DE19915938A1 - Herstellung von pankreatischer Procarboxypeptidase B, Isoformen und Muteinen davon und ihre Verwendung - Google Patents
Herstellung von pankreatischer Procarboxypeptidase B, Isoformen und Muteinen davon und ihre VerwendungInfo
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Abstract
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung pankreatischer Carboxypeptidase B oder einer Isoform oder eines Multeins von Carboxypeptidase B, wobei (a) eine natürliche oder unnatürliche Vorläuferform von Carboxypeptidase B in einem Mikroorganismus sekretorisch exprimiert, (b) die sekretorisch exprimierte Vorläuferform gereinigt und (c) die gereinigte Vorläuferform durch eine enzymatische Behandlung in die aktive Carboxypeptidase B, die Isoform oder das Mutein davon überführt wird, ein Nukleinsäurekonstrukt, seine Verwendung im genannten Verfahren und seine Herstellung, sowie eine Wirtszelle, ihre Herstellung und Verwendung in dem Verfahren zur Herstellung pankreatischer Carboxypeptidase BE oder einer Isoform oder eines Muteins davon.
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Carboxypeptidase B
und Procarboxypeptidase B und auf die Verwendung von Procarboxypeptidase B zur
Herstellung von in biotechnologischen Verfahren aktiver Carboxypeptidase B.
Carboxypeptidasen sind eine Gruppe von Proteine bzw. Peptide spaltenden,
zinkhaltigen Enzymen (Proteasen), durch die einzelne Aminosäuren schrittweise
vom Carboxyterminus der abzubauenden Proteine bzw. Peptide hydrolytisch
abgespalten werden. Carboxypeptidasen zählen daher zu den Exopeptidasen.
Tierische Carboxypeptidasen werden in der Bauchspeicheldrüse als Vorstufen
(Procarboxypeptidasen) gebildet und im Darm durch Trypsin in die aktiven Formen
umgewandelt, wo sie für die Verdauung von Peptiden, den primären Spaltprodukten
der Proteine, von großer Bedeutung sind. Nach der Substratspezifität unterscheidet
man zwischen verschiedenen Carboxypeptidasen.
Carboxypeptidase B setzt z. B. ausschließlich basische Aminosäuren, wie Arginin,
Lysin und Ornithin, frei. Carboxypeptidasen sind Hilfsmittel bei der
Sequenzermittlung von Peptiden und Proteinen, da mit ihrer Hilfe die an den
Carboxyenden stehenden Aminosäuren identifiziert werden können. Außerdem
lassen sich durch Einsatz von Carboxypeptidase 8 Proteine maßschneidern.
Ein technisches Beispiel für den Einsatz von Carboxypeptidase B ist die Herstellung
des wichtigen pharmazeutischen Produkts Insulin. Die Herstellung dieses
Peptidhormons ist u. a. in der Europäischen Patentanmeldung EP-A 0 489 780
beschrieben. Dabei kommt Carboxypeptidase B in einem wichtigen Schritt bei der
Umwandlung von mit Trypsin geöffneten Proinsulinstrukturen zu Insulinen zum
Einsatz.
Die Carboxypeptidase B, die in solchen technischen Verfahren zum Einsatz kommt,
stammt i. d. R. aus Carboxypeptidase B Präparationen, die kommerziell erhältlich
sind. Diese werden bevorzugt aus Schweinepankreata gewonnen (Folk, J.E., Meth.
Enzym.: 19, 504, 1970).
Enzyme tierischen Ursprungs haben jedoch den Nachteil, daß sie mit dem Risiko der
Kontamination mit tierischen Viren behaftet sein können. Der Nachweis der
Virenfreiheit ist aufwendig und geht als ein wesentlicher Faktor in die Kalkulation der
Herstellkosten ein. Wenn das Enzym in großtechnischen Verfahren, wie der
industriellen Insulinherstellung Verwendung findet, liegt ein weiterer Nachteil in
hohen Logistikkosten zur Beschaffung und Aufbewahrung gefrorener Pankreata.
Als Alternative zur Herstellung von Carboxypeptidase B über die Extraktion von
Pankreasgewebe bietet sich die biotechnologische Gewinnung an. Dabei gibt es
mehrere bekannte Herstellwege, wie die direkte intrazelluläre Expression oder die
Expression über ein Fusionsprotein in Bakterien, z. B. in Form eines β-
Galaktosidase-Carboxypeptidase B Fusionsproteins (J. Biol. Chem., 267: 2575-2581,
1992) oder entsprechende Expression in Hefen. Eine weitere Alternative dazu ist die
Expression eines Carboxypeptidase B-Vorläufers, der Procarboxypeptidase B,
welcher aus der Aminosäuresequenz der Carboxypeptidase B zuzüglich einer
Signalsequenz besteht, die zur Sekretion des Expressionsprodukts führt. Geeignete
Expressionssysteme wurden für Bacillus subtilis, Streptomyces, E. coli und die
Hefen Saccharomyces, Candida, Hansenula polymorphus und Pichle pasforis
beschrieben und sind teilweise kommerziell erhältlich.
Voraussetzung für die Anwendung von Expressionssystemen zur Herstellung von
Carboxypeptidase B ist es, daß der jeweils gewählte Wirtstamm durch die
Gegenwart aktiver Carboxypeptidase B nicht in seinem Wachstum gehemmt wird, so
daß eine Expression überhaupt erst möglich wird. Wirtsstämme, die diese
Eigenschaft aufweisen, sind meist schwierig zu fermentieren, so daß sich eine
schlechtere Ausbeute über Raum und Zeit einstellt.
Ein Problem bei der intrazellulären Expression von Carboxypeptidase B
(Direktexpression oder als Fusionsprotein) liegt darin, daß das Protein zunächst
nicht in der richtigen räumlichen Struktur vorliegt und somit inaktiv ist. Es muß dann
während der Reinigung und Prozessierung in vitro gefaltet werden. Dabei kann es zu
Fehlfaltungen kommen, die sich auf die Aktivität und Spezifität des Enzymes negativ
auswirken und den Einsatz in der Arzneimittelherstellung erschweren.
Auch die Herstellung von Carboxypeptidase B durch Sekretion der reifen, aktiven
Form des Enzyms zeigt Nachteile. Während der Fermentation wird
Carboxypeptidase B durch die Umsetzung mit peptidartigen Bruchstücken zellulärer
Bestandteile oder Bestandteile des Nährmediums, die als Substrat erkannt werden,
laufend inaktiviert, so daß Ausbeuteverluste auftreten.
Ein Ausweg aus diesem Dilemma ist die Expression und Sekretion einer inaktiven
Carboxypeptidase B-Form in räumlich korrekter Form. Durch Umsetzung mit einem
Enzym läßt sich aus diesem Vorläufer in vitro die aktive Carboxypeptidase B
herstellen. "Aktive Carboxypeptidase B" bedeutet hierbei eine Carboxypeptidase B,
die sich in der Natur findet, z. B. Carboxypeptidase B des Menschen oder natürlich
vorkommende Isoformen davon. "Aktive Carboxypeptidase B" kann ebenfalls ein
Mutein der natürlich vorkommenden Carboxypeptidase B bedeuten, die dem
Deletionen, Additionen oder Substitutionen der Aminosäuresequenz vorkommen, die
enzymatische Aktivität des Muteins aber qualitativ der enzymatischen Aktivität von
natürlich vorkommender Carboxypeptidase B entspricht. Der genannte Vorläufer
kann die natürliche Procarboxypeptidase B oder ein Derivat hiervon sein, z. B. eine
lsoform oder ein Mutein oder Carboxypeptidase B, die durch Hinzufügung einer
Peptidsequenz inaktiviert wurde. Die Art der hinzugefügten Proteinsequenz wird im
weiteren näher beschrieben. Bevorzugt ist Procarboxypeptidase B oder ein Derivat
hiervon, da sich aus diesem Protein überraschend gut steuerbar die aktive
Carboxypeptidase B herstellenläßt. Zudem können Procarboxypeptidase B und die
genannten Derivate davon über längere Zeiträume gelagert werden, während man
bei der Lagerung von Carboxypeptidase B einen Verlust an Aktivität beobachtet.
Die genannten Derivate von Procarboxypeptidase B enthalten die
Aminosäuresequenz von Carboxypeptidase B zuzüglich eines N-terminal angefügten
Peptides mit der Aminosäuresequenz eines Signalpeptides zur Ausschleusung des
Derivates aus dem zur Expression benutzten Wirtsorganismus, ggf. einer beliebigen,
bis zu 100 Aminosäuren langen Aminosäuresequenz und einer
Endopeptidaseerkennungssequenz, welche die enzymatische Abspaltung des
zuzüglich N-terminal angefügten Peptides von dem Carboxypeptidase B-Anteil des
Derivats ermöglicht. Beispiele für solche Endopeptidaseerkennungssequenzen sind
die entsprechenden bekannten Erkennungssequenzen von Trypsin, Faktor Xa,
Elastase, Chymotrypsin und Collagenase.
Überraschend wurde zudem gefunden, daß sich Procarboxypeptidase B mit
Proinsulin und Trypsin in einer Eintopfreaktion umsetzen läßt, so daß die frisch
gebildete aktive Carboxypeptidase B sofort die entstehenden carboxyterminalen
Arginine der Insulin B-Kette erkennt und hydrolysiert. Die während des Prozesses
entstehende Carboxypeptidase B ist aktiver als solche Carboxypeptidase B, die
vorher gelagert und dann zur Umsetzung mit Proinsulin hinzugegeben wurde. Das
im Reaktionsgemisch vorhandene Trypsin dient nicht nur zur Aktivierung von
Procarboxypeptidase B, sondern schneidet auch Proinsulin spezifisch und trägt
somit zur Freisetzung reifen Insulins bei.
Die Aktivierungskinetik durch Trypsin wird überraschend durch die Addition einer
Tetra-His-Sequenz am N-Terminus der Procarboxypeptidase B oder die
genannten Derivate nicht beeinträchtigt. Der Vorteil einer solchen Addition liegt darin,
daß das Protein so mittels Nickel-Chelatkomplexierung leicht
affinitätschromatographisch gereinigt werden kann. Die Verwendung solcher
modifizierter Procarboxypeptidase B ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Beispielhaft für die Erfindung wird die cDNA-Sequenz humaner pankreatischer
Procarboxypeptidase B exprimiert. Es ist jedoch klar, daß aufgrund der großen
Sequenzhomologie, sowohl auf DNA- als auch auf Proteinebene, zwischen dem
humanen Enzym und den entsprechenden Enzymen, z. B. aus Rind, Ratte, Schwein
oder anderen Spezies, die Pankreasgewebe bilden, statt der humanen DNA-
Sequenz die DNA-Sequenz solcher Spezies ebenfalls verwendet werden könnte.
Auch kann die entsprechende DNA kodierend für Muteine der Carboxypeptidase B
verwendet werden. Ebenso können DNA-Sequenzen, die für natürliche oder
künstlich erzeugte Isoformen der Carboxypeptidase B oder der Procarboxypeptidase
B kodieren, verwendet werden. Außerdem können natürlich alle diejenigen nicht
natürlich vorkommenden DNA-Sequenzen verwendet werden, die auf Grund der
Degeneriertheit des genetischen Codes die vorgenannten DNA-Sequenzen
kodierend eine Carboxypeptidase B oder Procarboxypeptidase B oder jeweils ein
Mutein davon ersetzen können.
Ebenfalls exemplarisch wird das über die Firma Invitrogen kommerziell erhältliche
Pichia-pastoris-Expressionssystem zur Sekretion heterologer Proteine zur
Herstellung der humanen Procarboxypeptidase B verwendet. Es ist dem Fachmann
klar, daß auch bakterielle Systeme, z. B. E.-coli-Sekretormutanten, wie in der
Europäischen Patentanmeldung EP-A 0 448 093 beschrieben wurden, verwendet
werden können, wenn man die dort beschriebene Hirudinsequenz durch die
Sequenz der Procarboxypeptidase ersetzt. Eine weitere Alternative wäre die
Expression der humanen Procarboxypeptidase B in Streptomyceten, wie z. B. in der
Europäischen Patentanmeldung EP-A 0 504 798 für den Fall der Expression von
Glutarylamidase beschrieben.
Ebenfalls ist klar, daß bei der großtechnischen Verwendung des Verfahrens zur
Isolation größerer Mengen Enzym andere proteintechnische Reinigungsschritte als
in den Beispielen beschrieben, wie sie Stand der Technik sind, Verwendung finden
können.
Demgemäß ist ein Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
pankreatischer Carboxypeptidase B oder einer Isoform oder eines Muteins der
Carboxypeptidase B, wobei
- a) eine natürliche oder unnatürliche Vorläuferform von Carboxypeptidase B oder einer Isoform oder eines Muteins der Carboxypeptidase B in einem Mikroorganismus sekretorisch exprimiert,
- b) die sekretorisch exprimierte Vorläuferform gereinigt und
- c) die gereinigte Vorläuferform durch eine enzymatische Behandlung in die aktive Carboxypeptidase B oder eine Isoform oder ein Mutein der Carboxypeptidase B überführt wird;
insbesondere ein solches Verfahren, bei dem die pankreatische Carboxypeptidase B
oder eine Isoform davon aus dem Menschen stammt, bevorzugt ein solches
Verfahren bei dem die natürliche Vorläuferform der Procarboxypeptidase B oder
einer Isoform davon entspricht.
Im weiteren wird bei der Bezugnahme auf das beschriebene Verfahren i. d. R. der
Ausdruck "ein solches Verfahren" verwendet, sofern nicht ausdrücklich auf ein
anderes Verfahren hingewiesen wird. "Natürliche" und "unnatürliche"
Vorläuferformen von Carboxypeptidase B sind solche Moleküle, die in der Natur
vorkommen ("natürliche Vorläuferformen") oder von solchen natürlichen
Vorläuferformen durch Substitution, Addition oder Deletion von Aminosäuren
hervorgegangen sind ("unnatürliche Vorläuferform"), wobei jedoch die unnatürlichen
Vorläuferformen durch eine enzymatische Behandlung in aktive pankreatische
Carboxypeptidase B oder Isoformen oder Muteine davon übergeführt werden
können.
Besonders bevorzugt ist ein solches Verfahren, bei dem die unnatürliche
Vorläuferform folgende Struktur hat:
S-(As)x-E-CB, (I)
wobei
S ein Signalpeptid ist, welches die Sekretion des bei der Expression entstehenden Fusionsproteins aus dem jeweiligen Mikroorganismus bewirkt;
As eine beliebige genetisch kodierbare Aminosäure ist;
E ein peptidischer Linker bestehend aus einer Endopeptidaseerkennungssequenz ist;
CB die Aminosäuresequenz der Carboxypeptidase B oder einer Isoform oder eines Muteins der Carboxypeptidase B ist; und
x eine ganze Zahl von 0-100 ist.
S ein Signalpeptid ist, welches die Sekretion des bei der Expression entstehenden Fusionsproteins aus dem jeweiligen Mikroorganismus bewirkt;
As eine beliebige genetisch kodierbare Aminosäure ist;
E ein peptidischer Linker bestehend aus einer Endopeptidaseerkennungssequenz ist;
CB die Aminosäuresequenz der Carboxypeptidase B oder einer Isoform oder eines Muteins der Carboxypeptidase B ist; und
x eine ganze Zahl von 0-100 ist.
Desweiteren ist Gegenstand der Erfindung ein solches Verfahren, bei dem an die
natürliche oder unnatürliche Vorläuferform eine Peptidsequenz angefügt ist, welche
die affinitätschromatographische Reinigung der Vorläuferform ermöglicht, besonders
bevorzugt ist ein solches Verfahren, bei dem die für die affinitätschromatographische
Reinigung angefügte Sequenz 1 bis 6, vorzugsweise 4 Histidinreste darstellen.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein solches Verfahren, wobei als
Mikroorganismus zur Expression die Hefe Pichia pasforis verwendet wird.
Ein zusätzlicher Gegenstand der Erfindung ist ein solches Verfahren, bei dem zur
enzymatischen Behandlung die Enzyme Trypsin, Elastase, Faktor Xa, Chymotrypsin
oder Collagenase, vorzugsweise Trypsin, verwendet wird.
Außerdem ist Gegenstand der Erfindung ein solches Verfahren, bei dem Schritt (c)
unter geeigneten Reaktionsbedingungen in Gegenwart einer Insulinvorläuferform
enthaltend die B-, C- und A-Ketten von Insulin oder eines Insulinderivats abläuft und
hierbei reifes Insulin oder ein reifes Insulinderivat entsteht, welches aus dem
Reaktionsgemisch isoliert wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von
Procarboxypeptidase B und Carboxypeptidase B in einem solchen Verfahren.
Desweiteren ist Gegenstand der Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt zur
Verwendung in einem solchen Verfahren, enthaltend eine DNA-Sequenz kodierend
für eine natürliche oder unnatürliche Vorläuferform von Carboxypeptidase B oder
einer Isoform oder eines Muteins der Carboxypeptidase B, wobei die genannte
kodierende Sequenz operativ mit einem Promotor verbunden ist, der die Expression
der Vorläuferform in einem geeigneten Mikroorganismus ermöglicht; bevorzugt ist
Gegenstand der Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt, bei dem die DNA-Sequenz
kodiert für ein Protein der Formel I; desweiteren ist Gegenstand der Erfindung ein
Nukleinsäurekonstrukt, bei dem an die DNA-Sequenzen kodierend für eine
natürliche oder unnatürliche Vorläuferform von Carboxypeptidase B oder eine
Isoform oder ein Mutein der Carboxypeptidase B noch eine DNA-Sequenz kodierend
für 1 bis 6, vorzugsweise 4 Histidinreste, angefügt ist.
Im weiteren wird bei der Bezugnahme auf das beschriebene Nukleinsäurekonstrukt
i. d. R. der Ausdruck "ein solches Nukleinsäurekonstrukt" verwendet, sofern nicht
ausdrücklich auf ein anderes Nukleinsäurekonstrukt hingewiesen wird.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines solchen
Nukleinsäurekonstrukts, wobei
- a) die genannten DNA-Sequenzen isoliert oder hergestellt werden und
- b) in geeigneter Weise in einem Vektor eingefügt werden.
Darüberhinaus ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines solchen
Nukleinsäurekonstrukts in einem o. g. Verfahren zur Herstellung pankreatischer
Carboxypeptidase B.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Wirtszelle, enthaltend ein o. g.
Nukleinsäurekonstrukt und ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Wirtszelle,
bei dem ein o. g. Nukleinsäurekonstrukt in einen geeigneten Mikroorganismus
eingeschleust wird.
Auch ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung einer solchen Wirtszelle in
einem o. g. Verfahren zur Herstellung pankreatischer Carboxypeptidase B.
Die vorliegenden Beispiele sollen veranschaulichen, wie man Procarboxypeptidase
B und (His)4-Procarboxypeptidase B exprimieren und reinigen könnte.
Darüberhinaus wird erläutert, wie Procarboxypeptidase B mit Trypsin aktiviert
werden könnte, und zwar sowohl in isolierter Form als auch beim kombinierten
Einsatz von Trypsin und Procarboxypeptidase B zur Herstellung von Insulin.
Das Beispiel beschreibt die Herstellung eines rekombinanten P.-pastoris-Stammes
zur Sekretion von humaner Procarboxypeptidase 13. Als Ausgangsmaterial dient eine
cDNA-Präparation wie sie gemäß bekannter Methoden aus RNA, die aus humanem
Pankreasgewebe isoliert wurde, hergestellt wird. Solche cDNA-Präparationen sind
kommerziell z. B. von der Firma Clontech (Katalog Nr. 7410-1) erhältlich. Zur
Amplifikation der gewünschten cDNA Zielsequenz werden zwei Primer synthetisiert.
Die Sequenzen dazu werden der Genbank Datenbank entnommen. Dort ist die
cDNA Sequenz für humane pankreatische Carboxpeptidase B unter der 'Accession
Nummer' M81057 zugänglich. Die vorwärts gerichtete Primersequenz P-CPBf22
entspricht dem Bereich 22 bp-32 bp und die rückwärts gerichtete Primersequenz
P-CPBrev1271 der Region 1271 bp-1250 bp. Zur Amplifikation wird eine Standard
Polymerase Ketten Reaktion (PCR) durchgeführt. Die Reaktionsprodukte der PCR
werden gelelektrophoretisch aufgetrennt und die entstandene DNA-Bande der
erwarteten Länge von ca. 1250 bp eluiert und in einer Ligationsreaktion mit dem
pCR® Vector des Original TA Cloning ®-Kits der Firma Invitrogen umgesetzt.
Kompetente Zellen des als Bestandteil des Kits mitgelieferten Stammes E. coli
INVα F' werden mit dem Ligationsgemisch transformiert und auf NA-Platten, die 25
mg/Liter Ampicillin enthalten, ausplattiert und bei 37°C inkubiert. Von den
gewachsenen Kolonien werden am nächsten Morgen Zellen entnommen in 20 µl
steriles Wasser resuspendiert und für 10 Minuten bei 94°C inkubiert. Der
Suspension wird anschließend PCR-Reaktionspuffer, der je 0,2 µg der beiden
beschrieben Primer P-CPBf22 und P-CPBrev1271 enthält, so aufgefüllt, daß eine
Standard PCR in einem Reaktionsvolumen von 100 µl durchgeführt werden kann.
Die Reaktionsprodukte werden anschließend geleelektrophoretisch analysiert.
Transformanten, die DNA enthalten, die zu einem ca. 1250 bp Fragment amplifiziert
werden können, werden als richtig erkannt. Von einem der so definierten Klone wird
Plasmid DNA isoliert und die insertierte cDNA-Sequenz mittels Sequenzanalyse
vollständig charakterisiert. Es zeigt sich, daß die ermittelte Sequenz vollständig
identisch zu der von Aloy et al (Biol. Chem., 379: 149-155, 1998) publizierten
Sequenz ist. Entsprechend der Publikation dienen die Codone, welche die
Aminosäuren -95 bis 307 der Procarboxypeptidase kodieren, zur Expression. Als
Expressionsvektor dient das Plasmid pPIC9, das von Cregg, J.M. et al.
(Bio/Technologie, 11: 905-910, 1993) und Scorer, C.A. et al. (Bio/Technologie,
12: 181-184, 1994) beschrieben wurde. Das Plasmid pPIC9 wird dazu mit den
Restriktionsenzymen Xhol und EcoRl geöffnet. Zur Insertion der cDNA-Sequenz in
den Vektor werden zwei Primer synthetisiert. Der vorwärtsgerichtete Primer
PPICCPBf hat die Sequenz
und der rückwärtsgerichtete Primer PPICCPBrev die Sequenz
In einer Standard PCR Reaktion wird die cDNA mit den beiden Primern amplifiziert
und das entstandene Fragment nach Reinigung mit den Enzymen XhoI und EcoRI
verdaut. Das so maßgeschneiderte Fragment wird aus dem Reaktionsgemisch
ausgefällt, in Wasser aufgenommen und mit dem geöffneten Vektorfragment in einer
Ligasereaktion umgesetzt. Kompetente INVαF' Zellen werden mit dem
Ligationsgemisch transformiert und auf Selektionsplatten ausplattiert. Kolonien, die
das gewünschte Expressionsplasmid enthalten, werden wie beschrieben mittels
PCR-Technologie identifiziert. Von einem als richtig erkannten Klon wird Plasmid
DNA gewonnen. Diese DNA wird wie von Cregg J.M. et al. beschrieben in den für
Histidin auxotrophen P. pastoris Stamm GS115 Scorer C.A. et al
Biotechnology, 12: 181-184, 1994 eingeführt. Kolonien, die nach Transformation
prototroph für Histidin geworden sind, werden auf Expression des
Procarboxypeptidaseproteins untersucht. Dazu werden 50 Klone wie von Clare, J.J. et al.
(Gene, 105: 205-212, 1991) beschrieben exprimiert. Am Ende der Expression
werden 1 ml Kulturmedium entnommen, die Zellen abzentrifugiert und der klare
Überstand gefriergetrocknet. Aliquots des Überstandes werden mittels SDS-
Polyacrylamidgelelektrophrese analysiert. Nach Coomassie Blaufärbung sieht man,
daß bei Proben einiger der Überstände im Bereich von 45000 dt Molekulargewicht
eine deutliche Bande sichtbar ist, die in Proben von Überständen nicht induzierter
Kulturen nicht beobachtet wird. Diese Bande wird in der Western Blot Analyse von
dem Anti-Schweinecarboxypeptidase B Antikörper der Firma Chemicon (Bestell Nr.
AB1801) deutlich erkannt. Von dem Klon, der in diesem Experiment die beste
Ausbeute liefert, wird in einem 21 Kreuzkolben eine 100 ml Kultur kultiviert, die
Procarboxypeptidase B exprimiert und gemäß Beispiel 2 isoliert.
Das Beispiel beschreibt die Reinigung von humaner Procarboxypeptidase B aus
Überstand von Kulturbrühen gemäß Beispiel 1. Zunächst werden die Zellen
abzentrifugiert. Der klare Überstand wird anschließend mit Ammoniumsulfat versetzt
bis eine ungefähr 55%-ige Sättigung erreicht ist. Das ausgefällte Protein wird
abzentrifugiert und das Pellet in 5 ml einer 50 mM Tris-HCL (pH 7,5) Lösung
enthaltend 1 mM EDTA, gelöst. Die Proteinsuspension wird anschließend über
DEAE-Cellulose-Chromatographie aufgetrennt. Das Elutionschromatogramm
wird über einen 0 bis 0,5 M NaCl Gradienten erstellt. Die Fraktionen, die das
gewünschte Protein enthalten, werden über Western-Blot Analyse identifiziert. Die
Fraktionen werden vereinigt und über Ultrafiltration konzentriert. In dem Retentat
wird mittels Proteinbestimmung nach Bradford die Konzentration an Protein
bestimmt. Die so angereicherte Procarboxypeptidase wird anschließend zur
Lagerung gefriergetrocknet oder direkt gemäß Beispiel 4 durch Trypsinbehandlung
aktiviert. Die Coomassie Blaufärbung des gelelektrophoretisch aufgetrennten
Materials zeigt, daß ungefähr 60% des Materials in einer Proteinbande von ca.
45000 dt Molekulargewicht gefunden werden. Die Bande korrespondiert mit dem im
Western Blot identifizierten Bereich.
Das Beispiel beschreibt die Herstellung des Expressionsvektors zur Synthese von
(His)4-Procarboxypeptidase B. Die Konstruktion erfolgt entsprechend dem im
Beispiel 1 beschriebenen Weg. Verwendet wird der Primer PPICCPBrev
(siehe Beispiel 1). Der vorwärtsgerichtete Primer wird so modifiziert, daß er vier
zusätzliche Codone für Histidin enthält. Die Sequenz des Primers PCPBHisf lautet
entsprechend:
Der so konstruierte P.pastoris Stamm wird zur Expression benutzt und das His-
Procaboxypeptidase B-Protein nach Fällung mit Ammoniumsulfat in Lösung über
einen Nickelaffinitätschromatographieschritt direkt gereinigt. Als
Chromatographieträgermaterial wird "ProBondTM NICKEL Chelating Resin"
(Invitrogen Katalog Nr. R801-01) entsprechend der Angaben des Herstellers
verwendet. Die gelelektrophoretische Analyse ergibt nach Coomassie Blaufärbung
praktisch nur eine sichtbare Bande, die ein Molekulargewicht von ca. 45000 dt
aufweist. Diese Bande wird im Western Blot Experiment von dem eingesetzten
Antikörper erkannt. Das so gereinigte Material wird ultrafiltriert und nach
Proteinbestimmung nach der Methode von Bradford entweder zur Lagerung
gefriergetrocknet oder direkt gemäß Beispiel 4 aktiviert.
Das Beispiel beschreibt die Aktivierung von Procarboxypeptidase B durch
Umsetzung mit Trypsin. Dazu werden 22 mg gefriergetrocknetes Material aus
Beispiel 2 in 14 ml einer 0,1 molaren Tris-HCl-Lösung (pH 7,8) gelöst, auf 26°C
erwärmt und mit 15 µl einer Trypsinlösung (0,1 u/ml) versetzt und 3 Stunden unter
Rühren inkubiert. Anschließend wird die Lösung mit einem Trypsininhibitor aus der
Sojabohne versetzt und das Trypsin, der Inhibitor, die von der Carboxypeptidase B
abgespaltenen Propeptidfragmente und andere Bestandteile durch Mikrofiltration
über eine Centriprep®-Filtereinheit (Firma Amicon) mit einer
Molekulargewichtsausschlußgrenze von 30000 dt von der Carboxypeptidase B
abgetrennt. Die aktive Carboxypeptidase B wird in einem 5mM Tris-Puffer (pH 7,5)
gefroren aufbewahrt. Die Bestimmung der spezifischen Aktivität erfolgt nach
Bestimmung der Proteinkonzentration entsprechend der Vorschrift von Folk, J.E.
(Meth. Enzym., 19: 504-508, 1970). Geht man von Material aus, daß gemäß Beispiel
3 hergestellt wurde, so werden nur 15 mg des Ausgangsmaterial zur Aktivierung
verwendet.
Das Beispiel beschreibt den kombinierten Einsatz von Trypsin und
Procarboxypeptidase B zur Herstellung von Insulin aus Mono-Arg-Insulin. Beispiel
6 der Europäischen Patentanmeldung EP-A 0 347 781 beschreibt die Umsetzung
von Mono-Arg-Insulin mit Trypsin und Carboxypeptidase B in ein und demselben
Reaktionsgefäß. Im vorliegenden Beispiel wird nun die Carboxypeptidase B in
Beispiel 6 der Europäischen Patentanmeldung EP-A 0 347 781 durch 15 µg
Procarboxypeptidase B aus Beispiel 2 dieser Anmeldung bzw. durch 10 µg
Procarboxypeptidase B aus Beispiel 3 dieser Anmeldung ersetzt. In beiden
Reaktionen wird die Trypsinkonzentration durch Einsatz von 3 µl Trypsin anstelle von
2,5 µl der Stammlösung (gemäß Beispiel 6 der Europäischen Patentanmeldung EP-
A 0 347 781) erhöht.
Claims (18)
1. Verfahren zur Herstellung pankreatischer Garboxypeptidase B oder Isoformen
oder Muteinen der Carboxypeptidase B, wobei
- a) eine natürliche oder unnatürliche Vorläuferform von Carboxypeptidase B oder einer Isoform oder eines Muteins der Carboxypeptidase B in einem Mikroorganismus sekretorisch exprimiert,
- b) die sekretorisch exprimierte Vorläuferform gereinigt und
- c) die gereinigte Vorläuferform durch eine enzymatische Behandlung in die aktive Carboxypeptidase B oder die Isoform oder das Mutein von Carboxypeptidase B überführt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die pankreatische Carboxypeptidase B
oder eine Isoform davon aus dem Menschen stammt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die natürliche Vorläuferform der
Procarboxypeptidase B oder einer Isoform der Procarboxypeptidase B
entspricht.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die unnatürliche Vorläuferform
folgende Struktur hat:
S-(As)x-E-CB, (I)
wobei
S ein Signalpeptid ist, welches die Sekretion des bei der Expression entstehenden Fusionsproteins aus dem jeweiligen Mikroorganismus bewirkt;
As eine beliebige genetisch kodierbare Aminosäure ist;
E ein peptidischer Linker bestehend aus einer Endopeptidaseerkennungssequenz ist;
CB die Aminosäuresequenz der Carboxypeptidase B oder einer Isoform oder eines Muteins der Carboxypeptidase B ist; und
x eine ganze Zahl von 0-100 ist.
S-(As)x-E-CB, (I)
wobei
S ein Signalpeptid ist, welches die Sekretion des bei der Expression entstehenden Fusionsproteins aus dem jeweiligen Mikroorganismus bewirkt;
As eine beliebige genetisch kodierbare Aminosäure ist;
E ein peptidischer Linker bestehend aus einer Endopeptidaseerkennungssequenz ist;
CB die Aminosäuresequenz der Carboxypeptidase B oder einer Isoform oder eines Muteins der Carboxypeptidase B ist; und
x eine ganze Zahl von 0-100 ist.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei an die natürliche oder
unnatürliche Vorläuferform eine Peptidsequenz angefügt ist, welche die
affinitätschromatographische Reinigung der Vorläuferform ermöglicht.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die für die affinitätschromatographische
Reinigung angefügte Sequenz 1 bis 6, vorzugsweise 4 Histidinreste
darstellen.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei als Mikroorganismus
zur Expression die Hefe Pichia pastoris verwendet wird.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei zur enzymatischen
Behandlung die Enzyme Trypsin, Elastase, Faktor Xa, Chymotrypsin oder
Collagenase, vorzugsweise Trypsin, verwendet wird.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei Schritt (c) unter
geeigneten Reaktionsbedingungen in Gegenwart einer Insulinvorläuferform
enthaltend die B-, C- und A-Ketten von Insulin oder eines Insulinderivats abläuft
und hierbei reifes Insulin oder ein reifes Insulinderivat entsteht, welches aus
dem Reaktionsgemisch isoliert wird.
10. Verwendung von Procarboxypeptidase B und Carboxypeptidase B oder einer
Isoform oder eines Muteins davon in einem Verfahren gemäß Anspruch 9.
11. Nukleinsäurekonstrukt zur Verwendung in einem Verfahren gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 9, enthaltend eine DNA-Sequenz kodierend für eine
natürliche oder unnatürliche Vorläuferform von Carboxypeptidase B oder einer
Isoform oder eines Muteins der Carboxypeptidase B, wobei die genannte
kodierende Sequenz operativ mit einem Promotor verbunden ist, der die
Expression der Vorläuferform in einem geeigneten Mikroorganismus
ermöglicht.
12. Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 11, wobei die DNA-Sequenz kodiert
für ein Protein der Formel I.
13. Nukleinsäurekonstrukt gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, wobei an die
DNA-Sequenzen kodierend für eine natürliche oder unnatürliche
Vorläuferform von Carboxypeptidase B noch eine DNA-Sequenz kodierend für
1 bis 6, vorzugsweise 4 Histidinreste, angefügt ist.
14. Verfahren zur Herstellung eines Nukleinsäurekonstrukts gemäß einem der
Ansprüche 11 bis 13, wobei
- a) die genannten DNA-Sequenzen isoliert oder hergestellt werden, und
- b) in geeigneter Weise in einem Vektor eingefügt werden.
15. Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts gemäß einem der Ansprüche 11
bis 13 in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.
16. Wirtszelle, enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß einem der Ansprüche
11 bis 13.
17. Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle gemäß Anspruch 16, wobei ein
Nukleinsäurekonstrukt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 in einen
geeigneten Mikroorganismus eingeschleust wird.
18. Verwendung einer Wirtszelle gemäß Anspruch 16 in einem Verfahren gemäß
einem der Ansprüche 1 bis 9.
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Cited By (1)
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GR1005153B (el) | 1989-08-29 | 2006-03-13 | The General Hospital Corporation | Πρωτεινες συντηξεως, παρασκευη τους και χρηση τους. |
AU651059B2 (en) * | 1989-10-31 | 1994-07-14 | Schering Corporation | E. coli secretory strains |
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FI103805B (fi) * | 1990-09-05 | 1999-09-30 | Hoechst Ag | Menetelmä preproinsuliinien hydroloimiseksi |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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