DE19912799A1 - Superparamagnetisches Adsorptionsmaterial, seine Herstellung und Verwendung - Google Patents
Superparamagnetisches Adsorptionsmaterial, seine Herstellung und VerwendungInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft superparamagnetische Adsorbentien auf Kieselgelbasis, deren Herstellung und Verwendung. Die erfindungsgemäßen Kieselgele sind dazu geeignet, Nukleinsäuren über Festphasenextraktion an ihrer Oberfläche aus einer komplexen Probenmatrix anzureichern, mit dem Ziel die Nukleinsäuren zu konzentrieren, von möglichst allen Verunreinigungen aus der Probenmatrix abzutrennen und der eigentlichen Analyse zuzuführen. Die Art der Herstellung verleiht den Adsorbentien Eigenschaften, die es gestatten, selektiv, durch Wahl der Elutionsbedingungen, Desoxyribonukleinsäuren und Ribonukleinsäuren zu trennen.
Description
Die Erfindung betrifft spezielle Adsorbentien auf Kieselgel
basis, Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung zur
Isolierung von Nukleinsäuren. Die erfindungsgemäßen Kieselgele
verfügen über superparamagnetische Eigenschaften und können
mittels magnetischer Felder aus einer Probenmatrix entfernt
werden.
Unterschiedliche Praktiken zur Festphasenextraktion eines
speziellen Analyten aus einer komplexen Probenmatrix, mit dem
Ziel den Analyten zu konzentrieren, von möglichst allen Ver
unreinigungen aus der Probenmatrix abzutrennen und der eigent
lichen Analyse zuzuführen, haben in den letzten Jahren stark
an Bedeutung zugenommen. Das betrifft die biochemisch/moleku
larbiologische Analytik und gleichermaßen die Umweltanalytik
und medizinische Diagnostik. Unabhängig von der Art des Analy
ten und der jeweiligen Fragestellung läßt sich die Probenvor
bereitung zum eigentlichen Analysengang in 4 Grundschritte
unterteilen: 1. Konditionierung der festen Phase; 2. selektive
oder spezifische Bindung des Analyten an die feste Phase und
Entfernen der übrigen Probenmatrix; 3. Herauswaschen von even
tuellen Verunreinigungen aus der festen Phase und 4. Elution
des angereicherten und gereinigten Analyten.
Steht die Anreicherung und Isolierung von Nukleinsäuren zur
Aufgabe, beispielsweise zum qualitativen Nachweis von Viren
mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf DNA-Ebene oder
der Reversen Transkription und nachfolgender Polymerase-Ket
tenreaktion auf RNA-Ebene oder der Isolierung von Templates
zur DNA-Sequenzierung und/oder zur PCR aus verschiedensten
biologischen Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Plasma, Serum
oder Bakterienlysat, macht man sich die lange bekannte Eigen
schaft von Nukleinsäuren zu nutze, unter chaotropen oder ande
ren Hochsalzbedingungen, d. h. bei hohen Konzentrationen von
chaotropen oder anderen Salzen, spezifisch an silicathaltige
Adsorbentien wie Glasmehl [Proc. Natl. Acad. USA 76 (1979)
615-619, Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387], Diamatomeenerde
[Methods Enzymol. 65 (1979) 176-182] oder native Kieselerde
[J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495-503, EP 0 389 063 B1] zu
binden. Mit Hilfe eines ein wasserlösliches organisches Lö
sungsmittel enthaltenen Puffers, in der Regel ist das ein
niederer aliphatischer Alkohol, werden dann Verunreinigungen
von dem Adsorbens gewaschen, der Träger getrocknet und die
adsorbierten Nukleinsäuren mit destilliertem Wasser oder einem
sogenannten Niedrigsalzpuffer, d. h. Puffer mit geringer Ionen
stärke, eluiert.
Neben den bereits erwähnten, weitestgehend in ihrem nativen
Zustand belassenen silicatischen Trägermaterialien sind auch
einige synthetische Verfahren zur Darstellung von Kieselgel
adsorbentien für die Nukleinsäureisolierung beschrieben wor
den. So die Herstellung entsprechender Derivate durch Hydroly
se von siliciumhalogeniden allein oder in Gegenwart bestimm
ter, die Adsorptionseigenschaften beeinflussender Zusätze [EP 0 600 253
B1] oder über die Hydrazinolyse von Siliciumtetra
chlorid [EP 0 540 170 A1].
Auch hat es Versuche gegeben, die für die Isolierung von
Nukleinsäuren optimalen Adsorptions-/Desorptionseigenschaften
durch chemische Behandlung von silicathaltigen Oberflächen zu
erreichen. So etwa über die Behandlung von Celiten mit starken
Alkalien [EP 0 555 798A1], der Oberflächenmodifizierung von
Glasfasermembranen mit unterschiedlichen Reagentien wie Alumi
nium-(III)-chlorid oder Bortrichlorid zur Erzielung bestimmter
Eigenschaften [EP 0 649 853 A1]. In diesem Zusammenhang sind
auch die Versuche zu sehen, durch Fluorierung mineralischer,
insbesondere silicatischer Oberflächen bestimmte vorteilhafte
Bindungseigenschaften für Nukleinsäuren zu erreichen [EP 0 648 777 A1].
Die Nutzung "loser" silicatischer Adsorbentien zur Isola
tion von Nukleinsäuren wird jedoch heute weitestgehend durch
die Verwendung von Fertigsäulen, wie sie beispielsweise in
DE 195 12 369 A1 und DE 41 39 664 A1 beschrieben sind ver
drängt. Diese Fertigsäulen enthalten als Adsorbens eine Glas
fasermembran oder in Spezialfilter eingeschlossene Adsorben
tien auf Silicatbasis. Hauptvorteil dieser Anordnungen ist,
daß der Verbleib von Silicatpartikeln im Nukleinsäureeluat
durch unvollständige Zentrifugation oder Pipettierfehler wei
testgehend vermieden wird. Das verringert die Gefahr des Ver
schleppens von Inhibitoren für in den weiteren Analysenschrit
ten angewandte Enzyme, etwa thermostabile Polymerasen für die
PCR-Reaktionen. Durch den zwangsläufig höheren Fertigungsauf
wand sind die beschriebenen Fertigsäulen jedoch entschieden
teurer als die freien Adsorbentien, was sich natürlich beson
ders bei sehr hohem Probenaufkommen sehr nachteilig bemerkbar
macht. Auch ist die Ersparnis an Zeit, Energie und Arbeits
kraft im Vergleich zum Einsatz loser Adsorbentien nicht allzu
wesentlich, da weiterhin eine Reihe von Zentrifugationsschrit
ten und Operationen zum Wechseln der Auffanggefäße während der
Wasch- und Elutionsschritte erforderlich sind. Auch die Nut
zung von Vakuumgeräten, welch den Durchfluß durch die Fertig
säulen unterstützen, hat hier bisher nicht den entscheidenden
technologischen Durchbruch gebracht. Alle diese notwendigen
manuellen Eingriffe erschweren weiterhin die angestrebte voll
ständige Automatisierung der Nukleinsäureisolierungsprozesse.
Eine bekannte und sehr elegante Variante zur Vermeidung
jeglicher Filtrations- und Zentrifugationsschritte bei der
Stofftrennung fest/flüssig ist der Einsatz sogenannter super
paramagnetischer Materialien als Kernmaterialien für adsorbie
rende feste Stoffe. Superparamagnetismus verleiht bestimmten
Substanzen die Eigenschaft von einem Magneten in Richtung
seiner Pole angezogen zu werden und im Gegensatz zu ferroma
gnetischen Materialien beim Verweilen im Magnetfeld nicht
selbst permanent magnetisiert zu werden. Das erlaubt ein pro
blemloses Resuspendieren nach Entfernen des Magnetfeldes, wie
es für effiziente Wasch- und Elutionsprozesse unbedingt erfor
derlich ist. Dem Fachmann sind die einschlägigen Materialien
bekannt, so daß an dieser Stelle zwei Beispiele genügen. Sehr
oft verwendete superparamagnetische Materialien sind fein
verteilter Magnetit (Fe3O4) und Erdalkaliferrite.
Die Herstellung superparamagnetischer Adsorbentien ge
schieht im wesentlichen auf zwei Wegen. Einmal werden in porö
se dreidimensionale Netzwerke von adsorbierenden Substanzen
oder deren Precursor Gemische von Fe2+ und Fe3+ Salzen gebracht,
deren Fe2+/Fe3+ Verhältnis annähernd dem Verhältnis im superma
gangetischen Kern entspricht [US 4,452,773; WO 90/07380] und
anschließend durch Erhöhung des pH Wertes die gewünschten
Oxide in den Poren gefällt und gleichzeitig eingeschlossen, so
daß die adsorbierende Substanz oder deren Precursor superpara
magnetische Eigenschaften erhält. Bei der zweiten Technologie
geht man von Suspensionen von superparamagnetischen Materia
lien in verschiedenen Lösungen aus und scheidet auf diesen
Materialien durch unterschiedliche chemische Reaktionen die
adsorbierenden Stoffe oder deren Precursoren ab. Das kann zum
Beispiel durch Vernetzung löslicher Polymere erfolgen [Bolto,
J. Macromol. Sci.-Chem. A14 (1980) 107-120; Dixon et al. J.
Macromol. Sci.-Chem.; A14 (1980) 153-159].
Silicatische Adsorbentien mit superparamagnetischen Eigen
schaften, die sich für die Aufreinigung von Nukleinsäuren
eignen, sind ebenfalls beschrieben. So lassen sich poröse
Gläser mit Hilfe entsprechender Eisensalzlösungen (s. oben) in
superparamagnetisches Glas überführen und zur DNA-Isolation
nutzen [US 05734020; US 05610274]. Auch ist die Herstellung
und Nutzung superparamagnetischer Glaspartikel durch Ablage
rung eines SiO2-Sols, welches durch alkalische Hydrolyse von
Siliciumtetraalkylestern und entsprechenden Aluminiumverbin
dungen im Gemisch mit Bor-(III)-oxid auf superparamagnetischen
Trägermaterialien abgelagert und anschließend durch Verschmel
zung bei hohen Temperaturen unter Inertgasbedingungen zu Glas
partikeln umgesetzt wird, beschrieben [DE 195 20 398 A1].
Beide beschriebenen superparamagnetischen Glas- bzw. Sili
capartikel sind jedoch hinsichtlich ihrer Herstellung mit
Nachteilen behaftet. So nutzen beide Verfahren relativ teure
Ausgangsmaterialien. Außerdem ist das in DE 195 20 398 A1
beschriebene Verfahren ein langwieriger, nur unter relativ
hohem technischen Aufwand umsetzbarer Mehrstufenprozeß.
Aus der DE 43 07 262 A1 ist bekannt, Kieselgel in Gegenwart
von fein verteiltem magnetischem Material und von Mineralsäu
ren oder CO2 zu fällen, um ein magnetisches Kieselgel zu er
halten, an das pharmakologisch, biologisch oder biochemisch
wirksame Substanzen angekoppelt werden. Das Produkt wird an
schließend auf oralem Wege dem menschlichen Organismus zuge
führt und dort mit Hilfe elektromagnetischer Hochgradienten
felder angereichert, um bestimmte lokale Wirksstoffkonzentra
tionen zu erhalten.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfach und
preiswert herstellbares Adsorptionsmaterial zu entwickeln, das
sich hinsichtlich seiner Adsorptionseigenschaften besonders
zur Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen und nicht
biologischen Probenmatrizes eignet.
Erfindungsgemäß ist das superparamagnetische Adsorptions
material gekennzeichnet durch ein Kieselgel auf Basis von
Alkalisilicaten mit darin chemisch und/oder physikalisch ein
gebundenen superparamagnetischen Teilchen, wobei das Gel eine
Teilchengröße im Bereich von 1 bis 10 µm hat und einen Gehalt
an superparamagnetischen Teilchen im Bereich von 10 bis 80
Gew.-%,
hergestellt durch Vermischung einer wäßrigen Alkalisilicatlö
sung mit einer Suspension in Wasser oder in mit Wasser misch
baren Lösungsmitteln von superparamagnetischen Eisenoxidteil
chen der Formel FexOy, worin 2,0 ≦ x ≦ 3,5 und 3,0 ≦ y ≦ 4,5 gilt, oder
von superparamagnetischen Ferritteilchen, wobei die Teilchen
eine Teilchengröße von 10 bis 600 nm haben,
und Zugabe einer C1-C6-Alkansäure bei einer Temperatur im Be
reich von 20 bis 95°C in einer Zeit von 1 Minute bis 24 Stun
den bis zu einem pH-Wert im Bereich von 9 bis 2.
Unter Nukleinsäuren werden im Sinne der Erfindung oligomere
und polymere Ribonukloetide bzw. 2'-Desoxyribonukleotide ver
standen mit einer Kettenlänge von mehr als 10 Monomereinhei
ten. Die Monomereinheiten in Nukleinsäuren sind über Phosphor
säurediesterbindungen zwischen der 3'- und 5'-Hydroxylgruppe
benachbarter Monomereinheiten verknüpft und an das 1'-Atom der
jeweiligen Kohlenhydratkomponente ist glycosidisch eine hete
rocyclische Base gebunden. Nukleinsäuren können durch Ausbil
dung von intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen Doppel-
und Dreifachstränge ausbilden.
Unter Kieselgel oder Silicagel im Sinne der Erfindung wer
den amorphe Kondensationsprodukte monomerer Kieselsäure ver
standen. Ihre grundlegenden Synthesestrategien sind dem Fach
mann hinlänglich bekannt [Gmelin, Teil Silizium B S. 422 ff.].
Diese hochmolekularen Kondensationsprodukte finden eine sehr
breite Anwendung als Adsorbentien in verschiedenen chromato
graphischen Trenn- und Reinigungsoperationen.
Bevorzugte Anteile an superparamagnetischen Teilchen,
bezogen auf das Gesamtgewicht des Gels, liegen im Bereich von
30 bis 60 Gew.-%.
Für die vorliegende Erfindung wird vorteilhaft als Alkali
silicat Natriumsilicat d. h. Wasserglas eingesetzt.
Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform des Adsorp
tionsmaterial der Erfindung ist zusätzlich durch funktionelle
Gruppen modifiziert, wobei diese Gruppen ausgewählt sein kön
nen unter Amino-, Azido-, Carboxy-, Aldehyd, Phosphoräuremo
noester-, Phosphorsäurediester-, Thiol- und Hydroxygruppen.
Besonders bevorzugt sind Carboxy-, Phosphoräuremonoester- und,
Phosphorsäurediestergruppen.
Das Adsorptionsmaterial liegt normalerweise in getrockneter
und amorph zerkleinerter Form vor und kann entweder in dieser
Form oder als wäßrige Suspension verwendet werden.
Die Teilchengröße der superparamagnetischen Eisenoxide oder
Ferrite liegt vorzugsweise im Bereich von 30 bis 100 nm.
Es wurde gefunden, daß die Adsorptionseigenschaften des
Materials, insbesondere für die Adsorption von Nukleinsäuren,
durch die Reaktionsführung bei der Fällung des Kieselgels
gezielt durch Wahl des Fällungsmittels entscheidend beeinflußt
werden kann. Besonders geeignete Fällungsmittel sind Alkansäu
ren mit C2-C4 Kohlenstoffatomen, insbesondere Essigsäure oder
Propionsäure, oder Gemische davon.
Die Temperatur bei dieser Reaktion liegt vorteilhaft zwi
schen 40 und 90°C. Der Zeitraum für die Ausfällung des super
paramagnetischen Kieselgelmaterials mittels der Alkansäure
liegt vorzugsweise im Bereich von 5 Minuten bis 15 Stunden.
Die Ausfällung erfolgt vorteilhaft unter Bewegung der im
Gemisch vorhandenen Substanzen, insbesondere unter Rühren.
Durch Führung des pH-Regimes aus dem stark alkalischen
Bereich der Alkalisilicatlösungen auf Werte zwischen pH 9 und
pH 2, vorzugsweise pH 8 bis pH 3, erhält man ein superparamag
netisches Kieselgel, mit dem eine selektive Desorption von DNA
und RNA und damit Trennung von DNA und RNA möglich ist. Da
durch kann dieses Kieselgel zur Isolierung von Gesamtnuklein
säuren und getrennten Analyse von DNA und RNA, wie es z. B. in
der Virusdiagnostik erforderlich ist, verwendet werden.
Desweiteren sind die erfindungsgemäßen Kieselgelpartikel
durch die Einschlüsse von superparamagnetischem Material bei
der Einwirkung von externen Magnetfeldern aus heterogenen
Gemischen abtrennbar, wodurch Filtrations- oder Zentrifuga
tionsoperationen nicht erforderlich sind und damit der Ar
beits- und Zeitaufwand zur Isolierung der Nukleinsäuren we
sentlich verkürzt wird.
Im einfachsten Fall zur Synthese der erfindungsgemäßen
Partikel finden als superparamagnetische Substanzen die oben
definierten Eisenoxide Anwendung, vorzugsweise solche, in
denen 2 ≦ x ≦ 3,5 insbesondere x = 3 ist und y vorzugsweise 3
≦ y ≦ 4,5, insbesondere y = 4 ist. Diese Substanzen können
beispielsweise aus Eisensalzlösungen hergestellt werden, die
ein eingestelltes, der Stöchiometrie des Eisenoxides entspre
chendes Verhältnis von Eisen(II)- und Eisen(III)-Ionen haben.
Durch Eintragen in Lösungen von Hydroxiden insbesondere wäß
rigen Laugen oder durch schrittweises Steigern des pH-
Wertes der Eisensalzlösungen bis zu einem Wert um pH 9-10
mittels Hydroxiden, insbesondere wäßriger Lösungen dieser
Hydroxide, werden die Eisenoxidpartikel gefällt. Als superpa
ramagnetische Trägersubstanzen sind natürlich auch andere
Materialien denkbar, sofern sie den für eine effiziente Ab
trennung notwendigen Paramagnetismus besitzen und in einer für
die Herstellung des Kieselgels erforderlich Teilchengröße zu
erhalten sind.
Weitere Materialien mit superparamagnetischen Eigenschaften
können beispielsweise sein Erdalkaliferrite wie Bariumhexafer
rit oder andere Ferrite, speziell auch Kombinationen von Me
talloxiden. Einige der im Sinne der Erfindung verwendbaren
superparamagnetischen Materialien sind von Hilpert [Chem. Ber.
42 (1909) 2248] beschrieben und diskutiert worden.
Es ist besonders hervorzuheben, daß bei dem erfindungsgemä
ßen Adsorptionsmaterial Kieselgel und superparamagnetische
Teilchen physikalisch nicht mehr voneinander zu trennen sind.
Die auf diese Weise gewonnenen Kieselgele sind wie übliche
Kieselgele wasch-, trocken- und zerkleinerbar, ohne daß nach
einem oder mehrerer dieser Schritte eine Trennung von Kiesel
gel und superparamagnetischem Material erfolgt.
Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind
die oben definierten superparamagnetischen Teilchen in poröse
Polymere eingebettet. Die Teilchengröße der eingebetteten
Teilchen liegt allgemein im Bereich von 0,1 bis 10 µm.
Das poröse Polymere ist ein organisches oder anorganisches
poröses Polymeres, insbesondere ein anorganisches Polymeres,
wie zum Beispiel ein poröses Kieselgel.
Die porösen Polymerteilchen mit dem eingebetteten superpa
ramagnetischen Material bilden vorzugsweise eine Kugelform
oder nahezu eine Kugelform.
Das Adsorptionsmaterial dieser Ausführungsform der Erfin
dung läßt sich besonders gut handhaben und ist sowohl als
Trockenmaterial als auch als Suspension sehr leicht resuspen
dierbar.
Die Herstellung dieser eingebetteten Teilchen kann durch
Einlagerung von superparamagnetischen Eisensalzlösungen bzw.
-suspensionen in einem porösen Polymermaterial und Ausfällen
des Kieselgels in Anwesenheit der wäßrigen Alkalisilicatlösun
gen und der C1-C6-Alkansäuren erfolgen.
Erfindungsgemäß werden die Adsorptionseigenschaften des
Kieselgels anders als beim stand der Technik ausschließlich
durch die Reaktionsführung bei der Herstellung des Kieselgels
bestimmt. Für den direkten Einsatz der Kieselgele als Adsor
bentien ist eine Nachbehandlung und/oder der Zusatz von zu
sätzlichen eigenschaftsbestimmenden Komponenten zum Reaktions
gemisch der Herstellung, wie etwa Boraten oder Aluminaten u.ä.
nicht erforderlich. Selbstverständlich ist jedoch eine nach
trägliche Modifizierung der Oberfläche der Kieselgelpartikel
zum Erzielen bestimmter Eigenschaften, etwa dem Tragen von
Ankergruppen zum kovalenten Binden von Biomolekülen möglich.
Die erfindungsgemäßen Adsorptionsmaterialien können für die
Adsorption einer Vielzahl von organischen Molekülen eingesetzt
werden. Weiterhin können an das Material spezifische Liganden,
wie Biotin, oder Proteine, wie Antikörper, gebunden werden.
Die Erfindung betrifft auch eine bevorzugte Verwendung der
superparamagnetischen Kieselgele, indem man sie zur Festpha
senextraktion von Nukleinsäuren in flüssiger Phase einsetzt
und dabei das superparamagnetische Kieselgel mit oligomeren
und/oder polymeren Ribonukleotiden oder 2'-Desoxyribonukleoti
den mit einer Kettenlänge von mehr als 10 Monomereinheiten in
Kontakt bringt,
ein Magnetfeld an das erhaltene Produkt anlegt und den im Magnetfeld separierten Komplex superparamagnetisches Kiesel gel/Nukleinsäuren vom Rest des Gemisches abtrennt, und die Nukleinsäuren von dem superparamagnetischen Kieselgel durch quantitatives Eluieren mit Wasser oder einer wäßrigen Pufferlösung niedriger Ionenstärke abtrennt.
ein Magnetfeld an das erhaltene Produkt anlegt und den im Magnetfeld separierten Komplex superparamagnetisches Kiesel gel/Nukleinsäuren vom Rest des Gemisches abtrennt, und die Nukleinsäuren von dem superparamagnetischen Kieselgel durch quantitatives Eluieren mit Wasser oder einer wäßrigen Pufferlösung niedriger Ionenstärke abtrennt.
Bevorzugt abgetrennt werden Fragmenten einer Polymerase-
Kettenreaktion mit einer Größe von 50 bis 20000 Basenpaaren,
insbesondere Fragmente mit einer Größe von 100 bis 3000 Ba
senpaaren.
Die Abtrennung von Nukleinsäuren, ausgewählt aus der Grup
pe, die aus genomischen, viralen, episomalen, bakteriellen
Nukleinsäuren mit einer Größe von mehr als 100 Basenpaaren be
steht ist ebenfalls bevorzugt.
Der Einsatz der superparamagnetischen Kieselgele in Kontakt
mit einer komplexen biologischen Flüssigkeit, insbesondere mit
Vollblut, Plasma oder Serum, oder mit einem biochemischen,
insbesondere molekularbiologischen Reaktionsgemisch, wie Liga
tionsansätzen, PCR-Gemischen, Markierungsansätzen, ist ein
besonders bevorzugtes Anwendungsgebiet der Erfindung.
Der Kontakt mit den abzutrennenden Nukleotiden kann in
Anwesenheit von chaotropen Puffern, anderen Hochsalzpuffern,
organischen wassermischbaren Lösungsmitteln oder wasserlösli
chen Polymeren erfolgen.
Als chaotrope Puffer sind zu nennen Lösungen von Guanidin
thiocyanat mit einer Konzentration von 4M bis 7M, vorzugsweise
6M, oder von Ammoniumthiocyanat mit einer Konzentration von 4M
bis 6M.
Als Hochsalzlösungen sind zu nennen Lösungen von Natrium
jodid oder -perchlorat mit einer Konzentration von 4M bis 8M,
vorzugsweise 8M.
In Anwesenheit von organischen mit Wasser mischbaren Lö
sungsmitteln, wie beispielsweise niedere aliphatische Alkoho
le, wie Ethanol, Propanol, Isopropanol, oder von Ketonen wie
Aceton lassen sich noch weiter verbesserte Bindungseigenschaf
ten der Nukleinsäuren einstellen.
Zu den zugesetzten wasserlöslichen Polymeren gehören ins
besondere Polyethylenglycole, aber auch Derivate der Polyvi
nylalkohole, sofern sie in Wasser und organischen Lösungsmit
teln löslich sind, wie beispielsweise Polyvinylalkohol-Vinyl
sulfonsäure-Addukte.
Da überraschenderweise die Adsorptionseigenschaften für Nu
kleinsäuren der erfindungsgemäßen Kieselgele praktisch einge
stellt werden können und zwar in der Art, daß während des
Elutionsprozesses bei Bedarf die Desoxyribonukleinsäuren se
lektiv von den Ribonukleinsäuren getrennt werden können, wird
ein besonderes Anwendungsgebiet erschlossen, nämlich die Un
tersuchung von biologischen Flüssigkeiten (Plasma, Seren, Blut
etc.) auf unterschiedliche Viren.
Erfindungsgemäß kann die Elution der adsorbierten Desoxy
ribonukleinsäuren bei Temperaturen zwischen 10 und 40°C, ins
besondere bei Temperaturen von 20 bis 25°C und die der adsor
bierten Ribonukleinsäuren bei Temperaturen von 40 bis 80 °C
insbesondere bei Temperaturen von 50 bis 60°C erfolgen. Damit
ist eine selektive Trennung beider Komponenten nach gemeinsa
mer Adsorption aus der Probenmatrix unter den entsprechenden
chaotropen Bindungspuffern möglich.
Die superparamagnetischen Eigenschaften des beschriebenen
Kieselgels gestatten nach Adsorption der Nukleinsäuren an der
Oberfläche des Kieselgels, die Abtrennung des Komplexes Kie
selgel/Nukleinsäure aus der Probenmatrix mittels magnetischer
Felder unter Umgehung von zeit-, material-, arbeits- und ener
gieaufwendigen Filtrations-, Sedimentations- und/oder Zentri
fugationsschritten. Damit ist dieses superparamagnetische
Kieselgel besonders für den Einsatz in automatisierten Syste
men geeignet.
Als Magneten zur Abscheidung des superparamagnetischen
Adsorptionsmaterials sind übliche Permanentmagneten geeignet,
insbesondere solche mit höheren Feldstärken, wie Seltenerd
magneten, z. B. Neodym-Eisen-Bor-Magneten.
Eine weitere Anwendungsform der Erfindung ist ein Kit zur
manuellen oder automatischen Isolierung von Nukleinsäuren,
wobei der Kit ein superparamagnetisches Kieselgel enthält,
bestehend aus einem amorphen Kondensationsprodukt monomerer
Kieselsäure mit einem darin fein verteilten superparamagneti
schen Eisenoxid der allgemeinen Formel FexOy, worin 2,0 ≦ x ≦ 3,5
und 3,0 ≦ y ≦ 4,5 gilt, oder einem superparamagnetischen Ferrit,
jeweils mit einer Teilchengröße von 10 bis 600 nm. Zusätzlich
enthält der Kit auch Bindungs-, Wasch- und Elutionspuffer. Das
superparamagnetische Kieselgel kann als Festsubstanz oder als
Suspension vorliegen.
Die Erfindung soll nun anhand von einigen repräsentativen
Beispielen erläutert werden, ohne natürlich die Anwendung auf
diese Beispiele zu beschränken.
9,9 g Eisen(II )chlorid (FeCl2 × 4H2O) und 27 g Eisen(III )chlorid
(Fecl3 × 6H2O) wurden in 500 ml Wasser gelöst. Diese Lösung wurde
in 500 ml 2molare Natronlauge tropfenweise eingebracht. Nach
Beendigung der Fällungsreaktion konnte das ausgefallene Eisen
oxid über Zentrifugation abgetrennt werden. Es schloß sich ein
wiederholtes Waschen mit Wasser und Zentrifugieren bis zur
Neutralität des Überstandes an. Das auf diese Weise erhaltene
Eisenoxid ist direkt zur Synthese der superparamagnetischen
Kieselgele geeignet oder kann getrocknet und zu einem späteren
Zeitpunkt verwendet werden. Die mittlere Teilchengröße betrug
80 nm.
Zu 10 ml einer Suspension von superparamagnetischem Eisenoxid
im Wasser mit einem Gehalt von 0,1 g pro Milliliter wurden 10 ml
einer Natriumsilikatlösung (Dichte ≅ 1,39 g/ml) gegeben. Das
Reaktionsgemisch wurde auf 50°C erwärmt, und durch Eintragen
von Eisessig über einen Zeitraum von 10 Minuten fällte man des
Kieselgel vollständig, verdünnte anschließend die erhaltene
Suspension mit 100 ml Wasser und saugte den ausgefallenen
Niederschlag ab. Bei der Fällung mit Eisessig wurde zum Ende
der Reaktion der pH Wert geprüft und dafür Sorge getragen, das
er den Wert 2 nicht unterschritt.
Das Produkt wurde wiederholt mit Wasser gewaschen und so
von den Nebenprodukten der Reaktion gereinigt. Dem schloß sich
das Trocknen des Produktes im Trockenschrank bei 120°C an.
Zu 50 µl eines PCR-Reaktionsgemisches, welches ein 539 Basen
paare langes Fragment aus dem Plasmid pKS (Position 2000 bis
1461) enthält, wurden 120 µl einer 8molaren Lösung von Natrium
perchlorat in Wasser gegeben. Zu dieser Mischung gab man 10 µl
einer Suspension der im Beispiel 2 hergestellten Kieselgelpar
tikel mit einem Gehalt von 0,2 mg/µl. Das Gemisch wurde 5 Minu
ten stehen gelassen, anschließend die Magnetpartikel mit der
gebundenen Nukleinsäure an der Gefäßwand mit einem Permanent
magneten festgehalten und der Überstand abgegossen. Die Ma
gnetpartikel wurden zweimal in 100 µl 70%igen Ethanol resuspen
diert und jedesmal mittels Magneten an der Gefäßwand gesammelt
und die Waschlösung abgegossen. Dem schloß sich das Trocknen
der Partikel an der Luft bei Raumtemperatur über 10 Minuten
an.
Die gereinigten PCR-Fragmente wurden mit 20 µl Wasser von
den Magnetpartikeln im Verlauf von 5 Minuten eluiert.
In der Körperflüssigkeit, aus der die Nukleinsäure isoliert
werden soll, wurden mittels eines Lyseschrittes mit Proteinase
K die Zellen zerstört und hochmolekulare Proteine zu oligome
ren Peptiden verdaut.
Zu 50 µl der betreffenden Lysates wurden 120 µl eines Bindungs
puffers bestehend aus einer 6M Lösung von Guanidinthiocyanat,
gegeben. Beide Flüssigkeiten wurden gut durchmischt und mit
10 µl einer Suspension des im Beispiel 2 hergestellten Kiesel
gels (Gehalt 0,4 mg/µl) versetzt und ebenfalls durchmischt. Der
Komplex Nukleinsäure/Kieselgel wurde durch Anlegen eines Per
manentmagneten an der Gefäßwand konzentriert und der Überstand
verworfen. Nach 2maligem Waschen des Kieselgels mit 70%igen
wäßrigem Ethanol und 10minütigem Trocknen bei Raumtemperatur
konnten die an das Kieselgel gebundenen Desoxyribonukleinsäu
ren in 20 µl bei Raumtemperatur Wasser eluiert werden. Die
nachfolgende Elution der Ribonukleinsäure erfolgte mit 20 µl
RNAse-freiem Wasser bei 55°C.
Claims (19)
1. Superparamagnetisches Adsorptionsmaterial, gekennzeichnet
durch ein Kieselgel auf Basis von Alkalisilicaten mit darin
eingebundenen superparamagnetischen Teilchen, wobei das Gel
eine Teilchengröße im Bereich von 1 bis 10 µm hat und einen
Gehalt an superparamagnetischen Teilchen im Bereich von 10 bis
80 Gew.-% aufweist, bezogen auf das Gesamtgewicht des Gels,
hergestellt durch Vermischung einer wäßrigen Alkalisilicatlö
sung mit einer Suspension in Wasser oder in mit Wasser misch
baren Lösungsmitteln von superparamagnetischen Eisenoxidteil
chen der Formel FexOy, worin 2,0 ≦ x ≦ 3,5 und 3,0 ≦ y ≦ 4,5 gilt, oder
von superparamagnetischen Ferritteilchen, wobei die Teilchen
eine Teilchengröße von 10 bis 600 nm haben,
und Zugabe einer C1-C6-Alkansäure bei einer Temperatur im Be
reich von 20 bis 95°C in einer Zeit von 1 Minute bis 24 Stun
den bis zu einem pH-Wert im Bereich von 9 bis 2.
2. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich
net, daß es zusätzlich durch funktionelle Gruppen modifiziert
ist, ausgewählt unter Amino-, Azido-, Carboxy-, Aldehyd, Phos
phoräuremonoester-, Phosphorsäurediester-, Thiol- und Hydroxy
gruppen.
3. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich
net, daß es in getrockneter und amorph zerkleinerter Form
vorliegt.
4. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich
net, daß das Alkalisilicat Natriumsilicat ist, insbesondere
eine Natronwasserglaslösung.
5. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich
net, daß die Alkansäure eine C2-C4-Alkansäure ist.
6. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich
net, daß die Alkansäure Essigsäure oder Propionsäure ist.
7. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich
net, daß die Teilchengröße der superparamagnetischen Eisen
oxide oder Ferrite im Bereich von 30 bis 100 nm liegt.
8. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich
net, daß die Temperatur bei der Alkansäurezugabe mehr als 40
°C beträgt.
9. Adsorptionsmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 8, da
durch gekennzeichnet, daß die superparamagnetischen Teilchen
in poröse Polymere eingebettet sind und die Teilchengröße der
Polymeren mit den eingebetteten Teilchen im Bereich von 0,1
bis 10 µm liegt.
10. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 9, dadurch gekennzeich
net, daß das poröse Polymere ein anorganisches Polymeres ist,
insbesondere ein poröses Kieselgel.
11. Adsorptionsmaterial nach Anspruch 9 oder 10, dadurch ge
kennzeichnet, daß die porösen Polymerteilchen mit dem einge
betteten superparamagnetischen Material eine Kugelform oder
nahezu Kugelform aufweisen.
12. Verwendung eines superparamagnetischen Kieselgels gemäß
Anspruch 1 bis 11, indem man zur Festphasenextraktion von
Nukleinsäuren in flüssiger Phase das superparamagnetische Kie
selgel mit oligomeren und/oder polymeren Ribonukleotiden oder
2'-Desoxyribonukleotiden mit einer Kettenlänge von mehr als 10
Monomereinheiten in Kontakt bringt,
ein Magnetfeld an das erhaltene Produkt anlegt und den im
Magnetfeld separierten Komplex superparamagnetisches Kiesel
gel/Nukleinsäuren vom Rest des Gemisches abtrennt,
und die Nukleinsäuren von dem superparamagnetischen Kieselgel
durch quantitatives Eluieren mit Wasser oder einer wäßrigen
Pufferlösung niedriger Ionenstärke abtrennt.
13. Verwendung nach Anspruch 12 zur Abtrennung von Fragmenten
einer Polymerase-Kettenreaktion mit einer Größe von 50 bis
20000 Basenpaaren, vorzugsweise zur Trennung von Fragmenten
mit einer Größe von 100 bis 3000 Basenpaaren.
14. Verwendung nach Anspruch 12 zur Abtrennung von Nukleinsäu
ren, ausgewählt aus der Gruppe, die aus genomischen, viralen,
episomalen, bakteriellen Nukleinsäuren mit einer Größe von
mehr als 100 Basenpaaren besteht.
15. Verwendung nach Anspruch 12 in Kontakt mit einer komplexen
biologischen Flüssigkeit, insbesondere mit Vollblut, Plasma
oder Serum, oder einem biochemischen, insbesondere molekular
biologischen Reaktionsgemisch.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 15 in Kontakt
mit Nukleinsäuren und in Anwesenheit von chaotropen Puffern,
anderen Hochsalzpuffern, organischen wassermischbaren Lösungs
mitteln oder wasserlöslichen Polymeren.
17. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die Eluierung der an das Gel gebundenen Nukleinsäuren bei 10
bis 40°C für Desoxyribonukleinsäuren durchgeführt wird.
18. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die Eluierung der an das Gel gebundenen Nukleinsäuren bei (41)
bis 80°C für Ribonukleinsäuren durchgeführt wird.
19. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 18 mit einem
Kit zur manuellen oder automatischen Isolierung von Nukleoti
den, wobei der Kit ein superparamagnetisches Kieselgel ent
hält, bestehend aus einem amorphen Kondensationsprodukt mono
merer Kieselsäure mit einem darin fein verteilten superpara
magnetischen Eisenoxid der allgemeinen Formel FexOy, worin
2,0 ≦ x ≦ 3,5 und 3,0 ≦ y ≦ 4,5 gilt, oder einem superparamagnetischen
Ferrit, jeweils mit einer Teilchengröße von 10 bis 600 nm in
flüssiger Phase.
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