
Einsatzmenge von Polymerase verbunden, die sich nicht unterschreiten lässt und (wegen der
Lizenzen für PCR-Patente, die über den Preis der Polymerasen eingetrieben werden) den Preis
bestimmt. Mit dem erfindungsgemäßen Prozessieren lässt sich aber das Reaktionsvolumen -
und damit auch der Chemikalienpreis - auf ein Zehntel oder weniger reduzieren.
Jedem Fachmann auf dem Gebiet des Mikroprozessierens wird es mit den Kenntnissen über
diese Erfindung und ihre Anwendung möglich sein, seine speziellen Bedürfnisse an Prozessie
rungen mit den hier angegebenen Grundprinzipien zu verwirklichen, auch wenn die spezielle
Art der Prozessierung hier nicht beschrieben sein sollte.
Claims (11)
1. Verfahren für das Prozessieren von Probenmolekülen in kleinen Mengen von Flüssigkeiten,
dadurch gekennzeichnet, dass das Prozessieren in Tröpfchen stattfindet, die frei auf lyo
philen Ankern einer ansonsten lyophoben Trägeroberfläche stehen oder an ihnen hängen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die lyophilen Anker so präpa
riert sind, dass sie definierte Oberflächeneigenschaften zeigen.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die lyophilen Anker mit Schich
ten präpariert sind, die die Probenmoleküle immobilisieren können.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Immobilisierung reversibel
ist.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die lyophilen Anker mit Schich
ten präpariert sind, die Substanzmoleküle in die Lösung abgeben oder Substanzen aus der
Lösung entfernen.
6. Träger mit lyophilen Ankern in lyophober Umgebung für die Ausführung des Verfahrens
nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die lyophilen Anker mit Schichten
belegt sind, die Probenmoleküle reversibel oder nichtreversibel binden und damit mindes
tens zeitweise immobilisieren können.
7. Träger mit lyophilen Ankern in lyophober Umgebung für die Ausführung des Verfahrens
nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die lyophilen Anker mit Schichten belegt
sind, die Substanzmoleküle in die Lösung abgeben oder aus ihnen entfernen.
8. Träger mit lyophilen Ankern in lyophober Umgebung auf einem Träger für die Ausführung
des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in den Träger elektri
sche, optische, fluidische, akustische oder mikromechanische Elemente für die Prozessie
rung integriert sind.
9. Träger mit lyophilen Ankern in lyophober Umgebung für die Ausführung des Verfahrens
nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die lyophilen Anker als optische
Fenster oder Spiegel ausgebildet sind.
10. Träger mit lyophilen Ankern in lyophober Umgebung für die Ausführung des Verfahrens
nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Träger einen Deckel besitzen und
dass im Deckel Zu- und Abführungsleitungen für Gase und Dämpfe enthalten sind, die die
zugeführten Gase oder Dämpfe in die Nähe eines jeden Tröpfchens bringen.
11. Träger nach Anspruch 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass er die Größe einer Mikroti
terplatte hat.
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