WO2001024933A1 - Strukturiertes reaktionssubstrat und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Abstract

Ein Reaktionssubstrat (20) besteht aus einem Bodenteil (10) und einer flexiblen Kompartimentschicht (21) aus einem Polymermaterial mit vorbestimmten Kompartimentstrukturen (30) zur Bildung von Probenkompartimenten, wobei das Polymermaterial eine viskoelastische Polymerzusammensetzung (z.B. Silikonkautschuk) ist, die in bezug auf Glas-, Kunststoff-, Metall- oder Halbleitersubstrate eine inhärente Haftfähigkeit besitzt. Es wird auch ein Werkzeug zur Herstellung des Reaktionssubstrates beschrieben.

Description

Strukturiertes Reaktionssubstrat und Verfahren zu dessen Herstellung

Die Erfindung betrifft ein Reaktionssubstrat zur Aufnahme und/oder Manipulierung einer Vielzahl voneinander getrennter Proden, das insbesondere ein strukturiertes Reaktionsubstrat für mikroskopisch kleine Probenmengen bildet, ein Verfahren und ein Werkzeug zu dessen Herstellung und auch Verwendungen des Reaktionssubstrates .

In der Biochemie, Medizin und Gentechnik besteht ein breiter Bedarf an Verfahren zur Manipulierung, Beobachtung und/oder Analyse einer Vielzahl von Proben. Es wurden Testverfahren mit hohem Probendurchsatz (sogenanntes high throughput screenmg, HTS) entwickelt, bei denen Tausende von Proben hochparallel bspw. isoliert, kultiviert oder bestimmten Behandlungen unterzogen werden. Diese Verfahren werden m speziell angepassten Reaktionssubstraten oder -behaltern mit vielen Probenkompartimenten durchgeführt, die eine Vielzahl von Anforderungen erfüllen müssen. Die Reaktionssubstrate müssen bspw. eine schnelle und parallele Probenbeschickung, eine Beobachtung der Probe wahrend der Reaktion und eine weitere Verfügbarkeit der Probe nach einer Reaktion sicherstellen und gegenüber der jeweiligen Reaktion inert sein. Mit dem Fortschreiten des biochemischen Kenntnisstandes und Verbesserungen der Methoden aus Biotechnologie und kombinatorischer Chemie geht das Bedürfnis einher, eine möglichst große Anzahl von möglichst kleinen Probenvolumma parallel verarbeiten, das heißt z. B. handhaben, kontrollieren und vermessen zu können. In ^"jüngster Zeit können auf der Grundlage moderner (Fluoreszenz-) Screeningtechniken pro Tag 10³ bis 10⁵ Proben bei benotigten Volumina von bspw. 10^~6 bis 10^~10 1 charakterisiert werden. Zur Erhöhung des Probendurchsatzes, Reduzie- rung des Substanzverbrauchs und auch aus Platzgrunden wird eine Miniaturisierung der Probenkompartimente angestrebt. Damit steigen unmittelbar auch die Anforderungen an Reaktionssubstrate mit Kompartimentierung für einzelne Proben stark an. Dies gilt insbesondere in Bezug auf die Anzahl verfugbarer Kompartimente, das Miniaturisierungspotential, die einfache Handhabung und die Kosten bzw. Wiederverwendbarkeit.

Probentrager oder Reaktionssubstrate mit mikroskopisch kleinen Strukturen für den Einsatz bei Fluoreszenz-, Lumineszenz- oder Szmtillationsmessungen, z. B. zur Losung chemischer oder molekular-biologischer Fragestellungen, sind an sich bekannt. In DE-OS 197 12 484, EP 131 934, US 54 17 923 und US 54 87 872 werden Reaktionssubstrate m Form strukturierter Mikroplatten beschrieben, die ^"jeweils eine Vielzahl flachlich angeordneter, einseitig offener Probenkompartimente bilden. Eine Mikroplatte mit einer Filtermembran ist in EP 408 940 beschrieben. Diese Mikroplatte ist wegen ihres komplizierten Aufbaus sowohl für die Herstellung als auch für die Reinigung nachteilig. Die Anzahl verfugbarer Kompartimente ist beschrankt.

Ein weiteres mikrostrukturiertes Reaktionssubstrat wird m WO 95/01559 beschrieben. Auf der Oberseite des Reaktionssubstrates aus einem Halbleitermateπal oder einem Kunststoff sind durch Atzen Ausnehmungen gebildet, deren Boden hin zur Unterseite zumindest teilweise porös sind. Diese Reaktionssubstrate erlauben zwar Untersuchungen von beiden Seiten her, besitzen "jedoch Nachteile m Bezug auf die Reproduzierbarkeit der Herstellung der einzelnen Ausnehmungen und auf die Handhabbarkeit des Reaktionssubstrates. Wenn eine Abdeckung der Ausnehmungen vorgesehen ist, so muss diese gesondert mechanisch festgeklemmt, geklebt oder gebondet werden.

Aus DE-OS 197 52 085 ist ein vereinfacht herstellbares Reaktionssubstrat für mikroskopische Untersuchungen einer Vielzahl von Proben bekannt, das ein Substrat mit durch Spritzgusstechnik und/oder Heißpragen gebildeten Probenkompartimenten aufweist. Ein Nachteil dieses Reaktionssubstrates ist, dass die mikroskopischen Untersuchungen nur von einer Seite des Substrats, auf der die Probenkompartimente offen sind, durchgeführt werden können. Außerdem ist dieses Reaktionssubstrat nicht allgemein für HTS-Verfahren einsetzbar.

Aus WO 99/19717 ist der Aufbau eines Mikrosystems bekannt, bei dem mindestens ein flexibler, mikrostrukturierter Film als Laminat zwischen festen Tragern angeordnet ist. Der Film besitzt an- wendungsabhangig gebildete MikroStrukturen, in die gegebenenfalls Elektroden integriert sind und die in Zusammenwirkung mit den Tragern Kompartimente für fluidische Proben bilden. Diese Stapeltechnik ist wiederum nachteilig, da gesonderte Maßnahmen zum Verbinden der Trager mit dem Film getroffen werden müssen, die die Handhabung der Proben oder die Proben selbst beeinflussen.

Ein ahnlicher Aufbau ist in EP 324 153 beschrieben. Dabei wird insbesondere ein mit bestimmten MikroStrukturen versehenes Photopolymer schichtformig auf einen festen Trager auflaminiert . Der Nachteil dieser Technik besteht darin, dass die Polymerschicht nicht ohne Beschädigung vom Trager entfernt werden kann. Es besteht aber Interesse an Reaktionssubstraten bzw. Probentra- gern, die zur Wiederverwendung oder für weitere Verfahrensschritte zur Probenbearbeitung bspw. ohne Beschädigung aus einem Substratverbund losbar sind.

Ein Verfahren zur Herstellung von MikroStrukturen auf einer Metalloberflache ist in WO 97/29223 beschrieben. Die Metalloberflache wird durch eine photolithographisch strukturierte Polymerschicht hindurch bearbeitet. Mit dieser Technik wird das Problem der Abdeckung von MikroStrukturen jedoch auch nicht gelost. Weitere Struktuπerungstechniken f r Materialien aus Me- tall oder Halbleitern sind in EP 869 556, WO 97/13633 und WO 98/09745 beschrieben.

Ein genereller Nachteil der herkömmlichen Reaktionssubstrate f r den Einsatz m der Mikroskopie betrifft deren relativ dicke, unregelmäßige und/oder durchhangende Boden. Die Boden der herkömmlichen Reaktionssubstrate können aus verschiedenen Materialien, z. B. Glas, bestehen. Typische Glasstarken betragen rund 500 μm. Es können aber auch ausgeprägte, unreproduzierbare Variationen des Bodens (z. B. über 400 μm) auftreten. Die fokale Lange von Immersionsob ektiven ist jedoch typischerweise auf 250 bis 300 μm begrenzt. Bei Abzug der Glasstarke, z. B. eines Deckglases, von rund 150 μm verbleibt noch eine zulassige Varianz des Bodens von rund 100 bis 150 μm, um reproduzierbare, kontinuierliche Messungen an dem Reaktionssubstrat ohne standige Nachjustierungen der Position des Objektivs in einer Richtung senkrecht zur Ebene des Reaktionssubstrates (nachfolgend als z-Richtung bezeichnet) durchfuhren zu können.

In den meisten der obengenannten Anforderungen, aber auch hinsichtlich der Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit, können die bisher verfugbaren Reaktionssubstrate oder -behalter oder Pro- bentrager mit der Entwicklung der Screemngtechnik nicht standhalten.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Reaktionssubstrat bereitzustellen, mit dem die Nachteile der herkömmlichen Reaktionssubstrate vermieden werden und das insbesondere einen einfachen Aufbau besitzt, unter den interessierenden Reaktionsbedingungen inert ist sowie leicht mit beliebigen Strukturen herstellbar und einfach handhabbar ist. Das neue Reaktionssubstrat soll insbesondere auch mehrfach wiederverwendbar bzw. re- cyclebar sein. Die Aufgabe der Erfindung ist es insbesondere, ein verbessertes Reaktionssubstrat bereitzustellen, bei dessen Verwendung die Probenhandhabung und -Untersuchung, z. B. mit ei- nem Mikroskop, insbesondere mit einem konfokalen Mikroskop, vereinfacht werden. Die Aufgabe der Erfindung ist es ferner, ein Verfahren zur Herstellung des Reaktionssubstrates und ein Werkzeug zu dessen Durchfuhrung bereitzustellen.

Diese Aufgaben werden insbesondere durch ein Reaktionssubstrat mit den Merkmalen gemäß Patentanspruch 1 gelost. Vorteilhafte Ausfuhrungsformen und Verwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhangigen Ansprüchen.

Erfindungsgemaß wird ein strukturiertes Reaktionssubstrat bereitgestellt, das durch eine Zusammensetzung eines unten charakterisierten Probentragers (Kompartimentschicht) mit einem festen Bodenteil gebildet wird, auf der der Probentrager selbständig haftet. Das Bodenteil besteht vorzugsweise aus Glas, Kunststoff, Metall oder einem Halbleitermaterial. Es bildet eine im Wesentlichen ebene, glatte Oberflache, an der der Probentrager adha- riert ist.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemaßen Reaktionssubstrates besteht darin, dass die Kompartimentschicht im Wesentlichen be- schadigungsfrei vom Bodenteil abtrennbar ist. Dies bedeutet, dass die Kompartimentschicht von der Bodenplatte (z. B. einem Deckglas) derart entfernt werden kann, dass sie in der Folge ohne wesentliche Einbußen an Form, Haftfähigkeit und/oder Flexibilität wieder eingesetzt werden kann. Zur erneuten Verwendung wird die Kompartimentschicht mit einer neuen oder gereinigten Bodenplatte durch leichten, z. B. manuellen, Druck zu einem neuen Reaktionssubstrat verbunden, dessen Dichtigkeit vollständig der Dichtigkeit des vorher mit der Kompartimentschicht gebildeten Reaktionssubstrates entspricht. Eine im Wesentlichen bescha- digungsfreie Ablösung der Kompartimentschicht bedeutet, dass die Funktionalität der Kompartimentschicht durch die Ablösung für spatere Anwendungen unverändert erhalten bleibt. Die Abhebung der Kompartimentschicht von dem Bodenteil kann vorzugsweise durch Abheben der Kompartimentschicht an einer Ecke vom Bodenteil erfolgen, wahrend dieses an seinen vier Ecken festgehalten wird. An der abgehobenen Ecke wird die Kompartimentschicht hochgebogen und über dem Bodenteil abgerollt, wobei die Kompartimentschicht im Wesentlichen ruckstandsfrei von der Bodenplatte getrennt wird. Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass dieses Abheben und damit die Wiederverwendung beliebig oft möglich sind. Experimentell konnte eine 50- fache Wiederverwendung ohne Funktionseinbuße bestätigt werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist das Reaktionssubstrat für mikroskopische Untersuchungen ausgelegt. Das Bodenteil besteht aus einem transparenten Material (z. B. Glas) mit anwendungsabhangig gewählter Dicke. Es wird die Aufbringung des Probentragers auf einem an sich bekannten Deckglas für die Mikroskopie bevorzugt.

Die Dicke des Deckglases betragt bevorzugt wenige hundert Mikrometer (μm) , besonders bevorzugt rund 150 μm. Bei dem verwendete- ten Mikroskop handelt es sich vorzugsweise um ein konfokales Mikroskop. Das konfokale Mikroskop wird bevorzugt m Verbindung mit Detektionstechnologien, die auf der Detektion von Fluoreszenz basieren, kombiniert. Besonders gut geeignet sind die er- fmdungsgemaßen Reaktionssubstrate für die Fluoreszenz- Korrelations-Spektros opie, Fluoreszenz-Komzidenzanalysen, Fluoreszenzverteilungsanalysen, Fluoreszenzlebensdauermessungen, Fuoreszenz-Energie-Transfer-Analysen oder Fluoreszenz- Polarisationsmessungen unter Verwendung von konfokalen Mikroskopen. Die erfmdungsgemaßen Reaktionssubstrate eignen sich somit sehr gut zur Emzelmolekul-Detektion.

Gemäß einem wichtigen Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Probentrager m Form einer flexiblen Kompartimentschicht mit Ausnehmungen zur Bildung einer vorbestimmten Kompartimentstruktur bereitgestellt, bei dem die Kompartimentschicht aus einer visko- elastischen Polymerzusammensetzung besteht, die selbständig auf Glas-, Kunststoff-, Metall- oder Halbleitersubstraten haftfähig ist. Die Kompartimentschicht ist eine mit Hilfe eines einfachen Abdruckverfahrens herstellbare formstabile Matte, deren Material schon bei einem leichten manuellen Anpressdruck von wenigen Gramm pro cm² eine Adhäsionsverbindung, z. B. durch elektrostatische Kräfte und/oder van-der-Waals-Kräfte, mit einem der genannten Substrate eingeht. Die Kompartimentschicht umfasst vorzugsweise im Wesentlichen lösungsmittelfreie Natur- oder Synthese- Kautschuke oder Zusammensetzungen aus diesen. Besonders bevorzugt wird die Polymerzusammensetzung der Kompartimentschicht aus Klebstoff und lösungsmittelfreien Natur- und Synthesekautschuken gebildet. Die Kompartimentsschicht ist vorzugsweise frei von Zusatzstoffen wie Harzen, Weichmachern und/oder Antioxidantien. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Kompartimentschicht des erfindungsgemäßen Reaktionssubstrates Silikonkautschuk.

Die Ausnehmungen zur Bildung der Kompartimentstrukturen sind durch die Kompartimentschicht durchgehende Löcher oder einseitig in die Kompartimentschicht eingearbeitete Vertiefungen. Es werden geschlossene Kompartimentstrukturen in Form von Probenreservoiren oder Vorratstopfen und/oder offene Kompartimentstrukturen in Form von in der Schichtebene des Probenträgers verlaufenden Kanälen gebildet. Die Probenreservoire, Vorratstöpfe und Kanäle werden im Folgenden auch als Probenkompartimente bezeichnet.

Die Kompartimentstrukturen bilden eine Vielzahl von matrixartig in geraden Reihen und Spalten angeordneten Ausnehmungen (Probenreservoire) , wobei das Rastermaß der Matrixanordnung vorzugsweise der Anordnung von Probenreservoiren (sogenannte Wells) von Mikro- und Nanotiterplatten entspricht. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform des erfmdungs- gemaßen Reaktionssubstrates ist die Kompartimentschicht mit Ma- nipulations- und Untersuchungseinrichtungen ausgestattet. Zu diesen zahlen insbesondere Fluidleitungen zur Beschickung der durch die Kompartimentstrukturen gebildeten Probenkompartimente bzw. zur Substanzableitung aus diesen, Sensoreinrichtungen zur Erfassung vorbestimmmter Probeneigenschaften m den Probenkom- partimenten, Piezopumpen zur Forderung von Fluidstromen und/oder Elektrodeneinrichtungen, die zur Beaufschlagung der Proben in den Probenkompartimenten mit elektrischen Feldern ausgelegt sind. Eine Fluidleitung wird bspw. durch eine in der Schichtebene der Kompartimentschicht verlaufende Kapillare gebildet, die sich vom Rand des Reaktionssubstrates m diesen hinein zu einem bestimmten Probenkompartiment erstreckt. Sensoreinrichtungen umfassen bspw. Temperatur-, pH- oder Leitfahigkeitssensoren. Die Elektrodeneinrichtungen werden vorzugsweise durch Elektrodenstreifen gebildet, die sich an den Wanden der Probenkompartimente erstrecken.

Die Kompartimentstrukturen einem erf dungsgemaßen Reaktionssubstrat bzw. Probentrager bilden gemäß bevorzugter Ausfuhrungsformen MikroStrukturen mit charakteristischen Dimensionen im Bereich von 500 nm bis 1,5 mm.

Der Stapelaufbau aus Bodenteil und Probentrager kann erfmdungs- gemaß dahingehend modifiziert sein, dass auf dem Probentrager auf der zum Bodenteil entgegengesetzten Seite eine Abdeckung angebracht wird, die wiederum durch selbständiges Anhaften relativ zum Probentrager fixiert ist. Die Abdeckung kann aus einem starren Material wie das Bodenteil oder durch eine flexible Folie gebildet sein. Die Abdeckung kann ferner vorbestimmte Offnungen zum Zugriff auf die Kompartimentstrukturen aufweisen. Der Stapelaufbau m Sandwich-Form verleiht dem Reaktionssubstrat zusätzliche Stabilität. Die Abdeckung dient zum Unterbinden der Verdunstung von eingebrachten Flüssigkeiten. Anwendungsabhangig kann vorgesehen sein, dass die Kompartimentschicht aus mehreren getrennten Teilen gebildet wird, die auf einem gemeinsamen Bodenteil zur Bildung eines erfindungsgemaßen Reaktionssubstrates angeordnet werden. Es können auch mehrere Kompartimentschichten aneinander haftend als Stapel verbunden sein, um ein dreidimensionales fluidisches Mikrosystem aufzubauen.

Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des oben beschriebenen Probentragers bereitgestellt. Hierzu wird ein Abdruckwerkzeug mit dem jeweils gewünschten Polymermaterial der Kompartimentschicht im gelosten Zustand gefüllt und anschließend das Losungsmittel durch Tempern und/oder Trocknen, vorzugsweise bei Raumtemperatur, aus der Füllung entzogen bzw. eine Vernetzung der Polymerzusammensetzung herbeigeführt. Das Abdruckwerkzeug besteht insbesondere aus einer strukturierten Grundplatte und einer Gegenplatte, die flus- sigkeitsdicht zusammengehalten werden. Die Grundplatte tragt vorspringende Strukturen entsprechend den gewünschten Kompartimentstrukturen im Probentrager. Diese vorspringenden Strukturen ragen von der Grundplatte je nach Anwendungsfall bis zur oder in die Gegenplatte (Ausbildung durchgehender Locher) oder bis zu einer Hohe mit Abstand von der Gegenplatte (Ausbildung von Vertiefungen) . Zur reproduzierbaren Herstellung von Strukturen in Form durchgehender Locher ist die Gegenplatte vorzugsweise mit einer zur Grundplatte weisenden Beschichtung, z. B. aus PTFE, versehen. Die einzelnen Komponenten der Abdruckvorrichtung sind über losbare Steck- oder Schraubverbindungen zusammengefugt. Nach dem Losungsmittelentzug bzw. der Vernetzung der Polymerzusammensetzung werden diese Verbindungen gelost und die getrocknete feste, formstabile Kompartimentschicht als Probentrager dem Abdruckwerkzeug entnommen. Gegenstand der Erfindung ist auch der Aufbau des Abdruckwerkzeugs an sich. Der Probentrager bzw. das Reaktionssubstrat gemäß der Erfindung sind zur Manipulierung und/oder Untersuchung beliebiger flussiger Proben mit charakteristischen Probenvolumina z. B. im Bereich von 1 nl bis 10 μl ausgelegt. Die flussigen Proben können insbesondere Losungen vorbestimmter Reaktionspartner und/oder Suspensionen umfassen, die m einer Suspensionsflussigkeit synthetische oder biologische Objekte enthalten. Zu den m einem Reaktionssubstrat manipulierten Objekten zahlen insbesondere Feststoffpartikel (sogenannte Beads) als synthetische Objekte und biologische Zellen oder Zellbestandteile, Mikroorganismen, Viren und biologisch relevante Makromoleküle als biologische Objekte .

Die Erfindung besitzt die folgenden Vorteile. Die erfmdungsgemaßen Reaktionssubstrate oder Probentrager können mit einfachen Mitteln mit einem im Wesentlichen drucklos arbeitenden Werkzeug in Massenproduktion hergestellt werden. Über die Gestaltung der Maske oder Abdruckform des Werkzeugs ist ein beliebiges Formatdesign der Probenkompartimente von Makro- bis zu Nanogroßen einfach möglich. Zur Herstellung von Masken f r mikroskopisch kleine Kompartimentstrukturen stehen an sich bekannte Bearbeitungstechniken für Glas oder Halbleiter, wie z. B. das LIGA-Verfahren oder konventionelles Atzen, zur Verfugung. Die Kompartimentstrukturen lassen sich hochprazise über die gesamte Dicke der Kompartimentschicht herstellen. Die Strukturen können in der Schichtebene charakteristische Dimensionen im Sub-Mikrometer- Bereich und senkrecht dazu im mm-Bereich besitzen.

Die Kompartimentstrukturen können mit beliebigen Formaten, z. B. rund, quadratisch, rechteckig oder mit komplizierteren geometrischen Formen, ausgebildet werden. Die Herstellung der Kompartimentschicht aus einem viskoelastischen Polymer besitzt mehrere Vorteile. Einerseits wird die Anbringung des Probentragers auf einem Bodenteil durch einfaches Andrucken erheblich gegenüber herkömmlichen Sandwich-Konstruktionen mit mechanischen Klemm- Mitteln oder Laminatverbindungen vereinfacht. Andererseits zeichnet sich das Material der Kompartimentschicht, insbesondere bei Verwendung von Silikonkautschuk, durch exzellente Eigenschaften n der Form aus, dass unspezifische Adsorptionen ausbleiben. Dies ist vor allem bei miniaturisierten Proben von Bedeutung. Der Probentrager ist unter den interessierenden Reaktionsbedingungen bei Anwendungen in der Medizin, Biochemie und molekularen Biotechnologie inert. Das biologisch inerte Material ermöglicht das Anziehen, Kultivieren und Messen biologischer Proben oder Substrate in den Reaktionssubstraten oder Probentra- gern. Schließlich erlaubt das Material des Probentragers auch nach dem eigentlichen Einsatz eine Reinigung m einem Bad oder einer Spülmaschine mit herkömmlichen Remigungs- oder Losungsmitteln, ohne dass die Form oder Stabilität des Probentragers nachteilig bee flusst werden. Der Probentrager ist im Wesentlichen ohne Formverlust und ohne Beeinflussung seiner Hafteigenschaften autoklavier- und sterilisierbar. Durch einfaches Abziehen vom Bodenteil sind die Probentrager wiederverwendbar.

Das erfmdungsgemaße Reaktionssubstrat aus Bodenteil mit aufgesetztem Probentrager besitzt besondere Vorteile in Bezug auf den Aufbau des Reaktionssubstrats, die Abdichtung der Probenkompartimente und die gegenseitige Ausrichtung der Probenkompartimente. Der Probentrager wird durch gleichmaßiges Andrucken mit einem definierten, z. B. manuell ausgeübten Druck, mit dem Bodenteil verbunden. Der Probentrager ist ohne Rahmen verwendbar und erlaubt dennoch, bei Aufbringung von Justiermarkierungen, eine exakte räumliche Orientierung und Positionierung, bspw. in Bezug auf ein Mikroskop oder eine Probenbeschickungseinrichtung. Die Abdichtung der Probenkompartimente, die durch durchgehende Ausnehmungen in der Kompartimentschicht gebildet werden, gegenüber dem Bodenteil erfolgt ohne zusatzliche Dicht- oder Klebemittel. Eine Beeinflussung der biochemischen Reaktionen in den Komparti- menten durch derartige Mittel wird ausgeschlossen. Die Adhasionsverb dung zwischen dem Probentrager und dem Bodenteil und der Abdeckung ermöglicht die Planaπtat auch von großflächigeren Reaktionssubstraten oder Probentragern mit charakteristischen Dimensionen bis zu 118 mm • 82 mm. Über die gesamte Flache des Bodenteils hinweg können Variationen der Probenkammerpositionen m z-Richtung (senkrecht zur Probentragerebene) vorzugsweise auf Werte kleiner als 250 μm, besonders bevorzugt kleiner als 150μm, insbesondere kleiner als 100 μm gehalten werden. Dies ist von besonderem Vorteil für mikroskopische Untersuchungen. Wahrend der Vermessung eines Reaktionssubstrats ist es nicht erforderlich, die z-Position des Mikroskopobjektivs laufend nachzujustieren. Die erfmdungsgemaßen Reaktionssubstrate eignen sich somit sehr gut zum Einsatz m Testverfahren mit hohem Probendurchsatz (sogenanntes high throughput screenmg, HTS) der biotechnischen und/oder chemischen Forschung- und Entwicklung, da die zeitaufwendige Nachjustierung, z. B. von Mikroskopobjektiven, in z-Richtung, entfallt.

Die Stabilität des Reaktionssubstrats ist so hoch wie bei herkömmlichen Probenkammerstrukturen, wobei jedoch erfin- dungsgemaß auf zusätzliche Kleb- oder Kiemmittel verzichtet werden kann. Die Stabilität wird bei Aufbringung der Abdeckung noch wesentlich erhöht.

Das Reaktionssubstrat besitzt einen breiten Anwendungsbereich, da je nach den Anforderungen ein passendes Bodenteil als Unterlage für den Probentrager verwendet werden kann. Das Bodenteil ist in Bezug auf Material und Dicke frei variierbar. Als transparentes Bodenteil dient vorzugsweise Glas beliebiger Starke, z. B. mit Deckglasstarke, für den Einsatz m der Mikroskopie. Das Bodenteil kann aus UV-durchlassigem Quarzglas bestehen. Es besitzt hervorragende optische Eigenschaften und wird durch den Probentrager weder chemisch modifiziert noch physikalisch belastet. Das erfmdungsgemaße Abdruckwerkzeug besitzt den Vorteil eines einfachen, modularen Aufbaus. Das Werkzeug kann durch Wechsel der Maske oder Abdruckform einfach an die jeweils gewünschten Anforderungen angepasst werden. Es ist gleichermaßen für Anwendungen im Laborbereich oder der Massenproduktion geeignet. Mit dem erfmdungsgemaßen Verfahren können beliebige Strukturen ohne besonderen Aufwand hergestellt werden. Dies ist ein besonderer Vorteil gegenüber den herkömmlichen Techniken zur Strukturierung von Glas oder Halbleitern.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden aus der Beschreibung der beigefugten Zeichnungen ersichtlich. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Perspektivansicht eines Reaktionssubstrates mit einem Probentrager gemäß der Erfindung,

Fig. 2 eine Draufsicht auf eine erste Ausfuhrungsform einer erfmdungsgemaßen Kompartimentschicht,

Fig. 3, 4 und 5 Illustrationen eines erfmdungsgemaßen Abdruckwerkzeugs im zusammengesetzten bzw. auseinandergenommenen Zustand,

Fig. 6 eine Draufsicht auf ein erfindungsgemaßes Reaktionssubstrat in Form eines Mikroprobentra- gers und auf eine herkömmliche Halbleiterstruktur,

Fig. 7 eine vergrößerte Ausschnittsansicht eines Mik- roprobentragers gemäß Fig. 6, Fig. 8 eine Illustration von Einzelheiten der Kompartimentstrukturen bei einem Reaktionssubstrat gemäß den Figuren 6 und 7,

Fig. 9 eine Draufsicht auf weitere Ausfuhrungsformen eines erfindungsgemaßen Reaktionssubstrates mit Mikrokanalen,

Fig. 10 ein erfmdungsgemaßes Reaktionssubstrat m

Form einer schichtformigen Fluoreszenzkuvette,

Fig. 11 experimentelle Ergebnisse zur Illustration der hervorragenden Planaritat erfindungsgemaßer Reaktionssubstrate, und

Fig. 12 experimentelle Ergebnisse zur Illustration der

Dichtheit von Kompartimenten erfindungsgemaßer Reaktionssubstrate .

Die Erfindung wird im Folgenden unter Bezug auf ein Reaktionssubstrat mit einem mikrostrukturierten Probentrager zur Handhabung biologischer Proben beschrieben. Die Erfindung ist _jedoch nicht auf Anwendungen beschrankt, bei denen mikroskopisch kleine Probenmengen MikroStrukturen manipuliert werden. Des Weiteren ist die Erfindung nicht auf die illustrierten Formen von Probenkompartimenten beschrankt. Anwendungsab- hangig können auch beliebige andere Formen mit geraden oder gekrümmten Wanden der Probenkompartimente realisiert werden.

Figur 1 illustriert in schematischer Perspektivansicht ein Reaktionssubstrat mit einem Probentrager gemäß der Erfindung. Auf dem Probentrager sind verschiedene Kompartimentstrukturen und Zusatzeinrichtungen gezeigt, die anwendungsabhangig einzeln oder simultan vorgesehen sein können. Das Reaktionssubstrat 100 umfasst das Bodenteil 10 und den Probentrager 20. Das Bodenteil 10 ist bspw. eine ebene Glasplatte mit einer Dicke entsprechend der Starke von Deckglasern zum Einsatz m der Mikroskopie (rund 150 μm) und einer Flache von rund 120 mm • 70 mm. Das Bodenteil 10 kann auch durch einen beliebigen anderen Korper mit einer im Wesentlichen glatten, ebenen oder gekrümmten Oberflache gebildet werden. Vorzugsweise besitzt das Bodenteil eine im Wesentlichen glatte, ebene Oberflache.

Der Probentrager 20 umfasst eine Kompartimentschicht 21 (Matte) mit Kompartimentstrukturen 30. Die Kompartimentschicht 21 besteht vorzugsweise aus Silikonkautschuk und besitzt eine Dicke von rund 0,5 mm bis 4 mm. An einer oder mehreren Seiten der Matte können eine Lasche 22 zum Abziehen des Probentragers 20 vom Bodenteil 10 und/oder Justiermarkierungen 23 zum Positionieren des Probentragers 20 relativ zu einer Messoder Probenbeschickungseinrichtung vorgesehen sein. Die Justiermarkierungen 23 sind bspw. punkt- oder kreuzförmige Ausnehmungen in der Oberflache des Probentragers 20, die gegebenenfalls mit einer zusätzlichen Markierungssubstanz (z. B. Fluoreszenzfarbstoff) versehen sind. Die Justiermarkierungen besitzen charakteristische Dimensionen, die erheblich geringer als die Dimensionen der Kompartimentstrukturen 30 sein können.

Der Silikonkautschuk ist bspw. Polydimethylsiloxsan (PDMS, Hersteller Wacker-Chemie GmbH, Bezeichnung M 4600) . Allgemein können elastische Kunststoffe (Elastomere) verwendet werden, die bei verschiedenen Temperaturen elastisch bleiben. In den Elastomeren sind die Molekulketten (Kohlenstoffketten) locker vernetzt, so dass die Elastomere gummielastisch sind. Das bevorzugt verwendete Silikon ist ein Kunststoff aus der Gruppe der Elastomere und besteht hauptsachlich aus Silizium und Sauerstoff. Im unvernetzten Zustand sind die Silikone olar- tig, wasserklar und warmefest. Im vernetzten Zustand bilden die Silikone einen Silikonkautschuk. Die Kompartimentstrukturen 30 umfassen im Einzelnen geschlossene Probenreservoire 31 in Form durchgehender Locher 31a oder in der Oberflache des Probentragers abgesenkter Vertiefungen 31b (Durchmesser z. B. rd. 200 μm bis 1,5 mm) oder in der Schichtebene des Probentragers verlaufende gerade, gekrümmte oder sich verzweigende Kanäle 32. Das Bezugszeichen 33 verweist auf sogenannte Vorratstopfe, die wie die Probenreservoire 31 zur Probenaufnahme und -abgäbe, allerdings mit größeren Volumina, ausgelegt sind.

Die Manipulations- und Untersuchungseinrichtungen 40 umfassen bspw. eine Fluidleitung in Form mindestens einer Kapillare 41, mindestens einer Elektrode 42 und/oder mindestens eines Sensors 43, die in der Schichtebene des Probentragers 20, an den Wanden der Kompartimentstrukturen 30 oder in den Kompartimentstrukturen 30 angeordnet sind. Die Kapillare 41 kann bspw. mit einem Proben- oder Reagenzienzufuhrsystem (nicht dargestellt) verbunden sein. Sie wird wahrend der Herstellung des Probentragers 20 (siehe unten) m diesen eingebettet oder nachtraglich in den Probentrager 20 eingestochen. Die Elektroden sind so aufgebaut, wie es an sich aus der Mikrosystem- technik von Mikroelektroden für elektroosmotische Pumpvorgange, Manipulationen an Partikeln unter Ausnutzung negativer Dielektrophorese oder Partikelbearbeitungen, wie z. B. Elektroporation an biologischen Zellen, bekannt ist. Die Elektroden bzw. ihre Zuleitungen werden vorzugsweise wahrend der Herstellung des Probentragers 20 in diesen eingebettet bzw. auf dessen inneren Oberflachen (Wände der Kompartimente) angeordnet .

Figur 1 zeigt ferner eine Abdeckung 50. Die Abdeckung 50 ist kein zwingendes Merkmal des erfmdungsgemaßen Reaktionssubstrats. Sie ist anwendungsabhangig vorgesehen und besteht wie das Bodenteil 10 aus einer festen Platte (z. B. aus Glas) oder aus einer flexiblen Abdeckfolie. Es kann vorgesehen sein, dass die Abdeckung 50 Offnungen 51 entsprechend den Positionen der Kompartimentstrukturen 30 aufweist. Die Offnun- gen 51 dienen der Beschickung von Probenreservoiren 31 oder Vorratstopfen 33 oder dem Probeneintrag m die Kanäle 32. Sie können mit einer zusatzlichen (nicht dargestellten) Folie als Verdunstungsschutz verschlossen sein.

Eine für praktische Anwendungen in der Biochemie interessierende Ausfuhrungsform einer Kompartimentschicht 21 ist in Figur 2 dargestellt. Die Kompartimentschicht 21 ist eine flexible Matte aus Silikonkautschuk (z. B. Elastosil M 4600 A+B, Hersteller Wacker-Chemie GmbH, Deutschland) . Sie besitzt eine Flache von 118 mm • 82 mm und eine Dicke von 4 mm. Die Pro- benreservoire 31 (teilweise dargestellt) sind matrixartig in geraden Reihen und Spalten im Format 48 • 32 angeordnet und besitzen jeweils einen Mittelpunktabstand von 2,25 mm. Dies entspricht dem Standardformat für Mikrotiterplatten mit 1536 Wells. Der Durchmesser jedes Probenreservoirs 31 betragt 1,5 mm. Das Bezugszeichen 23 verweist auf eine Justiermarkierung, die bei dieser Ausfuhrungsform ebenfalls durch eine Ausnehmung wie die Probenreservoire gebildet wird und eine Referenzprobe aufnehmen kann.

Der m Figur 2 illustrierte Probentrager 20 oder die Kompartimentschicht 21 wird mit einem Bodenteil (nicht dargestellt) verbunden, das vorzugsweise die gleichen Flachenmaße wie die Kompartimentschicht 21 besitzt. Das Bodenteil ist vorzugsweise ein Deckglas mit einer Dicke von rund 150 μm.

Im Folgenden wird unter Bezug auf die Figuren 3 bis 5 die Herstellung eines erfmdungsgemaßen Reaktionssubstrates oder Probentragers durch Gießen der Kompartimentschicht m einem Abdruckwerkzeug erläutert. Die Figuren zeigen das Abdruckwerkzeug m perspektivischer Phantomansicht bzw. auseinandergezogen Perspektiv- bzw. Seitenansicht. Das Abdruckwerkzeug 200 besteht grundsatzlich aus einem geschlossenen Behältnis mit einem inneren Hohlraum entsprechend der äußeren Form der gewünschten Kompartimentschicht bzw. mit inneren Oberflachen, die Vorsprunge entsprechend den gewünschten Kompartimentstrukturen aufweisen. Für einen möglichst universellen Einsatz ist das Behältnis modu- lar aus einer Grundplatte 60, einer Zwischenplatte 70 und einer Gegenplatte 80 aufgebaut, die flussigkeitsdicht miteinander verbunden werden können. Vorzugsweise sind die Grund-, Zwischen-, und Gegenplatten losbar miteinander verbunden.

Die Grundplatte 60 tragt auf ihrer zum Inneren des Abdruckwerkzeugs 200 weisenden Seite Vorsprunge zur Strukturbildung in der Kompartimentschicht. Abgesehen von den Vorsprungen ist die Oberflache dieser inneren Seite gleichförmig und glatt ausgebildet. Beim dargestellten Beispiel umfassen die Vorsprunge matrixartig angeordnete Stifte 61 (teilweise dargestellt) mit einem Durchmesser entsprechend dem gewünschten Durchmesser der Probenreservoire 31 (siehe Fig. 2). Die Stifte 61 sind in entsprechende Ausnehmungen auf der Innenseite der Grundplatte 60 eingesteckt. Die Grundplatte und die Stifte bestehen vorzugsweise aus Metall (z. B. Edelstahl oder Aluminium) . Für die Vorsprunge zur Strukturbildung können aber auch andere Materialien wie z. B. Silizium oder Glas verwendet werden. Diese Materialien lassen sich mit an sich bekannten, speziellen Ausformungstechniken (z. B. LIGA- Verfahren oder Atzen) hochprazise bis in den Sub-Mikrometer- Bereich bearbeiten, wobei die entstehenden Vorsprunge Hohen von bis zu 1 mm aufweisen können. Zur Halterung der Vorsprunge (Metallstifte oder andere Strukturen) kann die Grundplatte 60 einen gesonderten Maskeneinsatz aufweisen. Figur 4 zeigt auch den Metallstift 61a, der zur Bildung der Justiermarkierung 23 (siehe Fig. 2) vorgesehen ist. Die Zwischenplatte 70 ist ein Abstandhalter, der die Dicke der Kompartimentschicht (Silikonmatte) bestimmt und dessen Innenmaße, die Außenmaße der Kompartimentschicht festlegen. Die Zwischenplatte 70 ist mit einer Einfulloffnung 71, die mit dem Einfullstutzen 90 (siehe unten) zusammenwirkt, und Austrittsoffnungen 72 ausgestattet. Die Austrittsoffnungen 72 dienen dem Austritt von verdrängter Luft bzw. überschüssigem Schichtmaterial aus dem Abdruckwerkzeug 200. Die Zwischenplatte 70 ist kein zwingendes Merkmal eines erfmdungsgemaßen Abdruckwerkzeugs. Die Funktion des Abstandhalters kann alternativ auch durch entsprechende Strukturen (umlaufende Stufen) an der Grundplatte und/oder der Gegenplatte erfüllt werden.

Die Gegenplatte 80 stellt den Abschluss des Abdruckwerkzeugs 200 gegenüber zur Grundplatte 60 dar. Sie ist ebenfalls eine Metallplatte. Zur Innenseite des Abdruckwerkzeugs 200 hinweisend ist m der Gegenplatte 80 ein Rahmen 81 mit einem Kunststoffemsatz 82 angeordnet. Der Kunststoffeinsatz 82 ist eine Schicht aus elastisch verformbarem Kunststoff mit einer Dicke von rund 10 mm. Er besteht vorzugsweise aus PTFE. Der Kunststoffeinsatz 82 besitzt Ausnehmungen 83, die zu den Vorsprun- gen auf der Grundplatte 60 komplementär sind. Im dargestellten Beispiel sind im Kunststoffeinsatz 82 1536 Bohrungen (teilweise dargestellt) zum Aufnehmen der Metallstifte 61 im zusammengesetzten Zustand des Abdruckwerkzeugs 200 vorgesehen. Die Einbringung der komplementären Ausnehmungen ist nicht zwingend erforderlich. Wenn die Vorsprunge auf der Grundplatte 60 genügend stabil oder der Kunststoffeinsatz 82 genügend leicht deformierbar ist, damit im zusammengesetzten Zustand des Abdruckwerkzeugs 200 die Vorsprunge nicht beschädigt werden, so kann auf gesonderte Ausnehmungen im Kunst- stoffemsatz 82 verzichtet werden. Das Bezugszeichen 20 verweist auf den fertigen Probentrager (gemäß Figur 2) , der mit einem Abdruckwerkzeug 200 gemäß den Figuren 3 bis 5 hergestellt wird.

Erfmdungsgemaß kann vorgesehen sein, dass die Ausnehmungen 83 im Kunststoffeinsatz 82 durch diesen vollständig durchgebohrt sind und sich auch in entsprechenden Ausnehmungen 84 in der Gegenplatte 80 fortsetzen. Diese Offnungen dienen dem Austritt von verdrängter Luft bzw. überschüssigem Schichtmaterial .

Der Einfulistutzen 90 ist außen am zusammengesetzten Abdruckwerkzeug 200 an der Einfulloffnung 71 befestigt. Er dient dem Einbringen des gelosten Polymermaterials in die zusammengesetzte Werkzeugform.

Das Abdruckwerkzeug 200 wird mit Halterungsstiften 62, 63, 64, 65 zusammengehalten, die durch entsprechende Bohrungen an den Ecken der Grund-, Zwischen- und Gegenplatten fuhren. Zur Fixierung der Teile ist eine Schraubverbindung (im Einzelnen nicht dargestellt) vorgesehen. Alternativ können auch äußere Klemmeinrichtungen oder ein gesonderter Rahmen zum Zusammenhalten der Platten vorgesehen sein.

Das Abdruckwerkzeug 200 kann wie folgt modifiziert sein. Im Innern der Zwischenplatte 70 kann zusatzlich ein Metallrahmen angebracht sein, der die gewünschten Außenmaße der Kompartimentschicht besitzt und mit dieser auch beim spateren Einsatz verbunden bleibt. Die Stifte 61 können an ihren Enden zur Erleichterung in die Einfuhrung in die entsprechenden Ausnehmungen in der Grund- bzw. Gegenplatte abgerundet sein. Zur Integration der unter Bezug auf Figur 1 genannten Manipulati- ons- und Untersuchungseinrichtungen in den Probentrager 20 kann vorgesehen sein, die Zwischenplatte 70 entsprechend mit Halterungen für diese zusatzlichen Einrichtungen zu versehen. Diese Halterungen umfassen bspw. Durchtrittsoffnungen im durch die Zwischenplatte 70 gebildeten Rahmen vom Inneren des Abdruckwerkzeugs 200 nach außen, die jeweils mit Fixierungen (z. B. Klemmen) für die jeweiligen zusatzlichen Einrichtungen ausgestattet sind. Schließlich ist es nicht zwingend erforderlich, dass sämtliche Strukturen der gewünschten Kompartimentschicht tatsachlich als Vorsprunge auf der Grundplatte 60 ausgebildet sind. Der fertige Probentrager kann ohne Weiteres noch mit zusatzlichen Strukturen versehen werden (z. B. Einbohren der Vorratstopfe 33) .

Zur Herstellung des Probentragers wird zunächst das Abdruckwerkzeug 200 zusammengesetzt. Die Stifte 61 werden in die Grundplatte 60 gesteckt. Die Grund-, Zwischen- und Gegenplatten werden zusammengesetzt, so dass die Stifte 61 in die Ausnehmungen 83 im Kunststoffeinsatz 82 ragen. Auf diese Weise entsteht ein nach allen Seiten im Wesentlichen geschlossenes Behältnis, zwischen dessen seitlichen Platten (Grund- und Gegenplatten) sich die Stifte 61 erstrecken. Die Führungsstifte 62 bis 65 werden z. B. mit Flügelmuttern festgezogen. Das zusammengesetzte Werkzeug wird mit vertikal ausgerichteten Platten aufrecht aufgestellt. Die Einfulloffnung 71 weist nach oben.

Danach wird das Abdruckwerkzeug 200 durch die Einfulloffnung 71 mit einer Losung der jeweils gewünschten Polymerzusammensetzung gefüllt. Dies erfolgt vorzugsweise mit einer Spritze direkt in die Einfulloffnung 71 oder unter Verwendung des Einfullstutzens 90. Das Einfüllen erfolgt als langsames Einlaufen unter Vermeidung von Spritzern oder Wirbeln, damit das Innere des Abdruckwerkzeugs 200 möglichst gleichförmig gefüllt wird. Vorzugsweise wird die Polymerzusammensetzung im Wesentlichen druckfrei in das Abdruckwerkzeug eingefüllt. Das Einfüllen erfolgt solange, bis die geloste Polymerzusammensetzung aus den Austrittsoffnungen 72 herausquillt. Diese werden dann bspw. mit einem Klebeband ver- schlössen. Nach dem Verschließen wird noch geringfügig weiteres Material nachgefüllt.

Anschließend erfolgt das Trocknen oder das Vernetzen der Polymerzusammensetzung vorzugsweise bei Raumtemperatur. Dies kann bspw. rund 8 bis 12 Stunden dauern. Der Losungsmittelentzug bzw. das Vernetzen der Polymerzusammensetzung kann durch eine Temperierung beschleunigt werden. Schließlich werden die Verbindungen der Platten über die Fuhrungsstifte 62 bis 65 gelost, die Platten voneinander getrennt und die elastische Kompartimentschicht von der Maske bzw. Abdruckform gezogen. Ein besonderer Vorteil des Einsatzes von Silikonkautschuk besteht hier darin, dass dieses Abziehen ohne Probleme und ohne Beschädigungen des Probentragers erfolgen kann.

Das Vernetzen erfolgt bei Verwendung des Polymers Elastosil M 4600 vorzugsweise bei Raumtemperatur, kann aber auch bei höheren Temperaturen im Trockenschrank oder einem Ofen durchgeführt werden. Das Vernetzen ist im Wesentlichen ein chemisches Vernetzen, bei dem gegebenenfalls unter Anwesenheit eines Katalysators eine Polymerisierungsreaktion durchgeführt wird. Bei anderen Polymeren erfolgt die Vernetzung bei der jeweils spezifizierten Vernetzungstemperatur.

Es kann sich eine Abschlussbehandlung zum nachtraglichen Einbringen von Kompartimentstrukturen (z. B. Vorratstopfe) oder zur Anpassung bzw. Ausrichtung der zusatzlichen Manipulati- ons- und Untersuchungseinrichtungen anschließen. Auch eine chemische Nachbehandlung der Oberflache des Probentragers ist möglich. Der fertige Probentrager wird dann auf ein Bodenteil aufgelegt und mit diesem durch einfaches manuelles Andrücken verbunden.

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist am Beispiel eines Mikroprobentragers für kleinste Flussigkeitsmengen in den Figuren 6 bis 8 illustriert. Figur 6 zeigt zunächst einen Großenvergleich zwischen einem erf dungsgemaßen Reaktionssubstrat bzw. einem Probentrager 20 (Imker Teil der Abbildung) und einem herkömmlichen Probentrager 20', der aus Silizium hergestellt ist. Auf einer Grundflache von rund 10 mm • 15 mm tragt der Probentrager 20 eine Matrixanordnung aus insgesamt rund 600 trichterförmig gebildeten Kompartimenten (siehe unten). Jedes Kompartiment besitzt eine charakteristische Querschnittsdimension von rund 0,5 mm. Der herkömmliche Siliziumprobentrager 20' hingegen besitzt ein erheblich gröberes Raster, das darüber hinaus mit aufwendigen Prozessie- rungstechniken hergestellt wurde.

Figur 7 zeigt einen vergrößerten Ausschnitt des Probentragers 20. Diese Abbildung wurde mit einem mversen Mikroskop mit einer CCD-Kamera aufgenommen. Der Probentrager 20 tragt die geraden Reihen und Spalten angeordneten Kompartimente 34. Diese besitzen eine sich von der Oberflache des Probentragers

20 in die Kompartimentschicht hinein verjungende Querschnittsform wie eine umgekehrte, abgeschnittene Pyramide. Am Boden besitzen die Kompartimente eine charakteristische Seitenlange, die ungefähr 1/3 der oberen Kantenlange betragt. Der jeweils hell gezeigte Boden wird durch das gemeinsame Bodenteil 10 (siehe Fig. 1) gebildet. Die Kompartimentschicht

21 des Probentragers 20 wird von den Kompartimenten vollständig durchstoßen.

Ein Probentrager gemäß den Figuren 6 bis 8 wird mit einem entsprechend angepassten Abdruckwerkzeug analog zu dem unter Bezug auf die Figuren 3 bis 5 beschriebenen Verfahren hergestellt. Im Abdruckwerkzeug sind die Vorsprunge auf der Grundplatte dann nicht durch eingesteckte Stifte, sondern pyramidenförmig durch mechanisches Fräsen gebildet. Nach Herstellung der Kompartimentschicht 21 wird diese auf ein Glas- Bodenteil haftend aufgebracht. Dann werden die Kompartimente gefüllt und anschließend gegebenenfalls mit einem weiteren Glas als Abdeckung oder mit einer Folie verschlossen. Die mikroskopische Vermessung der Proben m den Kompartimenten erfolgt von der Seite des Bodenteils 10 her durch die unteren kleineren Offnungen der Kompartimentschicht 21. Die Kantenlange der unteren Offnungen betragt jeweils rund 150 μm.

Figur 8 zeigt Einzelheiten der zwischen den Kompartimenten gebildeten Stege. Wie auch aus Figur 7 ersichtlich, ist die Kompartimentschicht so geformt, dass die Wände zwischen den Kompartimenten 34 in Reihenrichtung durchgehende Stege 35 und in Spaltenrichtung unterbrochene Stege 36 bilden. Zwischen den Enden der unterbrochenen Stege 36 und dem jeweils angrenzenden durchgehenden Steg 35 bildet sich ein Überlauf 37. Der Überlauf 37 erlaubt die Herstellung einer Flussigkeitsverbin- dung zwischen benachbarten Kompartimenten, ohne ein Übertreten über die obere Oberflache des Probentragers 20. Die Anordnung der Überlaufe kann anwendungsabhangig modifiziert sein.

In Figur 9 sind verschiedene Gestaltungen von Kanalstrukturen in einem erfindungsgemaßen Probentrager vergrößert dargestellt. Die Kanäle 32 sind allgemein in der Schichtebene offene Probenkompartimente oder Kompartimentstrukturen, deren Ausdehnung in einer Richtung erheblich großer als in einer dazu senkrechten Richtung sind. Kanäle werden im Probentrager geformt, indem zu dessen Herstellung eine Maskenform mit stegformigen Vorsprungen auf der Grundplatte des Abdruckwerkzeugs verwendet werden. Die Kanäle können beliebig gerade oder gekrümmt einzeln oder sich verzweigend oder miteinander verbunden verlaufen. Je nach Gestaltung des Probentragers können sogar in sich geschlossene Kanäle gebildet werden, falls der Kanalboden selbst Teil des Probentragers ist, die entsprechenden Kompartimentstrukturen also nicht vollständig durch die Kompartimentschicht hindurchgehen. Figur 9A zeigt eine Kanalstruktur mit mehreren Kanälen 32a bis 32c, die an einem Mischungskreuz 32d verbunden sind. An den Kanalenden befinden sich jeweils Vorratstopfe 33a bis 33d. Das Bezugszeichen 32e weist auf eine Verengungsstelle. Die Verengungsstelle 32e kann stromungsmechanisch durch Barrieren (ausgewolbte Kanalwand) oder auch elektrisch durch elektrische Feldbarrieren gebildet werden, bspw. um die Flu- ldstromung vor diesem Bereich zu verzogern und dort Messungen an suspendierten Partikeln m der Fluidstromung durchzufuhren.

Eine Abwandlung ist in Figur 9B gezeigt. Zwei Teilkanale 32a, 32b verbinden sich in einem gemeinsamen Kanal 32c. Diese Struktur dient dem Vermischen von zwei Fluidstromen in einen einzigen Fluidstrom. Der Winkel zwischen den Teilkanalen 32a, 32b ist anwendungsabhangig zur Erzielung eines gleichförmigen Stromens an dem Mischungspunkt 32d eingestellt. Eine weitere Abwandlung von Strukturen zum Vermischen der Fluid- stromungen ist in Figur 9C als Doppelkreuzanordnung mit mehreren Teilkanalen illustriert, die in zwei Mischungspunkte 32d munden.

Die Mäanderform 32f gemäß Figur 9D dient der Schaffung einer besonders langen Messstrecke. Zwischen den Vorratstopfen 33a bis 33c einerseits und dem Vorratstopf 33d erstreckt sich em langer, gewundener Kanal m einem Flachenbereich, der bspw. e Target zur Beleuchtung für Fluoreszenzmessungen bildet.

Die erfmdungsgemaßen Reaktionssubstrate oder Probentrager besitzen besondere Vorteile in Bezug auf die Ausbildung der Kanalstrukturen. Zur Herstellung der Maske für das Abdruckwerkzeug können mit herkömmlichen feinmechanischen Werkzeugen (z. B. CNC-Masch en) aus gebrauchlichem Werkstoff, vorzugsweise Aluminium oder andere metallische Werkstoffe, beliebige Kanalverlaufe vorbereitet werden. Sie können insbesondere in Bezug auf die Lange, die relative Orientierung (Winkel) , die Biegungen und Wendungen, Mischungsstrukturen und Teilkanale anwendungsabhangig in vorbestimmter Weise gestaltet werden. Kanäle dieser Art lassen sich bis hinab zu Kanalbreiten von rund 6 μm mit herkömmlichen feinmechanischen Werkzeugen präzise und reproduzierbar fertigen. In die Kanäle können Vorsprunge oder Kanten eingearbeitet werden, die ein verbessertes Vermischen mehrerer Fluidstromungen bei der Zusammenfuhrung mehrerer Kanäle ermöglichen. Die Kanäle können mit Elektroden zum Messen der Eigenschaften der Fluidstromungen oder zu deren Manipulierung auf der Grundlage der Elektroos- mose, mit Sensoren oder Temperierelementen und auch mit Sperr- oder Ventilelementen sowie Piezopumpen ausgestattet sein.

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung mit einer makroskopischen Kompartimentstruktur ist in Figur 10 in Drauf- und Schnittansicht illustriert.

Ein erfindungsgemaßes Reaktionssubstrat oder ein erfindungs- gemaßer Probentrager 20 kann auch mit einem einzigen Kammer- kompartiment 38 ausgestattet sein. Die Kompartimentschicht 21 ist lediglich ein Ring aus der jeweils verwendeten Polymerzusammensetzung, z. B. Silikonkautschuk. Dieser Ring haftet zwischen einem Bodenteil 10, z. B. einer Glasplatte, und einer Abdeckung 50, so dass eine geschlossene, schichtformige Kuvette z. B. für die Fluoreszenzspektroskopie gebildet wird. Wegen des flussigkeitsdichten Anhaftens des Probentragers 20 an den Glasmaterialien des Bodenteils 10 bzw. der Abdeckung 50 kann diese Kuvette dauerhaft mit Losungsmitteln oder Probelosungen beschickt und wie eine Festschichtprobe Fluoreszenzmessungen unterzogen werden. Die Figuren 11 und 12 illustrieren besondere Vorteile erfin- dungsgemaßer Reaktionssubstrate hinsichtlich der Planaπtat der Probenanordnung, die f r mikroskopische Untersuchungen von Bedeutung ist, und der well-to-well-Dichtigkeit der Kompartimentstrukturen. Zur Demonstration der Planaritat wurde die Variation der z-Position über dem gesamten Bereich der Bodenflache des Reaktionssubstrates mit einem konfokalen Mikroskopaufbau (Reflektion des Laserstrahls auf der Glasoberflache des Bodens, aufgenommen mit einer CCD-Kamera) bei einem konventionellen, handelsüblichen Reaktionssubstrat oder Probentrager (linkes Teilbild n Figur 11) und für em erfmdungsgemaßes Reaktionssubstrat (rechtes Teilbild Figur 11) vermessen.

Bei den konventionellen, handelsüblichen Probentragern oder Reaktionssubstraten ergibt sich eine für konfokal-fluorimetrische Anwendungen nicht mehr tolerierbare Variation des Plattenbodens m z-Richtung um bis zu 300 μm vom Rand der Platte bis zu ihrer Mitte. Es ist em eindeutiger Verlauf eine Richtung („Durchhangen" des Reaktionssubstrates m seiner Mitte) zu erkennen. Das Reaktionssubstrat, das Gegenstand dieser Anmeldung ist, weist eine Variation des Plattenbodens m z-Richtung von weit weniger als 100 μm auf. Diese Abweichung liegt deutlich unterhalb der Toleranz von rund 150 μm f r konfokal-fluorimetrische Anwendungen. Weiterhin ist lediglich eine statistische Fluktuation der z-Abweichung um den Mittelwert nach oben bzw. unten hm zu erkennen, eine Tendenz m der Abweichung findet sich nicht (z. B. kein „Durchhangen" des Reaktionssubstrates m seiner Mitte) .

In Figur 12 sind die 1536 Wells eines erfmdungsgemaßen Reaktionssubstrates mit den Ergebnissen von jeweils m den Wells durchgeführten Messungen dargestellt. Für die Untersuchung wurde em Reaktionssubstrat m Form eines „Schachbrettmusters" alternierend mit Suspensionen von sogenannten aktiven und sogenannten nicht aktiven Bakterien befullt (jeweils 330 nl pro Well) . Nach einer Inkubationszeit von 21 h wurden alle Wells gleichmaßig mit jeweils 1 μl Assay versetzt, nach einer weiteren Inkubationszeit von 30 min wurden samtliche Wells des Reaktionssubstrates mit Hilfe von CFCA-Messungen (1 s Messzeit pro Well) vermessen.

In Wells, die mit aktiven Bakterien versetzt sind, werden die zweifarbig markierten Assaymolekule gespalten, so dass das CFCA- Signal klein wird (schwarze Felder im Plot) . In Proben, die mit nicht-aktiven Bakterien versetzt sind, werden die zweifarbig markierten Assaymolekule nicht gespalten, so dass das CFCA- Signal groß bleibt (weiße Felder im Plot). Nur bei insgesamt sechs von 1536 Wells tritt ein „Fehler" auf, der von einer Undichtigkeit zwischen einzelnen Wells herrühren konnte. Es kann sich dabei aber auch um Fehler handeln, die bereits beim Pipet- tieren der Bakterien-Suspensionen entstanden sind. Die obere Grenze für Fehler, die durch Undichtigkeiten von Well zu Well auftreten betragt also höchstens 0,4 %.

Dieses hervorragende Ergebnis ist vorteilhafterweise auch zeitstabil. Das Reaktionssubstrat ist auch nach wenigstens 48 h (Zeit vom Vorbereiten der Proben über Inkubation bis zum Ab- schluss der Messungen) noch in der Weise stabil, dass die Wells gegeneinander abgeschlossen sind und Messungen in der Platte durchgeführt werden können (ohne Verklebung des Bodenglases, das nach Ende der Messungen wieder entfernt werden kann) .

Das in Figur 12 illustrierte Ergebnis zeigt auch, dass das Wachstum der Bakterien von der Kompartimentschicht nicht unterbunden wird (Biokompatibilitat ) .

Die erfindungsgemaßen Probentrager bzw. Reaktionssubstrate können allgemein in allen Gebieten der Biochemie, Biologie oder molekularen Biotechnologie angewendet werden, bei denen eine oder mehrere Proben in definierter Form gehaltert, manipuliert oder verändert werden sollen. Bevorzugte Anwendungen liegen in der Bearbeitung von Suspensionen mit bestimmten Partikelgemischen. Mit erfindungsgemaßen Reaktionssubstraten können bspw. Zeilsortierer, Molekulsortierer oder anderweitige Zellmanipulatoren aufgebaut werden. Es sind samtliche Anwendungen der fluidisc en Mikrosystemtechnik implementierbar.

Die erfindungsgemaßen Reaktionssubstrate sind mit besonderem Vorteil in Syntheseverfahren verwendbar, die auf kombinatorischer Chemie beruhen. Insbesondere können die erfindungsgemaßen Reaktionssubstrate zur Identifizierung und Validierung von Targets, d. h. spezifischen biologischen Molekülen, wie Enzymen, Rezeptoren oder Ionenkanalen verwendet werden. Des Weiteren können sie sehr gut zur Identifizierung von biologisch aktiven Substanzen und/oder pharmazeutischen Wirkstoffen eingesetzt werden. Durch die Möglichkeit der Verwendung der erfindungsgemaßen Reaktionssubstrate in Testverfahren mit hohem Probendurchsatz (sogenanntes high throughput screening, HTS) können deutlich mehr Substanzen innerhalb kurzer Zeit in Bezug auf ihre biologische Aktivität und/oder pharmazeutische Wirksamkeit untersucht werden. Dies ist von besonderer Bedeutung, um die mittels kombinatorischer Chemie erhaltenen Substanzbanken in Bezug auf ihre biologische Aktivität und/oder pharmazeutische Wirksamkeit zu untersuchen. Es ist mit den erfindungsgemaßen Reaktionssubstraten möglich, einen hohen Probendurchsatz zu erreichen und zwischen mehreren Tausend bis zu 100000 Substanzen pro Tag zu untersuchen.

Die erfindungsgemaßen Reaktionssubstrate sind weiterhin sehr gut für die Durchfuhrung von Assay-Verfahren geeignet. Bei diesen Assay-Verfahren werden Targets und chemische Verbindungen zur Untersuchung von chemischen und/oder biologischen Wechselwirkungen kombiniert. Es ist somit auf einfachem Wege möglich, em Modellsystem zu etablieren, das es erlaubt, Substanzen zu identifizieren, die das Target m der gewünschten Weise beeinflussen. Die erfindungsgemaßen Reaktionssubstrate können sowohl für bio- chemische als auch zellulare Assay-Verfahren verwendet werden. Eingeschlossen sind dabei auch Assay-Verfahren die auf der Verwendung von vesikularen Partikeln oder Feststoffpartikeln (sogenannte Beads) basieren.

Die erfindungsgemaßen Reaktionssubstrate eignen sich weiterhin sehr gut zur Durchfuhrung von Assay-Verfahren, die auf der Verwendung von vereinfachten Modellsystemen beruhen, die die Physiologie im Menschen oder im Tier nachbilden. Dies bedeutet, die Assay-Systeme können u. a. dazu verwendet werden, Informationen über die Loslichkeit von biologisch aktiven und/oder pharmazeutisch wirksamen Substanzen im Blutplasma, ihre Penetrationseigenschaften, ihre Leber-Toxizitat, ihre Bioverfugbarkeit , ihre Stabilität im Blut oder ihre Abbauprofile nach Passage der Leber zu erhalten.

Die chemischen und biotechnischen Untersuchungen können bspw. 1) zur Identifizierung und Charakterisierung von synthetischen oder biologischen Objekten, 11) zur Identifizierung und Charakterisierung von chemischen Verbindungen, 111) zur Identifizierung und/oder Validierung von Targets, IV) zur Suche nach biologisch aktiven Substanzen und/oder pharmazeutischen Wirkstoffen, v) zur Identifizierung von Leitstrukturen, vi) zur Genomanalyse, vn) zur Proteomanalyse, vm) zur Reinigung und Konzentrierung von Substraten, oder ix) zur evoluti- ven Optimierung von biologisch relevanten Makromolekülen verwendet werden.

Claims

Patentansprüche

1. Reaktionssubstrat (100) mit einer Kompartimentstruktur (30) , durch die Probenreservoire (31) gebildet werden, die matrixartig in geraden Reihen und Spalten angeordnet sind, gekennzeichnet: durch ein Bodenteil (10), das ein Glas-, Kunststoff-, Metall- oder Halbleitersubstrat umfasst und eine im Wesentlichen ebene, glatte Oberfläche besitzt, und eine flexible Kompartimentschicht (21) aus einem Polymermaterial, in dem die Probenreservoire (31) ausgebildet sind, wobei das Polymermaterial eine viskoelastische Polymerzusammensetzung ist, die in bezug auf die Oberfläche des Glas-, Kunststoff-, Metall- oder Halbleitersubstrats eine inhärente Haftfähigkeit besitzt und vom Bodenteil (10) im Wesentlichen beschädigungsfrei ohne Einbußen von Form, Haftfähigkeit und Flexibilität trennbar ist, wobei die Kompartimentschicht (21) von den Probenreservoiren (31) vollständig durchstoßen wird, so dass an den Böden der Probenreservoire (31) die Oberfläche des Bodenteils freiliegt.

2. Reaktionssubstrat gemäß Anspruch 1, bei dem das Bodenteil aus einem transparenten Material besteht.

3. Reaktionssubstrat gemäß Anspruch 2, bei dem das Bodenteil (10) eine im Wesentlichen ebene, glatte Glasplatte ist.

4. Reaktionssubstrat gemäß Anspruch 3, bei dem die Glasplatte die Dicke eines Deckglases besitzt, das in der Mikroskopie eingesetzt wird.

5. Reaktionssubstrat gemäß Anspruch 4, bei dem die Dicke des Deckglases rd. 150 μm betragt.

6. Reaktionssubstrat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Polymerzusammensetzung klebstoff- und lösungsmittelfreie Natur- oder Synthesekautschuke umfasst.

7. Reaktionssubstrat gemäß Anspruch 6, bei dem die Polymerzusammensetzung Silikonkautschuk umfasst.

8. Reaktionssubstrat gemäß Anspruch 6, bei dem die Polymerzusammensetzung klebstofffrei auf dem Bodenteil (10) haftet.

9. Reaktionssubstrat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Kompartimentschicht (21) vom Bodenteil (10) im Wesentlichen beschadigungsfrei ohne Einbußen von Form, Haftfähigkeit und Flexibilität trennbar ist.

10. Reaktionssubstrat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Kompartimentschicht (21) auf der zum Bodenteil (10) entgegengesetzten Seite eine Abdeckung (50) tragt.

11. Reaktionssubstrat gemäß Anspruch 10, bei dem die Abdeckung (50) Durchtπttsoffnungen (51) zur Beschickung der Kompartimentstrukturen (30) mit flussigen Proben oder zur Entnahme solcher Proben aufweist.

12. Reaktionssubstrat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Kompartimentstrukturen (30) neben den Probenreservoiren (31) Kanäle (32) und/oder Vorratstopfe (33) umfassen.

13. Reaktionssubstrat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem in der Kompartimentschicht (21) Manipulationsund Untersuchungseinrichtungen (40) vorgesehen sind, die Flu- idleitungen (41), Elektroden (42) und/oder Sensoren (43) umfassen.

14. Reaktionssubstrat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, das eine Mikro- oder Nanotiterplatte bildet.

15. Reaktionssubstrat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem Variationen der Probenreservoirpositionen in einer Richtung senkrecht zur Ebene des Reaktionssubstrates über die gesamte Fläche des Bodenteils hinweg weniger als 250 μm, bevorzugt weniger als 150 μm, besonders bevorzugt weniger als 100 μm betragen.

16. Verwendung eines Reaktionssubstrates gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15:

- zur Identifizierung und Charakterisierung von synthetischen oder biologischen Objekten,

- zur Identifizierung und Charakterisierung von chemischen Verbindungen,

- zur Identifizierung und/oder Validierung von Targets,

- zur Suche nach biologisch aktiven Substanzen und/oder pharmazeutischen Wirkstoffen,

- zur Identifizierung von Leitstrukturen,

- zur Genomanalyse

- zur Proteomanalyse,

- zur Reinigung und Konzentrierung von Substraten, oder

- zur evolutiven Optimierung von biologisch relevanten Makromolekülen.