DE19933018A1 - Vorrichtung und Verfahren zu kontrollierten Überspülung von Proben mit Flüssigkeiten - Google Patents

Abstract

Mit der oben beschriebenen Vorrichtung zur kontrollierten Überspülung von Proben mit Flüssigkeiten können eine in gewissen Grenzen frei wählbare Anzahl an Proben mit unterschiedlichen Lösungen auch im schnellen Wechsel überspült werden. Im Gegensatz zu bereits verbreiteten Verfahren sind die Versuchsparameter exakt festlegbar und können somit konstant gehalten werden. Echte "constant composition" Bedingungen sind realisierbar. Bei Wahl eines Spülkanals mit geringer Höhe genügt ein geringer Fluss der Spüllösungen, um stets frische Lösung an die Proben heranzuführen. Der Lösungsverbrauch ist dadurch deutlich reduziert.

Description

Bei kariöser Zahnsubstanz handelt es sich um Zahnschmelz oder Dentin, welchem durch die Einwirkung bakteriell erzeugter Säuren lokal Mineralien entzogen wurden. Im Munde laufen stets Demineralisations- und Remineralisationsvorgänge im Wechsel ab. Überwiegt an einem Ort die Demineralisation, so entsteht Karies. In der Forschung über De- und Remineralisationsvorgänge an Zahnschmelz und Dentin, sowie die Möglichkeiten diese zu beeinflussen, ist es häufig sinnvoll, an Zahnproben Karies in vitro zu erzeugen und/oder kariöse Läsionen zu remineralisieren. Initiale frühe kariöse Läsionen an Schmelz und Dentin in vivo zeigen histologisch (Polarisationsmikroskopie, Mikroradiografie) einen charakteristischen geschichteten Aufbau. Bei der Erzeugung künstlicher kariöser Läsionen ist es daher ein Ziel, diesen Aufbau auch in vitro realisieren zu können.

Stand der Technik ist die in-vitro Erzeugung initialer kariöser Läsionen, wie er in der Literatur beschrieben ist wie folgt:

a) bakterielle Besiedlung der Zahnproben (Plaque)

Durch Lagerung in, oder Zufuhr von steriler Nährlösung an zuvor sterilisierte und mit bestimmten Keimen beimpfte Zahnsubstanz kann künstlicher bakterieller Zahnbelag (Plaque) gezüchtet werden. Dieser Belag kann zur Entstehung künstlicher kariöser Läsionen führen. Nachteilig an dieser Methode ist der hohe zeitliche, personelle und materielle Aufwand. Zudem ist die Reproduzierbarkeit exakt gleicher Bedingungen zu unterschiedlichen Zeiten und Orten nicht sicher. Eine exakte Trennung von De- und Remineralisationsvorgängen ist nicht möglich. Insgesamt liegen keine konstanten Versuchsbedingungen vor. Die Plaque verändert sich im Verlauf der Zeit. Plaque-pH und Puffereigenschaften sowie ionische Zusammensetzung an der Probenoberfläche sind Schwankungen unterworfen und nicht zu jedem Zeitpunkt exakt bestimmbar. Darüber hinaus besteht durch den Umgang mit Mikroorganismen ein erhöhtes Infektionsrisiko.

b) Einlegen von Zahnproben in ein saures Gel ("acidic gelatin method")

Zahnproben werden bei dieser Methode in einer warmen Lösung mit vorgegebenem pH-Wert eingelegt, welche bei Erkalten geliert. Mit dieser Methode ist es möglich, an Zahnoberflächen künstliche kariöse Läsionen zu erzeugen, die natürlichen Läsionen sehr nahe kommen. Eine Remineralisation vorhandener Läsionen hingegen ist mit dieser Methode nicht möglich. Darüber hinaus können keine De- und Remineralisationswechselzyklen durchgeführt werden. Insgesamt liegen keine konstanten Versuchsbedingungen vor. So kommt es im Verlauf der Einlagerung in ein saures Gel zu einem Anstieg des pH-Wertes und einer Veränderung der Ionenzusammensetzung im Gel an der Probenoberfläche. Schließlich ist es nicht möglich, die Proben intermittierend mit dritten Substanzen (z. B. Fluoridlösungen) in Kontakt zu bringen.

c) Einlegen von Zahnproben in eine saure Lösung (Bad) mit remineralisierenden Komponenten

Auch diese Methode führt zu künstlichen Läsionen, die natürlichen Läsionen sehr nahe kommen. Um in sauren Lösungen mit remineralisierenden Komponenten kariesähnliche Läsionen zu erzeugen, muß der Probenoberfläche stets frische Lösung zugeführt werden. Um die verwendete Lösung homogen zu halten, und der Probenoberfläche frische Lösung zuzuführen, muß das Lösungsbad gerührt werden. Dies kann zu einem unkontrollierten Strömungsverlauf an den Probenoberflächen führen. Erosive Auswaschungen an der Probenoberfläche sowie Zonen mit zu geringem Lösungsaustauch sind somit nicht auszuschließen. Darüberhinaus liegen keine konstanten Versuchsbedingungen vor. Über den Versuchszeitraum reichern sich in der Lösung Ionen aus den mineralischen Probenoberflächen an. Zusätzlich ist ein pH-Anstieg zu verzeichnen. Um mit der beschriebenen Methode konstante Demineralisationsbedingungen zu erzielen, müsste ein Lösungsbad mit einem sehr großen Volumen angesetzt werden.

Über die Verwendung von Demineralisationslösungen hinaus können mit dieser Methode auch Remineralisationslösungen zur Remineralisation bereits vorhandener Läsionen eingesetzt werden. Daher können bei Vorhandensein von je einem De- und Remineralisationsbad auch De- und Remineralisationszyklen ausgeführt werden. Dies erfordert jedoch eine mechanische Apparatur zur zyklischen Umsetzung der Proben von einem Bad in das andere.

d) Überspülen von Zahnproben mit sauren Lösungen mit remineralisierenden Komponenten

Bei dieser Methode werden wie bei den vorher beschriebenen auch, die Schmelz oder Dentinproben in Kunststoff eingebettet und an der Oberfläche plangeschliffen und poliert. Diese Proben werden aber auf einer schiefen Ebene montiert und von oben mit der gewünschten Lösung überspült die über die Proben fließt, aufgefangen und verworfen wird. Auch mit dieser Methode lassen sich künstliche kariöse Läsionen erzeugen, sowie eine Remineralisation vorhandener Läsionen in vitro durchführen. Darüber hinaus können die Proben jederzeit mit einer dritten Lösung zwischengespült werden. Durch die Verwendung stets frischer Lösung, die nach einmaligem Probenkontakt verworfen wird, ist eine stets gleichbleibende Zusammensetzung der Spüllösung an der Probenoberfläche vom Prinzip her realisierbar. Bei nur geringem Lösungsfluss (einzelne Tropfen) besteht jedoch die Gefahr, daß die Lösung zu lange auf der Probe verweilen kann und nur schubweise erneuert wird. Ein weiteres Problem besteht darin, daß der die Zahnprobe umgebende Kunststoff im Vergleich zu der Zahnhartsubstanzprobe stark hydrophob ist. Daher bildet sich auf der gesamten Probe kein gleichmäßig dicker Lösungsfilm aus. Es kann daher angenommen werden, daß bei einer niedrigen Flußrate keine konstanten Bedingungen an der Probenoberfläche gegeben sind. Dies wäre möglicherweise mit einer hohen Flussrate zu erzielen. Jedoch würde dies einen entsprechend hohen Verbrauch an Spüllösung nach sich ziehen.

Es ist deshalb eine Aufgabe der Erfindung, eine gleichmäßige laminare Strömung an der Probenoberfläche zu erzielen, die weitgehend unabhängig vom Fluss der Lösung ist. Auch bei einem sehr kleinem Durchsatz ist ein gleichmäßiger Lösungsaustausch an der Probenoberfläche gewährleistet. Konstante Bedingungen (pH, Ionenzusammensetzung) an der Probenoberfläche sind somit realisierbar.

Der Verbrauch der Spüllösung kann sehr klein gewählt werden. Darüber hinaus vereinigt die Erfindung die Vorteile aus allen oben beschriebenen bereits bekannten Verfahren in sich. So ist es mit dem neuen Verfahren möglich, die Proben mit mehreren unterschiedlichen Lösungen in einer beliebig wählbaren Abfolge zu überspülen. Bei Verwendung von steuerbaren Mehrkanalschlauchpumpen kann eine (theoretisch unbegrenzt hohe) Anzahl von Spüllösungen in frei wählbarer Reihenfolge und zusätzlich mit individuell angepasstem Durchsatz in beliebig wählbaren Zeitintervallen gewechselt werden. Darüber hinaus könnten auch Spüllösungen höherer Viskosität sicher mit der Probenoberfläche in Kontakt gebracht werden, da ein Ausweichen zur Seite oder eine ungenügende Adaptation an der Probe durch die vorgegebene Form des Spülkanals nicht möglich ist. Auch schwer entfernbare Lösungen einer Zwischenspülung können durch einen kurzzeitigen hohen Durchsatz der nachfolgenden Spüllösung ohne eine aufwendige mechanische Reinigung von der Probenoberfläche entfernt werden. Alle Parameter wie unterschiedlichen Lösungen bei Wechselzyklen, Dauer der Einwirkzeit, Abfolge und Temperatur können exakt determiniert und aufgezeichnet werden. Des weiteren kann mit der neuen Vorrichtung eine unterschiedliche Anzahl an Proben überspült werden. Die Proben können darüber hinaus schnell entnommen oder gewechselt werden. Nach Überspülung der Proben kann die Spüllösung pro Probe gesammelt und analysiert werden.

Weitere Anwendungen sind vorstellbar. Der Spülkanal der neuen Vorrichtung könnte als Inkubationskammer für Mikroorganismen zur Erzeugung und Aufrechterhaltung einer künstlichen Plaque oder anderer Biofilme Verwendung finden. Anstelle de- oder remineralisierender Spüllösungen könnten dem Spülkanal Nährlösungen auch im Wechsel in unterschiedlicher Zusammensetzung zugeführt werden.

Das neue Verfahren würde sich auch für Überspülungsexperimente mit anderen Materialien als Schmelz und Dentin eignen. Vorstellbar wären zum Beispiel Biomaterialien wie Knochenersatzmaterialien aber auch Metalle, Keramiken, Gläser oder Polymere deren Oberflächeneigenschaften wie Säureresistenz oder Korrosionsfestigkeit von Interesse sind.

Erfindungsgemäß wird dies wie folgt gelöst: Die Proben (1) werden vorzugsweise in Autopolymerisat (z. B. PMMA) eingebettet und an der Probenoberfläche plangeschliffen und poliert und zu einem Probenblock zusammengefaßt (2). Auch die Verwendung in anderer Weise vorbehandelter oder unbehandelter Proben ist möglich. Die Probe können dabei einzeln oder zu mehreren in z. B. Reihen eingebettet werden. Auf den Probenblock wird nun eine Deckplatte mit einer Fräsung (3) so aufgesetzt und festgeklemmt, daß durch die Fräsung über den Proben ein Spalt (4) frei bleibt. Die Deckplatte liegt zu drei Seiten der Proben auf dem Probenblock plan auf, wodurch eine Abdichtung gewährleistet ist. Die vierte und freie Seite dient dem Ablauf der Spülflüssigkeit (5). An der gegenüberliegenden Seite der Deckplatte befindet sich eine vorzugsweise senkrechte Bohrung, welche in den Spülkanal mündet (6). Diese Bohrung dient dem Zulauf der Spüllösungen. Diese Bohrung kann nach außen für die Aufnahme eines kleinen Röhrchens erweitert sei (7). Auf dieses Röhrchen kann ein passender Schlauch mit der zuzuführenden Spüllösung angeschlossen werden. Eine technische Ausführungsform kann dabei auch mehrere Zulauf-Bohrungen in die Deckplatte enthalten. Dadurch ist es möglich, schnelle Wechsel unterschiedlicher Spüllösungen, Wechselspülungen und Zwischenspülungen durchzuführen.

Durch die Durchströmung des flachen Spaltes kann über den Probenoberflächen eine laminare Strömung erzeugt werden. Turbulente Strömungen können bei entsprechender Gestaltung der den Spalt bildenden Oberflächen erzeugt werden. Wird die Höhe des Spaltes besonders klein gewählt, so können kapilläre Effekte erzielt werden. Ausserdem ist die Zufuhr stets frischer Lösung auch bei kleinen Fördermengen gegeben.

Es können mehrere Einheiten der Vorrichtung nebeneinander betrieben werden. Die Spüllösungen könnten von einer z. B. Mehrkanal-Schlauchpumpe gefördert und zugeführt werden, da es diese Pumpen in Ausführungen mit z. B. bis zu 48 Kanälen und für sehr kleine Fördermengen gibt. Die Spüllösungen lassen sich hiermit sehr gleichmäßig fördern. Die Fördermengen sind innerhalb gewisser Bereiche variabel steuerbar. Da der Volumenfluss der Spüllösungen zu allen Zeitpunkten bekannt ist, können auf diese Weise konstante Versuchsbedingungen gewährleistet werden.

Die aus dem Spalt wieder austretende Lösung kann zur Analyse gesammelt werden. Bei gleichzeitigem Betreiben mehrerer Spalten können die Lösungen getrennt gesammelt werden. Der Ablauf für die Spüllösung kann auch wie der Spülkanalzulauf als Röhrchen für den Anschluss eines Schlauches gestaltet werden.

Claims (7)

1. Eine Vorrichtung zur kontrollierten Überspülung von Proben mit Flüssigkeiten dergestalt, dass über den zu überspülenden Proben ein Spülkanal mit definierter Breite, Höhe und Länge so angebracht ist, daß die Proben mit einer laminaren Strömung mit definierbarem Fluss und mit definierbarer Geschwindigkeit überströmt werden können.

2. Eine Vorrichtung zur kontrollierten Überspülung von Proben mit Flüssigkeiten dergestalt, dass durch Zufuhr geeigneter Nährmedien im Spalt bakterielle Plaque oder andere Biofilme erzeugt werden.

3. Eine Vorrichtung nach Anspruch 1 dergestalt, dass durch die Wahl der Parameter Höhe, Breite und Länge sowie Flussgeschwindigkeit und Temperatur exakte Versuchsbedingungen gewährleistet werden.

4. Eine Vorrichtung nach Anspruch 1 dergestalt, dass durch die Wahl entsprechender Spalthöhen ein laminarer Transport der Spüllösungen über die Proben gewährleistet wird.

5. Eine Vorrichtung zur kontrollierten Überspülung von Proben mit Flüssigkeiten dergestalt, dass durch die Wahl entsprechender Beschaffenheit der den Spalt bildenden Oberflächen auch turbulente Strömungen erzeugt werden.

6. Eine Vorrichtung nach Anspruch 1 dergestalt, dass durch die Wahl entsprechender Spalthöhen bei kleinen Höhen ein kapillärer Transport der Spüllösungen über die Proben gewährleistet wird.

7. Eine Vorrichtung nach Anspruch 1 dergestalt, dass die Vorrichtung so beschaffen ist, daß mehrere Einheiten zusammengeschlossen werden können, um einen gleichzeitigen Betrieb zur Untersuchung mehrerer Proben unter gleichen Bedingungen zu gewährleisten.