EP4392545A1 - Vorrichtung und verfahren zur erzeugung von organoiden sowie zellkultur - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Organoiden, welche jeweils ein biologisches Organ in einem Organentwicklungszustand nachbilden. Es wird ein Substrat (01) bereitgestellt, welches eine Vielzahl an Kavitäten (02) aufweist, die in ihrer Größe und Form jeweils zur Aufnahme des nachzubildenden Organes in dem zu erzielenden Organentwicklungszustand ausgebildet sind. Die Kavitäten (02) weisen jeweils die Form einer Mulde auf. Die Mulden besitzen jeweils eine Länge und eine Breite, wobei die Länge größer als die Breite ist. Es werden Mikrofilamente (03) bereitgestellt, welche jeweils eine Länge aufweisen, die größer als die Breite der Mulden und kleiner als die Länge der Mulden ist. Die einzelnen Mikrofilamente (03) werden in den Kavitäten (02) angeordnet. Zudem werden lebende kultivierbare Zellen in den Kavitäten (02) angeordnet. Es werden Bedingungen in den Kavitäten (02) zur Kultivierung der Zellen an den einzelnen Mikrofilamenten (03) gewährt. Im Weiteren betrifft die Erfindung eine Zellkultur sowie eine Vorrichtung zum Herstellen einer Anordnung zur Erzeugung von Organoiden.

Description

0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 1 - Vorrichtung und Verfahren zur Erzeugung von Organoiden sowie Zellkultur Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst ein Verfahren zur Erzeugung von Organoiden, welche jeweils ein biologisches Organ in einem zu erzielenden Organentwicklungszustand nachbilden. Im Weiteren betrifft die Erfindung eine Zellkultur zur Erzeugung einer Vielzahl an Organoiden sowie eine Vorrichtung zum Herstellen einer Anordnung zur Erzeugung von Organoiden. Bei Organoiden handelt es sich um im Labor gezüchtete Zellgruppen, die vorzugsweise auf der Basis von Stammzellen organartige Strukturen ausbilden. Hierbei müssen bestimmte Bedingungen eingehalten werden, wie beispielsweise ein Kontakt zu Nachbarzellen, eine Konzentration von Zelldifferenzierungsfaktoren und eine Vorlage von extrazellulären Matrixproteinen. In dem Artikel von Sato, T. et. al.: „Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche“ in Nature 459, Seiten 262—265, 10.1038/nature07935, 2009, wird die Erzeugung von dreidimensionalen Organoiden beschrieben, welche in Matrigel eingebettet sind. In dem Artikel von Lancaster, M. und Knoblich, J. A.: „Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells“ in Nature protocols, 9(10), Seiten 2329 bis 2340, 10.1007/978-1-4939-7024-7_8, 2014, wird die Erzeugung von cerebralen, ektodermalen Organoiden beschrieben. Der Artikel von Lancaster, M., Corsini, N., Wolfinger, S. et al.: „Guided self-organization and cortical plate formation in © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 2 - human brain organoids“ in Nat Biotechnol 35, Seiten 659–666 10.1038/nbt.3906, 2017, zeigt ein Protokoll, gemäß welchem die Bildung eines Neuroektoderms und die Differenzierung in neuronaler Richtung durch die Verwendung von flotierenden Mikrofilamenten, welche als Scaffolds dienen, verbessert werden kann. Die DE 102017 217 738 B3 betrifft die Kultivierung von biologischen Zellen und Geweben mit organähnlicher Funktion in einem mikrophysiologischen Maßstab. Hierzu dient ein Verfahren zur mikrophysiologischen Co-Kultivierung von 3D-Organoid- Gewebe und mindestens einer 2D-Zellschicht. Die WO 2017/121754 A1 zeigt ein Verfahren zur Erzeugung einer länglichen oder fasergestützten multizellulären Ansammlung von multipotenten Zellen. Multipotente Zellen in einer länglichen oder länglichen Anordnung sollen mit einem Seitenverhältnis von mindestens 2:1 angeordnet werden. Die Ansammlung soll Zellen in unterschiedlichen Differenzierungsstadien und polare Zellen enthalten. Gemäß diesem Verfahren werden nicht poröse bioabbaubare Mikrofilamente eingesetzt, die als Unterstützung bzw. zur Polarisationsorientierung von pluripotenten Zellen dienen. Diese Zellhaufen werden dann in Matrigeltropfen umgesetzt, um in Mikrotiterwells freiflotierend vorzugsweise unter Schüttelkultur inkubiert zu werden. Nachteilig an dieser Lösung sind die geringe Ausbeute und die Größe der so erzeugten vorzugsweise cerebralen Embryoid-Bodies, deren Ausbildung und Größenverteilung statistisch verteilt ist. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht ausgehend vom Stand der Technik darin, Organoide erzeugen zu können, welche jeweils ein biologisches Organ in einem zu erzielenden Organentwicklungszustand nachbilden. So soll es beispielsweise für die Stammzellforschung möglich sein, geometrisch gleich © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 3 - große Organoide mit gleichen Eigenschaften reproduzierbar herstellen zu können. Die genannte Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß dem beigefügten Anspruch 1 sowie durch eine Zellkultur gemäß dem beigefügten nebengeordneten Anspruch 13 und durch eine Vorrichtung gemäß dem beigefügten nebengeordneten Anspruch 14. Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Erzeugung von Organoiden, welche jeweils ein biologisches Organ in einem Organentwicklungszustand nachbilden. Bei dem nachzubildenden biologischen Organ handelt es sich insbesondere um ein tierisches oder menschliches Organ, wie beispielsweise eine Leber, ein Magen, ein Gehirn oder eine Niere. Die zu erzeugenden Organoide bilden das Organ noch nicht vollständig nach, sondern sie stellen jeweils eine organähnliche Substruktur dar, welche einen Organentwicklungszustand des Organes nachbildet, wie beispielsweis ein Neuroektoderm. Der zu erzielende Organentwicklungszustand ist insbesondere durch einen Status der Ausdifferenzierung von biologischen Zellen des Organoids sowie durch eine Form und Größe des Organoids gekennzeichnet. Das Verfahren dient insbesondere dazu, eine große Anzahl möglichst gleicher Organoide gleichzeitig zu erzeugen. Diese Anzahl beträgt bevorzugt mindestens 20 und weiter bevorzugt mindestens 50. In einem Schritt des Verfahrens wird ein Substrat bereitgestellt, welches eine Vielzahl an Kavitäten aufweist, sodass es einen Formkörper darstellt. Das Substrat dient als Bioreaktor für die Erzeugung der Organoide, sodass es für eine Kultivierung von Zellen geeignet ist. Das Substrat besteht bevorzugt aus einem biokompatiblen Material. Das Substrat besteht bevorzugt aus Polycarbonat oder aus Polylactid-co- Glycolid (PLGA). In den Kavitäten wird jeweils eines der © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 4 - Organoide erzeugt, sodass die Kultivierung der Zellen in den einzelnen Kavitäten erfolgt. Die Kavitäten sind in ihrer Größe und Form jeweils zur Aufnahme des nachzubildenden biologischen Organes in dem zu erzielenden Organentwicklungszustand ausgebildet. Somit werden die Größe und die Form der Kavitäten entsprechend der Form und Größe der Organoide, welche jeweils das biologische Organ in dem zu erzielenden Organentwicklungszustand nachbilden, gewählt. Somit bestimmen die Kavitäten die Größe und Form der zu erzeugenden Organoide. Entsprechend ist zur Ausführung des Verfahrens zu entscheiden bzw. zu ermitteln, welche Form und Größe das Organ in dem zu erzielenden Organentwicklungszustand aufweist, sodass die nachbildenden Organoide im Ergebnis des Verfahrens aufgrund der Formgebung durch die Kavitäten weitestgehend jeweils die gleiche Form und Größe aufweisen werden. Die Anzahl der Kavitäten in dem Substrat beträgt bevorzugt mindestens 20 und weiter bevorzugt mindestens 50. Die Kavitäten weisen jeweils die Form einer Mulde auf, die im Substrat ausgeformt ist. Die Mulden besitzen jeweils eine Länge und eine Breite. Die Länge und die Breite liegen insbesondere in einer horizontalen Ebene, welche eine Haupterstreckungsebene des Substrates bildet. Die Mulden sind in die vertikale Tiefe ausgeformt. Die Länge und die Breite werden insbesondere in einer obersten horizontalen Ebene gemessen, wo die Mulden bevorzugt ihre größte Ausdehnung in horizontaler Richtung aufweisen. Die Länge und die Breite sind bevorzugt senkrecht zueinander ausgerichtet. Die Länge der einzelnen Mulden ist größer als deren Breite. Somit weisen die Mulden bezogen auf die horizontale Ebene jeweils eine längliche Form auf. Die längliche Form definiert eine Richtung der Mulden, wodurch für das Kultivieren von Zellen eine Polarität vorgegeben wird. Die Länge ist nicht nur vernachlässigbar größer als die Breite. Die Tiefe der Mulden © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 5 - ist bevorzugt jeweils höchstens so groß wie deren Breite. Die Tiefe der Mulden ist bevorzugt jeweils so groß wie deren Breite. In einem weiteren Schritt werden Mikrofilamente bereitgestellt. Die Mikrofilamente bestehen bevorzugt aus einem synthetischen Material. Die Mikrofilamente bestehen bevorzugt aus einem biokompatiblen Material. Die Mikrofilamente bestehen bevorzugt aus einem selbstauflösenden Material; insbesondere aus einem Nahtmaterial, wie es in der Chirurgie für den Verschluss von Wunden verwendet wird. Die Mikrofilamente weisen bevorzugt jeweils eine Stäbchenform bzw. die Form eines Zylinders auf. Die Mikrofilamente weisen bevorzugt jeweils die Form eines geraden Fadenabschnittes auf. Die Mikrofilamente sind bevorzugt durch einen Abschnitt einer Mikrofaser gebildet. Die Mikrofilamente weisen jeweils eine Länge auf. Die Länge der einzelnen Mikrofilamente ist bevorzugt mehr als doppelt so groß wie ein Durchmesser der einzelnen Mikrofilamente. Jedenfalls ist die Länge der einzelnen Mikrofilamente größer als die Breite der Mulden. Zudem ist die Länge der einzelnen Mikrofilamente kleiner als die Länge der Mulden. Diese Dimensionierung der Mikrofilamente soll später für eine Ausrichtung der Mikrofilamente in den Mulden sorgen. In einem weiteren Schritt werden die einzelnen Mikrofilamente in den Kavitäten des Substrates angeordnet. Im Regelfall soll jeweils genau eines der Mikrofilamente in jeder der Kavitäten angeordnet werden. Bevorzugt gilt für eine Mehrheit der Kavitäten, dass darin jeweils eines der Mikrofilamente angeordnet wird. Bevorzugt gilt für eine Mehrheit der Kavitäten, dass darin jeweils höchstens eines der Mikrofilamente angeordnet wird. Aufgrund der Dimensionierung der Mikrofilamente und der durch die Mulden gebildeten © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 6 - Kavitäten werden sich die Mikrofilamente in den Mulden jeweils so ausrichten, dass sich eine mittlere Achse der Mikrofilamente jeweils weitestehend parallel zu einer Geraden ausrichtet, auf welcher die Länge der jeweiligen Mulde bestimmt ist. Die Mikrofilamente und die Mulden zeigen somit in den einzelnen Mulden in dieselbe Richtung. Die mittleren Achsen der Mikrofilamente liegen bevorzugt jeweils in einer horizontalen Ebene. In einem weiteren Schritt werden lebende kultivierbare Zellen in den Kavitäten des Substrates angeordnet. Diese Zellen sind dazu geeignet, um kultiviert zu werden und zu dem Organoiden auszudifferenzieren. Bei den Zellen handelt es sich insbesondere um Gewebezellen, um Vorläuferzellen, um neuronale Stammzellen, um embryonale Stammzellen, um embryonale Krebszellen und/oder um pluripotente Stammzellen. Besonders bevorzugt handelt es sich um embryonale Stammzellen und/oder um pluripotente Stammzellen. Die in die Kavitäten einzubringenden Zellen umfassen Zellen von mindestens einer Zellart, wobei auch Zellen von mehreren Zellarten möglich sind. In die Kavitäten sind jeweils so viele der Zellen einzubringen, dass diese zu dem erzielenden Organoid kultivierbar sind. In einem weiteren Schritt werden Bedingungen in den Kavitäten gewährt, welche zur Kultivierung der Zellen an den einzelnen Mikrofilamenten in den Kavitäten geeignet sind. Diese Bedingungen umfassen bevorzugt ein Nährmedium, einen Wassergehalt, eine Temperatur, einen Druck und/oder eine elektromagnetische Bestrahlung. Durch die gewährten Bedingungen pflanzen sich die Zellen in den Kavitäten fort und differenzieren aus. Im Ergebnis entsteht in den einzelnen Kavitäten jeweils ein Organoid, dessen Form und Größe durch die Form und Größe der die Kavität bildenden Mulde bestimmt © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 7 - wurde, wobei das dort befindliche Mikrofilament als eine Struktur zur Unterstützung der Polarisierung der Zellen diente. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass es die Produktion einer Vielzahl an gleichen Organoiden im Rahmen einer Organoidfabrik erlaubt. Die Organoiden können reproduzierbar mit einer gleichen Größe und mit gleichen Eigenschaften produziert werden. Das Verfahren erlaubt die Generierung von großen Mengen gleicher Organoide für den Einsatz in den Gebieten der Therapieentwicklung, der Pharmaforschung und der Stammzellforschung. Das Verfahren ermöglicht eine massenhafte Erzeugung von Organoiden für einen industriellen Einsatz. Der für die Kultivierung notwendige bzw. gewünschte Zelldifferenzierungszustand und die Polarität bzw. die Polarisationsorientierung können vorgegeben werden, um möglichst gleiche Organoide mit gleichen geometrischen Maßen zu induzieren. Das bereitzustellende Substrat weist bevorzugt die Form einer Platte auf, welche dazu ausgebildet ist, in einer horizontalen Ebene angeordnet zu werden. Die Kavitäten sind verteilt in der horizontalen Ebene angeordnet. Die Kavitäten ragen vertikal in die Tiefe. Das bereitzustellende Substrat weist bevorzugt eine ebene Oberseite auf, von welcher aus die Kavitäten in die Tiefe ragen. Das Substrat ist besonders bevorzugt durch eine Folie gebildet, in welche die Kavitäten nach unten eingeformt sind. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das insbesondere durch die Folie gebildete Substrat zumindest in den Kavitäten porös ausgebildet, sodass es dort für Gase und Wasser, insbesondere auch für Fluide wie ein Zellkulturmedium durchlässig ist. Hierfür wird die Folie bevorzugt ionenbestrahlt und danach geätzt. Die Poren weisen jeweils © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 8 - einen Durchmesser auf, welcher bevorzugt höchstens 10 µm und weiter bevorzugt höchstens 5 µm groß ist. Der Durchmesser der Poren ist bevorzugt mindestens 0,5 µm und weiter bevorzugt mindestens 1 µm groß. Die Folie weist eine Dicke auf, welche bevorzugt zwischen 10 µm und 500 µm und weiter bevorzugt zwischen 50 µm und 100 µm beträgt. Das insbesondere durch die Folie gebildete Substrat weist in der horizontalen Ebene Ausmaße auf, die bevorzugt zwischen 0,5 cm und 15 cm und weiter bevorzugt zwischen 5 cm und 10 cm betragen. Das insbesondere durch die Folie gebildete Substrat weist in der horizontalen Ebene bevorzugt die Form eines Rechteckes oder weiter bevorzugt die Form eines Kreises auf. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist zumindest ein überwiegender Anteil der Kavitäten gleich ausgebildet. Ebenso ist bevorzugt ein überwiegender Anteil der Mikrofilamente gleich ausgebildet. Bevorzugt sind sämtliche der Kavitäten gleich ausgebildet. Bevorzugt sind sämtliche der Mikrofilamente gleich ausgebildet. Die hier angeführten Gleichheiten schließen Fertigungstoleranzen ein. Das Verfahren eignet sich zum massenhaften Erzeugen gleicher Organoide. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Länge der Mulden jeweils mindestens 1,1-mal so groß wie deren Breite. Bei weiter bevorzugten Ausführungsformen ist die Länge der Mulden jeweils mindestens anderthalbmal so groß wie deren Breite. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist die Länge der Mulden jeweils mindestens doppelt so groß wie deren Breite. Bevorzugt ist die Länge der Mulden jeweils höchstens fünfmal so groß wie deren Breite. Die Länge der Mulden beträgt bevorzugt jeweils zwischen 0,1 mm und 10 mm. Die Länge der Mulden beträgt weiter bevorzugt jeweils zwischen 0,2 mm und 1,5 mm. © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 9 - Die Breite der Mulden beträgt bevorzugt jeweils zwischen 0,05 mm und 8 mm. Die Breite der Mulden beträgt weiter bevorzugt jeweils zwischen 0,1 mm und 0,7 mm. Die Tiefe der Mulden beträgt bevorzugt jeweils zwischen 0,05 mm und 3 mm. Die Tiefe der Mulden beträgt weiter bevorzugt jeweils zwischen 0,1 mm und 0,7 mm. Die Mulden weisen bezogen auf die horizontale Ebene bevorzugt eine ovale Form oder die Form einer Ellipse oder die Form eines Rechteckes mit abgerundeten Ecken oder eine Nierenform auf. Die Mulden weisen jeweils einen Boden auf, welcher im Wesentlichen eben ausgeführt sein kann. Die Form der Mulden in der Tiefe kann aber auch eine Fortsetzung der Form in der horizontalen Ebene sein. So können die Mulden jeweils die hohle Form eines halben Ellipsoids aufweisen. Die durch die Mulden gebildeten Kavitäten sind bevorzugt gleichverteilt in der horizontalen Ebene des Substrates angeordnet. Die durch die Mulden gebildeten Kavitäten sind bevorzugt spiralförmig verteilt in der horizontalen Ebene des Substrates angeordnet, welches in der horizontalen Ebene bevorzugt die Form eines Kreises aufweist. Die Mikrofilamente weisen bevorzugt jeweils eine hydrophobe Oberfläche auf. Die Mikrofilamente bestehen bevorzugt aus einem selbstauflösenden Nahtmaterial. Die Mikrofilamente bestehen bevorzugt aus einem selbstauflösenden Nahtmaterial, welches durch ein Copolymer aus Glykolid und Lactid gebildet ist. Die Mikrofilamente bestehen bevorzugt aus einem Polylactid-co-Glycolid (PLGA). Die Mikrofilamente bestehen bevorzugt aus gesponnenen Fasern, wobei bevorzugt Zwischenräume zwischen den Fasern verbleiben. Bei bevorzugten © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 10 - Ausführungsformen sind die Mikrofilamente porös ausgebildet, sodass Gase und Wasser hindurchströmen können. Die Poren weisen jeweils einen Durchmesser auf, welcher bevorzugt höchstens 5 µm und weiter bevorzugt höchstens 3 µm groß ist. Der Durchmesser der Poren ist bevorzugt mindestens 0,2 µm und weiter bevorzugt mindestens 0,6 µm groß. Die Poren sind bevorzugt in Längsrichtung und/oder in Querrichtung der Mikrofilamente ausgebildet. Die Länge der Mikrofilamente beträgt bevorzugt jeweils zwischen 0,05 mm und 10 mm. Die Länge der Mikrofilamente beträgt weiter bevorzugt jeweils zwischen 0,2 mm und 1,5 mm. Der Durchmesser der Mikrofilamente beträgt bevorzugt jeweils zwischen 0,5 µm und 200 µm. Der Durchmesser der Mikrofilamente beträgt weiter bevorzugt jeweils zwischen 2 µm und 20 µm. Vor dem Anordnen der einzelnen Mikrofilamente in den Kavitäten werden die Mikrofilamente bevorzugt entgast, wozu diese bevorzugt in Ethanol gelegt werden und danach mit destilliertem Wasser gewaschen werden. Anschließend werden die Mikrofilamente getrocknet. Das Anordnen der einzelnen Mikrofilamente in den Kavitäten erfolgt bevorzugt dadurch, dass die Mikrofilamente in einer Transportflüssigkeit angeordnet und mit dieser in die Kavitäten gespült werden. Die Transportflüssigkeit ist bevorzugt durch destilliertes Wasser gebildet. Die die Mikrofilamente enthaltende Transportflüssigkeit wird bevorzugt mit einer Pumpe in die Kavitäten gespült. Die Pumpe ist bevorzugt durch eine Peristaltikpumpe gebildet. Bevorzugt wird die die Mikrofilamente enthaltende Transportflüssigkeit in einem das Substrat und die Pumpe umfassenden Kreislauf gefördert. Bevorzugt wird die Transportflüssigkeit durch die © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 11 - Poren in den Kavitäten im Substrat gepumpt, sodass die einzelnen Mikrofilamente in die Kavitäten gelangen und wegen ihrer Größe dort verbleiben, während die Transportflüssigkeit durch die Poren des Substrates gelangt. Die die Mikrofilamente enthaltende Transportflüssigkeit wird von oben auf das Substrat gespült. Dabei verteilt sich die die Mikrofilamente enthaltende Transportflüssigkeit über die Kavitäten, sodass auch die Mikrofilamente gleichmäßig über die Kavitäten verteilt werden, wodurch zumindest in fast alle der Kavitäten jeweils eines der Mikrofilamente gelangt. Das Fördern der die Mikrofilamente enthaltenden Transportflüssigkeit erfolgt mit einer geringen Flussrate, welche bevorzugt zwischen 1 µl/min und 100 µl/min beträgt. Das Fördern der die Mikrofilamente enthaltenden Transportflüssigkeit erfolgt für eine Zeitdauer, welche bevorzugt zwischen 10 min und 100 min beträgt. Danach erfolgt bevorzugt ein Abpumpen der übrigen Transportflüssigkeit und ein Trocknen des Substrates mit den dort befindlichen Mikrofilamenten. Bevorzugt gilt für mindestens die Hälfte der Kavitäten, dass darin jeweils eines der Mikrofilamente angeordnet wird. Bevorzugt gilt für mindestens die Hälfte der Kavitäten, dass darin jeweils höchstens eines der Mikrofilamente angeordnet wird. Bevorzugt gilt für mindestens 90 % der Kavitäten, dass darin jeweils eines der Mikrofilamente angeordnet wird. Bevorzugt gilt für mindestens 90 % der Kavitäten, dass darin jeweils höchstens eines der Mikrofilamente angeordnet wird. Das Anordnen der lebenden kultivierbaren Zellen in den Kavitäten des Substrates erfolgt bevorzugt, nachdem die einzelnen Mikrofilamente in den Kavitäten des Substrates angeordnet wurden. © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 12 - Vor dem Anordnen der lebenden kultivierbaren Zellen in den Kavitäten des Substrates werden die Zellen bevorzugt in ein Medium gegeben. Bei dem Medium handelt es sich bevorzugt um ein Nährmedium. Das die Zellen enthaltende Medium wird bevorzugt tropfenweise in die Kavitäten eingefüllt, wobei die Tropfen ein Volumen aufweisen, welches bevorzugt weniger als 100 µl beträgt. Die in den Kavitäten anzuordnenden Zellen können einzeln oder in Form von Agglomeraten vorliegen. Die Anzahl der in den einzelnen Kavitäten anzuordnenden Zellen beträgt bevorzugt jeweils mindestens 1.000 und weiter bevorzugt mindestens 10.000. Nachdem die Zellen in den Kavitäten angeordnet wurden, vermehren sich die Zellen und differenzieren aus, da die hierfür notwendigen Bedingungen gewährt werden. Hierbei bildet sich jeweils ein Organoid in den einzelnen Kavitäten. Die Bildung der Organoide wird durch das in der jeweiligen Kavität angeordnete Mikrofilament wesentlich beeinflusst, da sich die vermehrenden Zellen an dem Mikrofilament ansiedeln, sodass das Mikrofilament eine Orientierung und/oder eine Polarität bzw. eine Polarisationsorientierung vorgibt. Auch gewährleisten die gleich ausgeführten Mikrofilamente in Kombination mit den gleich ausgeführten Kavitäten, dass die Organoide gleich ausgebildet werden und sich im Ergebnis weitestgehend gleichen. Die Bedingungen zur Kultivierung der Zellen in den Kavitäten werden für eine Zeitdauer so lang gewährt, bis die Organoide den zu erzielenden Organentwicklungszustand erreicht haben. Diese Zeitdauer beträgt bevorzugt mindestens 1 Tag und bevorzugt höchstens 30 Tage. © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 13 - Bei bevorzugten Ausführungsformen wird zum Gewähren der Bedingungen zur Kultivierung der Zellen das Substrat mit den darin befindlichen Mikrofilamenten und Zellen in einem Bioreaktor angeordnet, um die Zellen fluidisch zu versorgen. Bevorzugt erfolgt eine mehrkanalige fluidische Versorgung der in den Kavitäten befindlichen Zellen. Bevorzugt werden weitere formgebende und/oder unterstützende Strukturen in den Kavitäten angeordnet, um die Bildung der Organoide zu steuern. Bevorzugt werden auch mechanische, taktile, magnetische und/oder elektrische Reize auf die in den Kavitäten befindlichen Zellen gegeben, um die Bildung der Organoide zu steuern. Bei bevorzugten Ausführungsformen werden die Organoide, nachdem sie den zu erzielenden Organentwicklungszustand erreicht haben, aus den Kavitäten des Substrates entnommen, was bevorzugt durch ein Ausspülen erfolgt. Bei bevorzugten Ausführungsformen werden die einzelnen Organoide jeweils in einer Ausformung aus einer basalmembranartigen Matrix angeordnet. Eine Form der basalmembranartigen Matrix ist unter dem Markennamen Matrigel bekannt. Die Ausformungen sind bevorzugt jeweils durch einen Tropfen gebildet. In den basalmembranartigen Matrices erfolgt eine weitere Kultivierung der Organoide. Alternativ oder ergänzend werden die entnommenen Organoide bevorzugt in einer einkanaligen oder mehrkanaligen Bioreaktoranordnung, in einem Insertsystem oder in anderen Kavitäten, wie beispielsweise in einer Mikrotiterplatte angeordnet. Schritte des Verfahrens, insbesondere das Anordnen der einzelnen Mikrofilamente und/oder der lebenden kultivierbaren Zellen in den Kavitäten, erfolgen bevorzugt automatisiert mit einem Roboter. Auch beim Gewähren von Bedingungen zur © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 14 - Kultivierung der Zellen erfolgt bevorzugt eine Unterstützung durch den Roboter. Bei anderen Ausführungsformen werden keine Mikrofilamente verwendet. Somit werden keine Mikrofilamente bereitgestellt und auch keine Mikrofilamente in den Kavitäten angeordnet. Stattdessen erfolgt ein Verkleben der in jeweils einer der Kavitäten eingebrachten Zellen mit einer die Zellen verklebenden Substanz. Die die Zellen verklebende Substanz ist geeignet, die Zellen durch Adhäsionskräfte mechanisch miteinander zu verbinden, wodurch ihre Positionen zueinander und zum Substrat fixiert werden. Mit dem Verkleben wird das gleiche Ziel wie mit den oben beschriebenen Mikrofilamenten verfolgt; nämlich die Orientierung und Unterstützung der Polarisation der Zellen. Die die Zellen verklebende Substanz ist bevorzugt durch ein Hydrogel gebildet, bei welchem es sich bevorzugt um ein vernetztes Polymerhydrogel handelt. Die die Zellen verklebende Substanz ist bevorzugt durch ein Zweikomponentenhydrogel gebildet. Dabei stellt ein erster Präkursor eine erste Komponente des Zweikomponentenhydrogels dar, während ein zweiter Präkursor eine zweite Komponente des Zweikomponentenhydrogels darstellt. Der erste Präkursor und der zweite Präkursor liegen bevorzugt jeweils in Form einer Lösung vor. Der erste Präkursor und der zweite Präkursor werden nacheinander oder gleichzeitig an den Zellen angeordnet, um die Zellen zu verkleben. Das Anordnen der die Zellen verklebenden Substanz bzw. deren Präkursoren an den Zellen erfolgt bevorzugt mit einem örtlich dosierenden Ausgabesystem, wie einem in den x-y-Richtungen verfahrbaren Dispenser- oder Pipettiersystem oder bevorzugt einem in den x-y-z-Richtungen verfahrbaren Dispenser- oder Pipettiersystem. Während dieses Vorganges befinden sich die Zellen in den Kavitäten, wobei bevorzugt auch ein Medium, insbesondere ein Nährmedium in den Kavitäten angeordnet ist, sodass sich die © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 15 - Zellen in dem Medium in den Kavitäten befinden, während sie verklebt werden. Im Übrigen wird das Verfahren bevorzugt gemäß der obigen Beschreibung ausgeführt. Bei anderen Ausführungsformen werden ebenfalls keine Mikrofilamente verwendet. Somit werden keine Mikrofilamente bereitgestellt und auch keine Mikrofilamente in den Kavitäten angeordnet. Stattdessen erfolgt ein Verkleben der Zellen mit einer die Zellen verklebenden Substanz, bevor diese in den Kavitäten angeordnet werden. Es wird somit jeweils vorab ein Agglomerat der Zellen außerhalb der Kavitäten erzeugt, sodass die Zellen anschließend als Agglomerate in den Kavitäten angeordnet werden. Das Verkleben der Zellen erfolgt bevorzugt in einem Gefäß. Die die Zellen verklebende Substanz ist geeignet, die Zellen durch Adhäsionskräfte mechanisch miteinander zu verbinden, wodurch ihre Positionen zueinander fixiert werden. Mit dem Verkleben wird das gleiche Ziel wie mit den oben beschriebenen Mikrofilamenten verfolgt; nämlich die Orientierung und Unterstützung der Polarisation der Zellen. Die die Zellen verklebende Substanz ist bevorzugt durch ein Hydrogel gebildet, bei welchem es sich bevorzugt um ein vernetztes Polymerhydrogel handelt. Die die Zellen verklebende Substanz ist bevorzugt durch ein Zweikomponentenhydrogel gebildet. Dabei stellt ein erster Präkursor eine erste Komponente des Zweikomponentenhydrogels dar, während ein zweiter Präkursor eine zweite Komponente des Zweikomponentenhydrogels darstellt. Der erste Präkursor und der zweite Präkursor liegen bevorzugt jeweils in Form einer Lösung vor. Der erste Präkursor und der zweite Präkursor werden nacheinander oder gleichzeitig an den Zellen angeordnet, um die Zellen zu verkleben. Das Anordnen der die Zellen verklebenden Substanz bzw. deren Präkursoren an den Zellen erfolgt bevorzugt mit einem örtlich dosierenden Ausgabesystem, wie einem in den x-y-Richtungen verfahrbaren © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 16 - Dispenser- oder Pipettiersystem oder bevorzugt einem in den x-y-z-Richtungen verfahrbaren Dispenser- oder Pipettiersystem. Im Übrigen wird das Verfahren bevorzugt gemäß der obigen Beschreibung ausgeführt. Die erfindungsgemäße Zellkultur dient zur Erzeugung einer Vielzahl an Organoiden, welche jeweils ein biologisches Organ in einem Organentwicklungszustand nachbilden. Die Zellkultur umfasst ein Substrat, welches eine Vielzahl an Kavitäten aufweist. Die Kavitäten sind in ihrer Größe und Form jeweils zur Aufnahme des nachzubildenden biologischen Organes in dem zu erzielenden Organentwicklungszustand ausgebildet. Die Kavitäten weisen jeweils die Form einer Mulde auf. Die Mulden besitzen jeweils eine Länge und eine Breite. Die Länge ist größer als die Breite. In den einzelnen Kavitäten ist jeweils ein Mikrofilament angeordnet ist, welches eine Länge aufweist, die größer als die Breite der Mulden und kleiner als die Länge der Mulden ist. Kultivierbare Zellen sind an den Mikrofilamenten in den Kavitäten des Substrates angeordnet und vermehren sich dort und/oder differenzieren aus, um im Ergebnis die Organoide in dem zu erzielenden Organentwicklungszustand zu bilden. Die Zellkultur wurde bevorzugt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren oder einer der beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugt. Die Zellkultur weist bevorzugt auch Merkmale auf, die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren oder einer der beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens angegeben sind. Die erfindungsgemäße Vorrichtung dient zum Herstellen einer Anordnung zur Erzeugung von Organoiden. Die Organoide bilden jeweils ein biologisches Organ in einem Organentwicklungszustand nach. Die Vorrichtung umfasst © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 17 - zunächst mindestens ein Substrat, auf welchem die Organoide später erzeugt werden sollen. Das Substrat weist eine Vielzahl an Kavitäten auf, die in ihrer Größe und Form jeweils zur Aufnahme des nachzubildenden biologischen Organes in dem zu erzielenden Organentwicklungszustand ausgebildet sind. Die Kavitäten weisen jeweils die Form einer Mulde auf. Die Mulden besitzen jeweils eine Länge und eine Breite, wobei die Länge größer als die Breite ist. Die Vorrichtung umfasst weiterhin einen Speicher zur Bevorratung einer eine Vielzahl an Mikrofilamenten enthaltenden Transportflüssigkeit. Die Mikrofilamente weisen jeweils eine Länge auf, die größer als die Breite der Mulden und kleiner als die Länge der Mulden ist. Der Speicher ist bevorzugt durch einen Schlauchabschnitt oder durch ein Gefäß gebildet. Die Vorrichtung umfasst zudem eine Einspülvorrichtung, welche dazu dient, die die Mikrofilamente enthaltende Transportflüssigkeit in die Kavitäten des Substrates zu spülen, sodass jeweils eines der Mikrofilamente in möglichst jeder der Kavitäten verbleibt. Hierfür umfasst die Einspülvorrichtung eine Substrataufnahme zur Aufnahme des Substrates. Das Substrat kann dicht in die Substrataufnahme eingespannt werden. Die Einspülvorrichtung umfasst einen Zulauf für die die Mikrofilamente enthaltende Transportflüssigkeit, sodass die die Mikrofilamente enthaltende Transportflüssigkeit in die Einspülvorrichtung hineingeleitet werden kann. Der Zulauf mündet in ein Volumen über der Substrataufnahme. Dieses Volumen ist innerhalb der Einspülvorrichtung über der Substrataufnahme ausgebildet, sodass es sich über den Kavitäten des in der Substrataufnahme aufgenommenen Substrates befindet. Somit kann die die Mikrofilamente enthaltende Transportflüssigkeit durch den Zulauf in die Kavitäten fließen. Die Vorrichtung umfasst weiterhin eine Pumpe zum Fördern der die Mikrofilamente enthaltenden Transportflüssigkeit aus dem Speicher in den Zulauf der Einspülvorrichtung. Somit kann die die © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 18 - Mikrofilamente enthaltende Transportflüssigkeit aus dem Speicher durch den Zulauf der Einspülvorrichtung in die Kavitäten des in der Substrataufnahme befindlichen Substrates gefördert werden. Bei bevorzugten Ausführungsformen der Vorrichtung ist ein Kreislauf für die die Mikrofilamente enthaltende Transportflüssigkeit ausgebildet. Hierfür weist die Einspülvorrichtung ein Volumen unter der Substrataufnahme auf, welches in einen Ablauf der Einspülvorrichtung mündet. Der Ablauf ist bevorzugt über einen Schlauch mit dem Speicher oder der Pumpe verbunden. Der Speicher oder die Pumpe ist bevorzugt über einen Schlauch mit dem Zulauf der Einspülvorrichtung verbunden. Der Speicher und die Einspülvorrichtung sowie ggf. die Pumpe bilden den Kreislauf für die die Mikrofilamente enthaltende Transportflüssigkeit. Die die Mikrofilamente enthaltende Transportflüssigkeit fließt von dem in der Einspülvorrichtung über der Substrataufnahme befindlichen Volumen durch die Poren im Substrat in das in der Einspülvorrichtung unter der Substrataufnahme befindliche Volumen. Die Einspülvorrichtung ist bevorzugt als ein Block mit einem oberen Blockteil und mit einem unteren Blockteil ausgebildet, wobei die Substrataufnahme zwischen dem oberen Blockteil und dem unteren Blockteil ausgebildet ist. Die Blockteile sind über eine lösbare Verbindung fest miteinander verbunden. Zum Einsetzen des Substrates in die Substrataufnahme und zum Entnehmen des Substrates aus der Substrataufnahme ist die Verbindung der Blockteile zu lösen. Der Zulauf ist bevorzugt am oberen Blockteil angeordnet. Der Ablauf ist bevorzugt am unteren Blockteil angeordnet. Der obere Blockteil und/oder der untere Blockteil weisen bevorzugt eine Entlüftung auf. Die Einspülvorrichtung kann aber auch einen grundsätzlich anderen © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 19 - Aufbau aufweisen, solang der Zulauf unmittelbar oder mittelbar in das Volumen über der Substrataufnahme mündet, sodass die die Mikrofilamente enthaltende Transportflüssigkeit in die Kavitäten des in der Substrataufnahme befindlichen Substrates gelangt. Die Pumpe ist bevorzugt durch eine Peristaltikpumpe gebildet. Es können aber auch andere Pumpenarten verwendet werden. Die Vorrichtung umfasst bevorzugt auch die die Mikrofilamente enthaltende Transportflüssigkeit. Die Vorrichtung weist bevorzugt auch Merkmale auf, die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren oder einer der beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens angegeben sind. Weitere Einzelheiten und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung, unter Bezugnahme auf die Zeichnung. Es zeigen: Fig. 1: ein für eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens bereitzustellendes Substrat; Fig. 2: ein für eine erste bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitzustellendes Mikrofilament; Fig. 3: ein für eine zweite bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitzustellendes Mikrofilament; © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 20 - Fig. 4: ein für eine dritte bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitzustellendes Mikrofilament; Fig. 5: eine bevorzugte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung; Fig. 6: während des erfindungsgemäßen Verfahrens in ein Substrat eingebrachte Mikrofilamente; Fig. 7: eine bevorzugte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Zellkultur; und Fig. 8: durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugte Organoide. Fig. 1 zeigt ein für eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens bereitzustellendes Substrat 01. Das Substrat 01 ist durch eine geformte Folie aus Polycarbonat gebildet und weist eine Vielzahl an gleichen Kavitäten 02 in Form von Mulden auf. Die Kavitäten 02 weisen in der Haupterstreckungsebene des Substrates 01 einen ellipsenförmigen Querschnitt auf. Die durch die Mulden gebildeten Kavitäten 02 weisen in der Haupterstreckungsebene des Substrates 01 jeweils eine Länge l und eine Breite b auf. Die Länge l ist bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel etwa doppelt so groß wie die Breite b. Die Länge l kann beispielsweise 1 mm betragen, während die Breite 0,5 mm betragen kann. Das Substrat 01 weist zumindest in den Kavitäten 02 Poren (nicht dargestellt) auf, sodass eine Flüssigkeit von einer Oberseite des Substrates 01 zu einer Unterseite des Substrate 01 und umgekehrt gelangen kann. Die © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 21 - Poren weisen jeweils einen Durchmesser auf, welcher beispielsweise 4 µm beträgt. Fig. 2 zeigt ein für eine erste bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitzustellendes Mikrofilament 03. Es ist eine Vielzahl der gleichen Mikrofilamente 03 bereitzustellen, um diese in den Kavitäten 02 (gezeigt in Fig. 1) des Substrates 01 (gezeigt in Fig. 1) anzuordnen. Die Mikrofilamente 03 können beispielsweise dadurch bereitgestellt werden, dass gesponnene Fasern zugeschnitten werden. Die Mikrofilamente 03 weisen jeweils eine Länge auf, die größer als die Breite b der Kavitäten 02 (gezeigt in Fig. 1) und kleiner als die Länge l der Kavitäten 02 (gezeigt in Fig. 1) ist. Die Länge der Mikrofilamente 03 beträgt beispielsweise 0,8 mm. Die Mikrofilamente 03 weisen einen Durchmesser auf, welcher beispielsweise 10 µm beträgt. Fig. 3 zeigt ein für eine zweite bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitzustellendes Mikrofilament 03. Bei dieser zweiten bevorzugten Ausführungsform weisen die Mikrofilamente 03 eine Vielzahl an Poren 04 in Längsrichtung auf. Fig. 4 zeigt ein für eine dritte bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitzustellendes Mikrofilament 03. Bei dieser dritten bevorzugten Ausführungsform weisen die Mikrofilamente 03 eine Vielzahl an Poren 04 in Querrichtung auf. Fig. 5 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Herstellen einer Anordnung zur Erzeugung von Organoiden 06 (gezeigt in Fig. 8), welche jeweils ein biologisches Organ (nicht gezeigt) in einem Organentwicklungszustand nachbilden. Die Vorrichtung umfasst © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 22 - zunächst eine blockförmige Einspülvorrichtung 07, die in einem geöffneten Zustand dargestellt ist, in welchem ein oberer Blockteil 08 der Einspülvorrichtung 07 von einem unteren Blockteil 09 der Einspülvorrichtung 07 abgehoben ist, sodass eine dazwischen befindliche Substrataufnahme 11 der Einspülvorrichtung 07 sichtbar ist, in welchem das Substrat 01 (im Detail gezeigt in Fig. 1) angeordnet ist. Die Einspülvorrichtung 07 weist weiterhin einen Zulauf 12 und einen Ablauf 13 auf. Die Substrataufnahme 11 mit dem Substrat 01 ist strömungstechnisch zwischen dem Zulauf 12 und dem Ablauf 13 angeordnet. Die Einspülvorrichtung 07 weist weiterhin zwei Entlüftungen 14 auf, welche in einem abgezogenen Zustand gezeigt sind. Die Vorrichtung umfasst weiterhin eine Peristaltikpumpe 16, welche auf einen Schlauchabschnitt 17 wirkt. Der Schlauchabschnitt 17 ist verbunden mit Schläuchen 18, die über Schlauchanschlüsse 19 mit dem Zulauf 12 und dem Ablauf 13 der Einspülvorrichtung 07 verbunden sind, sodass ein Kreislauf ausgebildet ist. Im Schlauchabschnitt 17 befindet sich eine Transportflüssigkeit (nicht dargestellt), welche eine Vielzahl der Mikrofilamente 03 (gezeigt in Fig. 2 bis Fig. 4) enthält. Die Peristaltikpumpe 16 bewirkt, dass diese die Mikrofilamente 03 (gezeigt in Fig. 2 bis Fig. 4) enthaltende Transportflüssigkeit (nicht dargestellt) durch die Schläuche 18 und die Einspülvorrichtung 07 gefördert wird, wodurch sie das Substrat 01 passiert und die einzelnen Mikrofilamente 03 (gezeigt in Fig. 2 bis Fig. 4) in die Kavitäten 02 (gezeigt in Fig. 1) gelangen, während die übrige Transportflüssigkeit (nicht dargestellt) durch die Poren (nicht dargestellt) des Substrates 01 fließt. © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 23 - Fig. 6 zeigt die während des erfindungsgemäßen Verfahrens in die Kavitäten 02 des Substrates 01 eingebrachten Mikrofilamente 03. Es ist zu erkennen, dass sich die Mikrofilamente 03 aufgrund der Dimensionierungen der Kavitäten 02 und der Mikrofilamente 03 in der Längsrichtung der Kavitäten 02 ausrichten. In den allermeisten der Kavitäten 02 befindet sich jeweils genau eines der Mikrofilamente 03. Die Mikrofilamente 03 wurden dadurch in die Kavitäten 02 des Substrates 01 eingebracht, dass das Substrat 01 mit der in Fig. 5 gezeigten Vorrichtung behandelt wurde. Für diese Behandlung wurden beispielhaft 160 der Mikrofilamente 03 verwendet. Die Transportflüssigkeit (nicht dargestellt) wurde mit der Peristaltikpumpe 16 (gezeigt in Fig. 5) mit einem Volumenstrom von beispielhaft 25 ml/min für eine Dauer von beispielhaft 30 min gefördert. Die Maßstabsleiste ist 100 µm lang. Fig. 7 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Zellkultur, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren entsteht und zunächst das bereits beschriebene Substrat 01 mit den in den Kavitäten 02 befindlichen Mikrofilamenten 03 umfasst. In einem nicht dargestellten weiteren Verfahrensschritt wurden beispielhaft etwa 50.000 Embryonalkarzinomzellen in jede der Kavitäten 02 des Substrates 01 eingebracht und es wurden Bedingungen in den Kavitäten 02 zur Kultivierung der Stammzellen an den einzelnen Mikrofilamenten 03 gewährt. Es ist zu erkennen, dass sich Zellagglomerate 21 an den Mikrofilamenten 03 bilden und dadurch eine Polarisation erhalten. Die Zellagglomerate 21 haben sich bei dem gezeigten Beispiel nach drei Tagen gebildet. Die Maßstabsleiste ist 100 µm lang. Auch ist zu erkennen, dass die Form der Zellagglomerate 21 durch die Form der Kavitäten 02 bestimmt wird. Die Zellagglomerate 21 werden © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 24 - nach einer fortgesetzten Kultivierung die zu erzeugenden Organoide 06 (gezeigt in Fig. 8) ausbilden. Fig. 8 zeigt die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugten Organoide 06, nachdem diese aus den Kavitäten 02 (gezeigt in Fig. 1) des Substrates 01 (gezeigt in Fig. 1) entnommen wurden. Es ist zu erkennen, dass sich die Organoide 06 aufgrund der gleichen Ausgangsbedingungen in den gleichen Kavitäten 02 (gezeigt in Fig. 1) mit den gleichen Mikrofilamenten 03 (gezeigt in Fig. 2 bis Fig. 4) weitestgehend gleichen. Bei den beispielhaft gezeigten Organoiden 06 handelt es sich um Neurosphären, welche für 11 Tage kultiviert wurden. Neurosphären sind Ansammlungen von neuronalen Stammzellen. © PATENTSCHUTZengel 0135/21#006-99 Technische Universität Ilmenau 20.06.2022 - 25 - Bezugszeichenliste 01 Substrat 02 Kavitäten 03 Mikrofilamente 04 Poren 05 - 06 Organoide 07 Einspülvorrichtung 08 oberer Blockteil 09 unterer Blockteil 10 – 11 Substrataufnahme 12 Zulauf 13 Ablauf 14 Entlüftung 15 – 16 Peristaltikpumpe 17 Schlauchabschnitt 18 Schläuche 19 Schlauchanschluss 20 – 21 Zellagglomerate © PATENTSCHUTZengel

Claims

Patentansprüche Verfahren zur Erzeugung von Organoiden (06) , welche jeweils ein biologisches Organ in einem Organentwicklungszustand nachbilden, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

- Bereitstellen eines Substrates (01) , welches eine Vielzahl an Kavitäten (02) aufweist, die in ihrer Größe und Form jeweils zur Aufnahme des nachzubildenden biologischen Organes in dem zu erzielenden Organentwicklungszustand ausgebildet sind, wobei die Kavitäten (02) jeweils die Form einer Mulde aufweisen, wobei die Mulden jeweils eine Länge und eine Breite besitzen, und wobei die Länge größer als die Breite ist;

- Bereitstellen von Mikrofilamenten (03) , welche jeweils eine Länge aufweisen, die größer als die Breite der Mulden und kleiner als die Länge der Mulden ist;

- Anordnen der einzelnen Mikrofilamente (03) in den Kavitäten (02) des Substrates (01) ;

- Anordnen von lebenden kultivierbaren Zellen in den Kavitäten (02) des Substrates (01) ; und

- Gewähren von Bedingungen in den Kavitäten (02) zur Kultivierung der Zellen an den einzelnen Mikrofilamenten (03) in den Kavitäten (02) . Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein überwiegender Anteil der Kavitäten (02) gleich ausgebildet ist, und dass zumindest ein überwiegender Anteil der Mikrofilamente (03) gleich ausgebildet ist. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das bereitzustellende Substrat (01) zumindest in den Kavitäten (02) porös ausgebildet ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge der Mulden jeweils mindestens anderthalbmal so groß wie deren Breite ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge der Mulden zwischen 0,2 mm und 1,5 mm beträgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mulden bezogen auf eine horizontale Ebene eine ovale Form, die Form einer Ellipse, die Form eines Rechteckes mit abgerundeten Ecken oder eine Nierenform aufweisen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrofilamente (03) porös ausgebildet sind.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrofilamente (03) aus Polylactid-co-Glycolid bestehen.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrofilamente (03) einen Durchmesser aufweisen, welcher zwischen 2 pm und 20 pm beträgt .

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Anordnen der einzelnen Mikrofilamente (03) in den Kavitäten (02) dadurch erfolgt, dass die Mikrofilamente (03) in einer Transport flüssigkeit angeordnet und mit dieser in die Kavitäten (02) gespült werden . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen durch Gewebezellen, Verlauf erzellen, neuronale Stammzellen, embryonale Stammzellen, embryonale Krebszellen und/oder pluripotente Stammzellen gebildet sind. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Organoide (06) , nachdem sie den zu erzielenden Organentwicklungszustand erreicht haben, aus den Kavitäten (02) des Substrates (01) entnommen und jeweils in einer Ausformung aus einer basalmembranartigen Matrix angeordnet werden. Zellkultur zur Erzeugung einer Vielzahl an Organoiden (06) , welche jeweils ein biologisches Organ in einem Organentwicklungszustand nachbilden; wobei die Zellkultur ein Substrat (01) umfasst, welches eine Vielzahl an Kavitäten (02) aufweist, die in ihrer Größe und Form jeweils zur Aufnahme des nachzubildenden biologischen Organes in dem zu erzielenden Organentwicklungszustand ausgebildet sind, wobei die Kavitäten (02) jeweils die Form einer Mulde aufweisen, wobei die Mulden jeweils eine Länge und eine Breite besitzen, wobei die Länge größer als die Breite ist, wobei in den einzelnen Kavitäten (02) jeweils ein Mikrofilament (03) angeordnet ist, welches eine Länge aufweist, die größer als die Breite der Mulden und kleiner als die Länge der Mulden ist; und wobei kultivierbare Zellen (21) an den Mikrofilamenten (03) in den Kavitäten (02) des Substrates (01) angeordnet sind. Vorrichtung zum Herstellen einer Anordnung zur Erzeugung von Organoiden (06) , welche jeweils ein biologisches Organ in einem Organentwicklungszustand nachbilden; wobei die Vorrichtung folgende Komponenten umfasst: - ein Substrat (01) , welches eine Vielzahl an Kavitäten (02) aufweist, die in ihrer Größe und Form jeweils zur

Aufnahme des nachzubildenden biologischen Organes in dem zu erzielenden Organentwicklungszustand ausgebildet sind, wobei die Kavitäten (02) jeweils die Form einer Mulde aufweisen, wobei die Mulden jeweils eine Länge und eine Breite besitzen, und wobei die Länge größer als die Breite ist;

- einen Speicher (17) zur Bevorratung einer eine Vielzahl an Mikrofilamenten (03) enthaltenden

Transportf lüssigkeit , wobei die Mikrofilamente (03) jeweils eine Länge aufweisen, die größer als die Breite der Mulden und kleiner als die Länge der Mulden ist;

- eine Einspülvorrichtung (07) mit einer Substrataufnahme (11) zur Aufnahme des Substrates (01) , wobei die Einspülvorrichtung (07) einen Zulauf (12) für die die Mikrofilamente (03) enthaltende Transport f lüssigkeit umfasst, welcher in ein Volumen über der

Subs tratauf nähme (11) mündet; und

- eine Pumpe (16) zum Fördern der die Mikrofilamente (03) enthaltenden Transport f lüssigkeit aus dem Speicher (17) in den Zulauf (12) der Einspülvorrichtung (07) . Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Einspülvorrichtung (07) weiterhin ein Volumen unter der Substrataufnahme (11) aufweist, welches in einen Ablauf (13) der Einspülvorrichtung (07) mündet, wobei der Speicher (17) und die Einspülvorrichtung (07) einen Kreislauf für die die Mikrofilamente (03) enthaltende Transport f lüssigkeit bilden.