DE19834683A1 - Neue Lipopolyamine, deren Darstellung und Anwendung - Google Patents
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Description
Positiv geladene Lipide (J. P. Behr, Bioconjugate Chem. 5, 382-389, 1994) werden in Form
von Liposomen, Micellen oder als solche zur Einschleusung von biologisch aktiven Substanzen
wie Peptiden, Peptoiden, Proteinen, PNA, antiviralen Wirkstoffen insbesondere aber DNA,
RNA, Antisense-DNA/RNA oder Ribozymen in eukariotische Zellen (zum Beispiel Säuger-,
Pflanzen- oder Insektenzellen) eingesetzt. Lipopolyamine sind eine spezielle Klasse von
kationischen Lipiden, die vergleichsweise hervorragende Transfektionseigenschaften zeigen.
Unter Transfektion versteht man die Einschleusung von Erbmaterial in eukariotische Zellen.
Die Notwendigkeit DNA (zum Beispiel Plasmide, Cosmide, einzelsträngig oder doppelsträngig),
RNA oder verwandte Stoffklassen, wie Antisense-DNA/RNA oder Ribozyme in eukariotische
Zellen einzuführen, um beispielsweise erfolgreich Gentherapie betreiben zu können, führte zur
Entwicklung einer Vielzahl von Transfektionsmethoden. Zur Einführung von Nukleinsäuren in
eukariotische und insbesondere in Säugerzellen ist eine Vielzahl von Verfahren, wie zum
Beispiel die CaPO4-Präzipitationsmethode, die DEAE-Dextran-Methode, synthetische
Polyamine (Polyethylenimin, Polylysin, PAMAM-Dendrimere), Methoden, welche die
rezeptorvermittelte Endocytose nutzen, Elektroporation, Mikrobombardement, Mikroinjektion
und Verfahren, die virale Capside als DNA-Carrier benutzen, bekannt. Eine weitere Methode
wird Lipofektion (P. L. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 7413 1987) genannt.
Diese nützt die Tatsache, daß synthetische kationische Lipide in Form von Liposomen, Micellen
oder als solche mit der negativ geladenen DNA Komplexe bilden. Stellt man die
Mengenverhältnisse von DNA und kationischem Lipid so ein, daß die resultierenden Komplexe
eine positive Nettoladung tragen, so besitzen sie eine hohe Affinität zu der negativ geladenen
Membranoberfläche eukariotischer Zellen. Treffen solche DNA/Lipid-Komplexe auf Zellen, so
kommt es zu einer Einschleusung des genetischen Materials in die Zelle. Der genaue
Mechanismus, wie die DNA in die Zellen gelangt, ist noch weitgehend unbekannt, man
vermutet jedoch, daß es entweder zu einer Fusionierung der kationischen Lipide mit der
anionischen Zellmembran bei gleichzeitiger Ausschüttung der DNA in das Zellinnere kommt,
oder daß die DNA/Lipid-Komplexe als ganzes über einen natürlichen Transportmechanismus
der Zellen, die sogenannte Endozytose, in die Zelle gelangen und danach die DNA freigesetzt
wird.
Liposomen sind in der Regel kugelartige Anordnungen von Lipiden in wäßrigen Lösungen mit
"Bilayer-Struktur" und werden typischerweise in drei Klassifikationen eingeteilt (siehe N. Y.
Academy Sciences Meeting: "Liposomes and their use in Biology and Medicine" von
Dezember 1977): Multilamellare Vesikel (MLV, bis zu 10 000 nm), kleine unilamellare Vesikel
(SUV, 20-50 nm) und große unilamellare Vesikel (LUV, 600-30 000 nm). Eine Reihe von
Herstellungsmethoden für Liposomen ist bekannt und in "Liposome Technology" (Gregoriadis,
CFC Press, N. Y. 1984), in "Liposomes" (Ostro, Marcel Dekker, N. Y. 1987) oder in
Übersichtsartikeln von Lichtenberg et al. (Methods Biochem. Anal. 33, 337-462, 1988),
Pagano und Weinstein (Ann. Rev. Biophysic. Bioeng. 7, 435-68, 1978), oder Szoka und
Papahadjopoulos (Ann. Rev. Biophysic. Bioeng. 9, 467-508, 1980) beschrieben. Bekannte
Methoden sind beispielsweise die "reverse-phase evaporation"-Methode und die
Extrusionsmethode, bei der eine Lipidlösung durch eine mikroporöse Membran gepreßt wird.
Liposomen werden typischerweise auch auf folgendem Weg hergestellt: Die Lipide werden in
einem organischen Lösungsmittel aufgenommen. Durch Verdampfen des Lösungsmittels unter
einem Strom von Stickstoff wird an der Glasgefäßwand ein dünner Lipidfilm erzeugt. Zugabe
von Wasser oder wäßriger Pufferlösung hydratisiert diesen Film. Die erhaltene Lösung wird
zuletzt mit Ultraschall behandelt.
Kationische Lipide gewinnen zunehmende Bedeutung in der Gentherapie. Dabei werden in vivo
mit verschiedenen Verfahren Körperzellen transfektiert, indem Komplexe aus Carrier und DNA
intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, subkutan, intranasal, in Liquorräume
oder direkt in Tumore verabreicht werden oder Körperzellen entnommen, transfektiert und
wieder reimplantiert werden. Eine in diesem Zusammenhang favorisierte Methode war bis vor
einiger Zeit die Einbringung des genetischen Materials durch virale Carrier. Diese Methode
besitzt jedoch die Gefahr der Rückmutation zu einem pathogenen Virus. Des weiteren wird die
eingeschleuste DNA stabil in das Erbgut eingebaut, so daß eine Steuerung der Therapie oder
eine Rückführung der Zellen in ihren ursprünglichen Zustand nicht mehr möglich ist. Zudem
besitzen virale Carrier Restriktionen bezüglich der Größe der einzuschleusenden DNA.
Modifizierte DNA oder RNA wird durch Viren nicht übertragen. Außerdem können nur sich
teilende Zellen auf diesem Wege transfektiert werden.
Weitere Gefahren, die bei der Anwendung von viralen Carriersystemen zu berücksichtigen sind,
sind die mögliche Aktivierung von Oncogenen und eine Immunreaktion des behandelten
Organismus.
Die Transfektion mit kationischen Lipiden ist diesen Restriktionen hingegen nicht unterworfen.
Die Transfektion verläuft in der Regel transient, das heißt die transfektierte DNA oder RNA
wird nur für eine bestimmte Zeit exprimiert, da sie nicht in das Erbgut eingebaut wird und
durch Nukleasen mit der Zeit abgebaut wird. Auf diese Weise kann Gentherapie dosiert und
reversibel gemacht werden. Restriktionen bezüglich der Größe der DNA bestehen nicht und
auch modifizierte DNA oder RNA (z. B. Antisense-DNA/RNA oder durch Einbau modifizierter
Nukleotide stabilisierte Ribozyme) kann mittels kationischer Lipide in Zellen eingeschleust
werden. Auch sich nicht teilende Zellen, wie zum Beispiel Nervenzellen, können durch
kationische Lipide transfektiert werden. Des weiteren wurde bisher kein immunogenes Verhalten
von kationischen Lipiden bei in vivo Versuchen gefunden.
Während die in vivo-Anwendung von Mikroinjektion und Elektroporation aus
Verfahrensgründen nicht möglich erscheint, besitzen die CaPO4- und DEAE-Dextran-
Methoden verglichen mit der Lipofektion eine schlechtere Transfektionseffizienz.
Unter den kationischen Lipiden gibt es eine Klasse, die die bekannt hohe Affinität zwischen
Polyaminen (z. B. Spermin, Spermidin) und DNA zur Transfektion ausnützen, sogenannte
Lipopolyamide. Die Polyamine sind dabei linear oder verzweigt aufgebaut und enthalten
Ethylen-; Propylen-; oder Butylengruppen zwischen den Aminofunktionen. Die Polyamine sind
auf unterschiedlichste Weise mit einem lipophilen Rest verbunden.
Beispielsweise wird das bei physiologischem pH-Wert positiv geladene Spermin mit einem
hydrophilen Rest, in manchen Fällen über einen Spacer, verknüpft. Spermin bildet stabile
Komplexe mit DNA und ähnlichen Verbindungen, indem es über Wasserstoffbrückenbindung
in der Furche der DNA gebunden wird.
Die ersten solchen Liposperminderivate wurden von Behr, J. P. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86: 6982-6986; 1989; EP 0394111) synthetisiert. Dabei verknüpften sie Carboxyspermin
über einen Spacer mit zwei unterschiedlichen hydrophilen Resten. Die Struktur des dabei
erhaltenen 5-Carboxyspermylglycindioctadecylamid (DOGS) ist:
DOGS ist als Transfectam™ (Promega) kommerziell erhältlich.
Die zweite von Behr et al. entwickelte Verbindung ist Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-5-
carboxyspermylamid (DPPES):
Ein weiteres Liposperminderivat wird von P. L. Felgner et al. in WO 9116024 unter der
Bezeichnung L-Spermin-5-carboxyl-3-(DL-1,2-dioleoyldimethylaminopropyl-β-hydroxyethyl
amin) beansprucht. In der Patentschrift beschrieben ist jedoch L-Spermin-5-carboxyl-3-(DL-
1,2-dipalmitoyl-dimethylaminopropyl-β-hydroxyethylamin):
Gebeyehu, G. et al. beschreiben in WO 9405624 die Verbindung N-[N-(5-
Carboxyspermyl)aminoethyl] N, N-dimethyl-2,3-bis (9-octadecenyloxy) 1-propanammonium
tetra (trifluoracetat), welches kommerziell als Lipofectamin™ (Gibco-BRL: Life Technologies
Inc.) erhältlich ist.
Von Der Eltz et al. beschreiben in WO 9700241 die Verbindung 2-(6-Carboxy-spermyl)-1,3-
dioleoyloxy-propylamid, die unter dem Namen DOSPER auf den Markt gebracht wurde
(Boehringer Mannheim GmbH).
Die bisher genannten Verbindungen wurden alle über eine Amid- oder Esterverknüpfung eines
linearen Polyamins, welches eine Carboxyfunktion als Seitenkette trägt, i. e. von
Carboxyspermin zu einem lipophilen Rest hergestellt. Spätere Veröffentlichungen zeigen
schließlich auch andere Verknüpfungsweisen von linearen Polyaminen zu den lipophilen
Resten, z. B. durch eine Amid- oder Carbamatverknüpfung zu einer endständigen
Aminofunktion (lineare Struktur) oder inneren Aminofunktion ("T-shape-structure") des
linearen Polyamins. Beispiele finden sich in den Veröffentlichungen DE 19 63 189, WO
9640726, WO 9640725, WO 9618372, WO 9746223, WO 9802190 und WO 9802191.
Auch verzweigte Polyamine wurden beschrieben (G. Byk et al, J. Med. Chem., 41, 224-235,
1998).
Trotz großer Fortschritte auf dem Gebiet der Transfektion mittels kationischer Lipide, verbleibt
ein Bedarf an einer größeren Auswahl solcher Lipide. Der Grund dafür liegt darin, daß bis
heute kein kationisches Lipid gefunden wurde, daß mit allen Zelltypen befriedigende Ergebnisse
liefert. Da verschiedene Zelltypen sich in ihrer Membranzusammensetzung unterscheiden, ist es
nicht verwunderlich, daß verschiedene Kompositionen von Lipiden und verschiedenartige
Lipidtypen für eine effektive Transfektion unterschiedlicher Zellen benötigt werden.
Da über den eigentlichen Transfektionsschritt bis heute noch wenig bekannt ist, ist die
Entwicklung von neuen kationischen Lipiden weitgehend empirisch. Wichtige zu beachtende
Punkte für das Design solcher Lipide sollten daher ihre physikalische Eigenschaften bezüglich
der Ausbildung von Liposomen oder Micellen, die Eigenschaften der gebildeten Liposomen
oder Micellen, die Toxizität gegenüber den zu transfektierenden Zielzellen, des weiteren die
Stabilität der Lipide, deren Metabolisierbarkeit und die Möglichkeit einer in vivo-Anwendung
sein.
Die erfindungsgemäß zu lösende Aufgabe bestand also darin, neue kationische Lipide mit hoher
Wirksamkeit und möglichst breitem Wirkungsspektrum in Kombination mit guter Stabilität zu
finden. Bei der vorliegenden Erfindung wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die
Kombination von Polyaminen als Kopfgruppe mit einem speziellen lipophilen Rest zu besonders
guten Eigenschaften in Hinblick auf Effizienz und Stabilität führt:
Die Reste R sind dabei gesättigte oder ungesättigte Alkylketten, vorzugsweise mit 10 bis 20
Kohlenstoffatomen.
Als Erklärung mögen folgende Hypothesen dienen. Von besonderer Bedeutung für eine
erfolgreiche Transfektion hat sich die Bildung eines sogenannten DNA-Lipid-Komplexes
erwiesen. Beim Zusammentreffen von DNA und kationischen Lipiden, die als Liposomen- oder
Micellenformulierungen eingesetzt werden, kommt es zu einer spontanen Kondensation der
DNA unter Zusammenbruch der liposomalen oder micellenartigen Organisationsstruktur der
kationischen Lipide. Es bildet sich ein DNA-Lipid-Komplex aus, in dem die DNA in einem
multilamellaren Komplex mit "Bilayerstruktur" aus den besagten Lipiden eingebettet ist (J. O.
Rädler et al. Science, 275, 810, 1997). Ist z. B. die Spermingruppe als DNA-affine Kopfgruppe
erst einmal an die DNA gebunden, kommt somit der Flexibilität und Symmetrie des restlichen
Molekülteils (lipophiler Rest) besondere Bedeutung zu, da die Alkylgruppen in der Lage sein
müssen, sich möglichst parallel auszurichten, um über Van-der-Waals-Kräfte stabile "Bilayer-
Strukturen" ausbilden zu können.
Die bisher vorgeschlagenen Verbindungen sind in der Regel wenig symmetrisch aufgebaut, was
eine parallele Ausrichtung der Alkylreste erschwert, und beinhalten allesamt Ester, Ether oder
Amidverknüpfungen zwischen den Alkylresten und einem Grundgerüst bzw. einem Spacer.
Diese Verbindungen sind daher in ihrer Flexibilität auf Grund der festgelegten Bindungswinkel
und im Falle von Amidverknüpfungen (z. B. bei Verbindungen aus G. Byk et al, J. Med.
Chem., 41, 224-235, 1998, EP 0394111, WO 9618372, WO 9746223, WO 9802190 und WO
9802191) auf Grund vorhandener Resonanzstrukturen stark eingeschränkt.
In der Resonanzstruktur für Amide trägt das O-Atom eine negative und das Amid-N-Atom eine
positive Ladung. Es resultiert eine planare Anordnung der an der Amidbindung beteiligten
Atome. Eine freie Rotation der Amidbindung zwischen Carbonyl-Kohlenstoff und dem
Stickstoffatom ist nicht möglich. Diese Eigenschaft wirkt sich beispielsweise in ganz besonderer
Weise auf die Struktur von Proteinen aus. (Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur), deren
Peptidbindungen nichts anderes als Amidverknüpfungen sind. Erst die starren, nichtflexiblen
Amidverknüpfungen geben dem Protein seine biologisch notwendige Struktur.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen (siehe auch unten) verknüpfen die Alkylreste über ein
tertiäres Stickstoffatom (Amin). Damit ist eine hohe Symmetrie und durch die Möglichkeit des
"Durchschwingens" des freien Elektronenpaares (Pseudorotation) am Stickstoffatom maximale
Flexibilität gewährleistet. Somit besteht bei diesen Verbindungen die optimale Voraussetzung
zur parallelen Ausrichtung der Alkylreste (trotz an der DNA fest verankerter Kopfgruppen) und
somit zur Bildung stabiler DNA-Lipid-Komplexe, was eine möglichst große Überlappung der
van der Waals-Regionen der Alkylgruppen voraussetzt.
Eine weitere Erklärungsmöglichkeit für die besonders guten Eigenschaften der beanspruchten
Verbindungen besteht darin, daß diese Verbindungen auf Grund des nicht an der
DNA-Komplexbildung beteiligten basischen Stickstoffatoms, welches die Alkylreste trägt,
Pufferungsvermögen im physiologischen pH-Bereich besitzen. Diese Eigenschaft fördert auf
dem Weg der Endocytose die osmotische Zerstörung der Endosomen, so daß die DNA um so
besser in das Zytosol freigesetzt wird (J. P. Behr, Gene Therapy, 3, 1010-1017, 1996).
Die vorliegende Erfindung betrifft somit neue Lipopolyamine der allgemeinen Formel I, die in
der Lage sind, biologisch aktive Moleküle in eukariotische Zellen zu transportieren:
Formel I:
Formel I:
die bei Vorhandensein eines Asymmetriezentrums in der D-, L- oder DL-Form vorliegen,
einschließlich ihrer Salze, wobei
R1 ein lipophiler Rest folgender allgemeinen Formel ist:
R1 ein lipophiler Rest folgender allgemeinen Formel ist:
in welcher R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl,
Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl, Octadecenyl oder andere Alkylreste, die in allen
möglichen Kombinationen gesättigt, ungesättigt, verzweigt, unverzweigt, fluoriert oder nicht
fluoriert sein können, und aus 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 oder 30 Kohlenstoffatomen aufgebaut sind,
und X eine der folgenden Gruppierungen ist:
und X eine der folgenden Gruppierungen ist:
ist,
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können,
oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können,
oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können,
oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 oder l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können,
oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können,
oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können.
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können,
oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können,
oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können,
oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 oder l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können,
oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können,
oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können.
Von besonderem Interesse sind dabei Verbindungen und ihre Salze mit folgenden Strukturen:
wobei h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, l = 0, 1, 2, 3, 4, 5
oder 6 und wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können, R2 und R3 unabhängig voneinander
Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder
Octadecenyl sein können.
Von ganz besonderem Interesse ist dabei folgende Verbindung und ihre Salze:
Von weiterem besonderen Interesse sind Formulierungen die Liposomen oder Micellen
enthalten, die diese Verbindungen kombiniert mit Colipiden oder ohne Colipide, wie z. B.
Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Dioleoylphosphatidylcholin, Cholesterol oder
Cholesterylamin enthalten.
Von weiterem besonderen Interesse sind Verfahren zum Einbringen von biologisch wirksamen
Verbindungen, wie DNA, RNA, Ribozymen, Antisense-DNA, PNA, Peptiden, Peptoiden und
Proteinen in eukariotische Zellen, wobei die genannten Verbindungen oder Formulierungen mit
den einzubringenden Verbindungen komplexieren und die entstandenen Komplexe mit
eukariotischen Zellen in vivo oder in vitro in Kontakt gebracht werden.
Von weiterem besonderen Interesse ist die Verwendung der genannten Verbindungen oder
Formulierungen als Reagenz oder Medikament oder als Bestandteil von einem Reagenz oder
Medikament zum Einbringen von biologisch wirksamen Verbindungen, wie DNA, RNA,
Ribozymen, Antisense-DNA, PNA, Peptiden, Peptoiden und Proteinen in eukariotische Zellen
in vivo oder in vitro.
Von weiterem besonderen Interesse ist die Verwendung der genannten Verbindungen oder
Formulierung als Reagenz oder Medikament oder als Bestandteil von einem Reagenz oder
Medikament zum Einbringen von biologisch wirksamen Verbindungen, wie DNA, RNA,
Ribozymen, Antisense-DNA, PNA, Peptiden, Peptoiden und Proteinen in eukariotische Zellen
in vivo oder in vitro in Kombination mit sogenannten "Enhancern", die deren Wirkung
verstärken.
Die erfindungsgemäßen Lipide enthalten also Polyamine als DNA-affine Kopfgruppen, die über
einen Spacer an einen speziellen lipophilen Rest gebunden sind.
Ein besonderer Wert der erfindungsgemäßen Lipide liegt in ihrer Stabilität in Lösung, bei
gleichzeitiger geringer Toxizität für die Zelle in Kombination mit außergewöhnlich guten
Transfektionseigenschaften.
So konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen, im Vergleich mit
Lipofectamin™ (Gibco-BRL: Life Technologies Inc.), dem bis dato in der Fachwelt anerkannt
wirksamsten Transfektionsreagenz aus der Gruppe der Lipopolyamine, bessere
Transfektionseigenschaften besitzen, wenn sie die gleiche Kopfgruppe tragen. Die
Transfektionseffizienz ist dabei nicht nur jeweils im serumfreien und serumhaltigen Milieu
höher, sondern es zeigt sich auch, daß ein hohes Niveau bezüglich Transfektionseffizienz über
ein wesentlich breiteres DNA-Lipid-Verhältnis erreicht werden kann.
Nachstehend wird ein allgemeiner Syntheseweg am Beispiel einer der ganz besonders
interessanten Verbindungen, von N-[2,5-Bis [(3-aminopropyl) amino]-1-oxopentyl]- N',N'-
dioctadecylethylendiamin, erläutert.
Dabei wird von N-tert.-Butyloxycarbonyl-geschütztem (BOC-geschütztem) Alkylendiamin
ausgegangen. Die freie Aminogruppe wird durch Alkylbromide in Anwesenheit einer Base
derivatisiert. Anschließend wird die zweite im Molekül vorhandene Aminofunktion deblockiert
und an BOC-geschütztes Carboxypolyalkylamin (hier BOC-geschütztes Carboxyspermin)
gekuppelt. Nach deblockieren dieser Kopfgruppe erhält man die gewünschten Verbindungen, je
nach Aufarbeitung als freies Amin oder in Form ihrer Salze.
Eine weitere bevorzugte Verbindung ist N,N-Bis-(3-aminopropyl)-N',N'-
dioctadecylethylendiamin. Diese Verbindung wird ausgehend von N-tert.-
Butyloxycarbonylethylendiamin (BOC-Ethylendiamin) durch umsetzen mit Acrylnitril,
Alkylierung mit Alkylbromid und anschließender Hydrierung gewonnen. Die anschließenden
Schritte dienen der Aufreinigung.
Ein alternativer Weg zum gleichen Molekül ist die Alkylierung von N,N-
Dioctadecylethylendiamin mit N-BOC-3-brompropylamin:
Nach folgendem altbekanntem Reaktionsschema, das im übrigen auch im vorigen Beispiel
enthalten ist, können durch Wahl geeigneter Bedingungen, die Polyaminkopfgruppen
verlängert, oder auch verzweigte Polyaminkopfgruppen erzeugt werden. Dabei besteht die
Möglichkeit die Kopfgruppe einzeln zu erzeugen und anschließend an den lipophilen Rest zu
kuppeln oder schon gekuppelte Kopfgruppen am Molekül zu erweitern.
Als explizites Beispiel soll die Umsetzung von Ornithin mit Acrylnitril dienen. Über die Menge
an Acrylnitril und der richtigen Wahl der Reaktionstemperatur kann das gewünschte Produkt als
Hauptmenge erhalten werden. Die Hydrierung der Nitrile zu den Aminen und dessen Schutz
durch die BOC-Schutzgruppe werden nach J. P. Behr et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86,
pp. 6982-6986, 1989 analog der Synthese von Tetra-BOC-Carboxyspermin durchgeführt.
Eine weitere Möglichkeit zur Verlängerung und Verzweigung der Polyaminkopfgruppen besteht
in der Alkylierung von Aminen durch N-(tert.-Butyloxycarbonyl)-3-brompropylamin:
Allgemein können sämtliche aufgeführte Lipide mit den in den Beispielen aufgeführten
Methoden (Blockieren und Deblockieren von Aminofunktionen mit der BOC-Schutzgruppe,
Alkylierung von Aminofunktionen mit Alkylbromiden, Knüpfen von und Amidbindungen
analog bekannter Peptidchemie, Cyanoethylierung von Aminofunktionen via Acrylnitril,
Hydrierung von Cyanofunktionen zu Aminen) oder mit dem organischen Chemiker vertrauten,
allgemein bekannten Methoden (Alkylierung von Alkoholen, Knüpfen von Esterbindungen,
Reduktion von Estern zu Ethern bzw. von Amiden zu Aminen via Lithiumalanat) erzeugt
werden.
Bezüglich der Verbindungen, die die zwei zuletzt beanspruchten Spacer enthalten, sei auf WO
9802191 verwiesen. Hier wird beschrieben, wie Ester und Amide mit Lithiumalanat zu Ethern
und Aminen reduziert werden können, ohne die BOC-Schutzgruppe anzugreifen. Auf diesem
Wege resultieren solche Verbindungen aus den entsprechenden Vorläufern.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als solche in wäßriger oder wäßriger Puffer-
oder ethanolischer Lösung angewendet werden. Es können jedoch auch Liposomen (oder
Micellen) mit oben genannten Lipiden allein, oder in Kombination mit anderen Lipiden wie
zum Beispiel Cholesterol, Cholesterylamin, Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) oder
Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) formuliert werden.
Um die Transfektionseffizienz der erfindungsgemäßen Lipide zu steigern, besteht die
Möglichkeit, Zellen in Gegenwart von Substanzen zu transfektieren, die die enzymatische
Aktivität in den Lysosomen inhibieren, sogenannte lysosomatotrope Substanzen, wie zum
Beispiel Chloroquin oder von Viren abgeleitete lysosomatropisch wirkende Proteine.
Weiter besteht die Möglichkeit sogenannte Enhancer in Kombination mit den kationischen
Lipiden einzusetzen. Enhancer verstärken die Wirkung der kationischen Lipide. Dabei gibt es
Enhancer, die selbst keine transfizierenden Eigenschaften besitzen und solche die auch ohne
kationische Lipide zur Transfektion verwendet werden können. Im ersten Fall kommt es zu
einer einfachen Verstärkung (Amplifikation) der Transfektionseffizienz der kationischen Lipide.
In letzterem Fall zeigt sich in kombinierter Anwendung eine Transfektionseffizienz die größer
ist als bei Einzelanwendung. Die Kombinationswirkung kommt daher durch einen
Synergieeffekt zustande. Enhancer entfalten ihre Wirkung in der Regel durch eine
Vorkondensation der zu transfizierenden DNA oder sie Erhöhen die Permeabilisierbarkeit der
zu durchdringenden Zellmembran. Beispiele für Enhancer sind Polyethylenimin, Transferrin,
Protaminsulfat, Polyhistone, fusogene Peptide, Virushüllen, virale Oberflächenpeptide,
replikationsdefiziente Viren usw.
Die erfindungsgemäßen Lipopolyamine sind bei physiologischem pH positiv geladen und
können daher mit negativ geladenen Makromolekülen, insbesondere mit DNA und verwandten
Stoffklassen stabile Aggregate Bilden. Die mit den Lipopolyaminen bemäntelten und
positivierten Makromoleküle wechselwirken mit der negativ geladenen Zellmembran auf eine
Weise, die zu einer Einschleusung der Makromoleküle in die Zelle führt. Dabei sind in vitro als
auch in vivo Anwendungen möglich.
Im Vergleich zur zielgerichteten rezeptorvermittelten Endocytose (Wu et al., J. Chem. 262,
4429-4432, 1987), in denen Polykationen, welche auch DNA-Binder genannt werden (zum
Beispiel Polylysin etc.) an sogenannte Internalisierungsfaktoren (zum Beispiel bestimmte
Glykoproteine) gebunden sind, die zielgerichtet an Oberflächenrezeptoren bestimmter Zellen
binden, besitzen die erfindungsgemäßen Lipide, bzw. deren Liposomenformulierungen keine
Zellspezifität. Eine zielgerichtete Lieferung durch die erfindungsgemäßen Lipide bzw. deren
Liposomenformulierungen kann dadurch erreicht werden, daß die Ladungen von Lipiden und
den zu transportierenden Biomolekülen ausgeglichen werden und zusätzlich an das Aggregat
zwischen Biomolekül und Lipiden Internalisierungsfaktoren angebracht werden. Dies kann zum
Beispiel durch Liposomenformulierung mit Colipiden erreicht werden, falls die Colipide als
Kopfgruppe solche Internalisierungsfaktoren tragen. Eine andere Möglichkeit ist ein auf
Ladungsneutralität abgestimmtes Aggregat aus Biomolekül, Lipiden und Internalisierungs
faktoren. Sogenannte Internalisierungsfaktoren sind Transferrin, Galactose, Mannose,
Mannose-6-phosphat, Asialglycoprotein, Conalbumin, Lectine, Transcobalamin, α-2-
Makroglobulin, Biotin, Folat, mannosylierte Glycoproteine. Weitere sind in EP 0535576, EP
0544292, WO 9421808 zu entnehmen, die hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden.
Analog wie Internalisierungsfaktoren, können auch zellspezifische Antikörper eingesetzt
werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zu Therapiezwecken eingesetzt werden.
Insbesondere können solche Verbindungen für die Gentherapie von zum Beispiel Cystischer
Fibrose, Muskeldystrophie, Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie,
Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel, Hypercholesterinämie, Hämophilie und
β-Thalassämie genutzt werden. Gentherapeutische Behandlungsmethoden sind weiters interessant,
wenn Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytotoxine oder immunomodulierend wirkende Proteine
im Organismus synthetisiert werden sollen. Für die oben genannten Zwecke können DNA-
Fragmente mittels dieser Lipide in Zellen gebracht werden, in denen diese DNA die gewünschte
Wirkung entfaltet. Die gewünschte Wirkung kann der Ersatz fehlender oder defekter DNA-
Bereiche oder die Inhibition von DNA-Bereichen (zum Beispiel Antisense-DNA/RNA), die
die Erkrankung auslösen, im erkrankten Zelltyp sein. Auf diese Weise können
tumorunterdrückende Gene in der Krebs-Therapie eingesetzt werden oder durch die
Einführung cholesterolregulierender Gene ein Beitrag zur Vorbeugung von Herz- und
Blutgefäßkrankheiten leisten. Weiter kann DNA, welche Ribozyme kodiert, oder Ribozyme
selbst in erkrankte Zellen eingeschleust werden. Die Translation jener DNA erzeugt aktive
Ribozyme, die an spezifischen Stellen m-RNA katalytisch spalten und auf diese Weise die
Transkription verhindern. Auf diese Weise kann zum Beispiel virale m-RNA spezifisch
gespalten werden, ohne eine andere zelluläre m-RNA in Mitleidenschaft zu ziehen. Der
Vermehrungszyklus von Viren (z. B. HIV, Herpes, Hepatitis) kann auf diesem Wege
unterbrochen werden.
Auch in der Krebstherapie spielt Transfektion zur Herstellung von Krebsvakzinen eine immer
größer werdende Rolle. Damit ist dieses Feld auch mögliches Anwendungsgebiet für die
erfindungsgemäßen Verbindungen.
Eine weitere Anwendung können solche Lipide zum Beispiel in Impfverfahren finden, die auf
der Basis der Expression von DNA, welche immunogene Peptide kodiert, im Körper von
Mensch und Tier funktionieren. Dazu werden Lipid/DNA-Komplexe als Impfstoffe benutzt.
Die Einschleusung der DNA in die Körperzellen führt zur Expression des immunogenen
Peptids und löst somit die Immunantwort aus.
Abgesehen von DNA können auch andere Makromoleküle, wie zum Beispiel PNA, Peptide,
Peptoide oder Proteine, in Zellen eingeschleust werden. Zu diesem Zweck können sie mit den
erfindungsgemäßen Lipopolyaminen als solche bemäntelt werden oder in Liposomen, welche
als Komponente die erfindungsgemäßen Lipopolyamine enthalten, eingeschlossen oder an
deren Oberfläche adsorbiert werden, falls eine negative Nettoladung vorhanden ist. Bringt man
derartige Aggregate mit Zellen in Kontakt, so findet ein Transport dieser Moleküle durch die
Zellwand statt. Therapeutische Peptide haben einen günstigen Einfluß auf zahlreiche
Erkrankungen. Solche Peptide oder Proteine sind zum Beispiel Lymphokine, Interleukine,
Tumore Nekrose Faktoren oder Interferone, weiterhin Wachstumsfaktoren,
Gewebeplasminogenaktivator, Faktor-VIII:c, Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-
stimulierender Faktor, Erythropoietin, Insulin, Calcitonin, Thymidinkinase und andere. Auch
toxische Peptide wie Ricin, Diphteriatoxin und andere können therapeutisch auf diese Weise
gewinnbringend eingesetzt werden. Peptoide können erfolgreich als Peptidanaloga zur
Verhinderung eines schnellen enzymatischen Abbaus im Körper eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Lipide werden auf Grund ihrer positiven Ladung vorwiegend dazu
eingesetzt, negativ geladene Moleküle wegen ihrer negativen Ladung zu komplexieren und in
Zellen einzuschleusen. Durch sogenannte "self assembling systems" können jedoch auch positiv
geladene Moleküle transportiert werden, in dem zunächst negativ geladene Liposomen mit
diesem positiv geladenen Molekülen komplexiert werden. Wählt man die Verhältnisse so, daß
eine negative Nettoladung verbleibt, können diese Komplexe mit diesen erfindungsgemäßen
Lipopolyaminen als solche oder in Form von Liposomen positiviert werden, in dem die
gegensätzlich geladenen Komponenten in Kontakt gebracht werden. Die resultierenden positiv
geladenen Gesamtkomplexe werden von den Zellen aufgenommen.
Weitere Anwendungsmöglichkeiten für kationische Lipide sind den Veröffentlichungen WO
9011092, WO 9116024, WO 9303768, Science 258, 744-746, 1992 zu entnehmen, die hierin
unter Bezugnahme aufgenommen werden.
Beispiele für derzeit als therapeutisch aussichtsreich anzunehmende Sequenzen genetischen
Materials sind in der Übersicht von F. W. Anderson, Science 256, 808, 1992 entnehmbar, die
ebenfalls hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden.
Bezugsquellen:
1. Plasmide: pCMV<Sport<β-Gal; Gibco BRL, Life Technologies
2. β-Galaktosidase-Assay-Kit, Stratagene
3. Tetra-BOC-Carboxyspermin wurde nach J.-P. Behr et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, pp. 6982-6986, (1989) synthetisiert.
4. Lipofectamin™; Gibco-BRL: Life Technologies Inc.
5. N-tert.-Butyloxycarbonylethylendiamin, Aldrich.
6. O-(tert.-Butoxycarbonyl)-phenylglyoxyl-säurenitriloxim (BOC-ON); Aldrich.
7. N'-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid Methojodid (EDC), Aldrich.
8. 1-Hydroxy-1H-benzotriazol (HOBT), Aldrich.
9. 4-Methylmorpholin, Diisopropylethylamin (DIPEA), Triethylamin, Aldrich.
10. Trifluoressigsäure (TFA), Aldrich.
11. Dulbecco's modified Eagels Medium (DMEM), Gibco-BRL: Life Technologies Inc.
12. Fötales Kälberserum (FCS), Biochrom.
13. Penicillin, Streptomycin, SIGMA.
1. Plasmide: pCMV<Sport<β-Gal; Gibco BRL, Life Technologies
2. β-Galaktosidase-Assay-Kit, Stratagene
3. Tetra-BOC-Carboxyspermin wurde nach J.-P. Behr et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, pp. 6982-6986, (1989) synthetisiert.
4. Lipofectamin™; Gibco-BRL: Life Technologies Inc.
5. N-tert.-Butyloxycarbonylethylendiamin, Aldrich.
6. O-(tert.-Butoxycarbonyl)-phenylglyoxyl-säurenitriloxim (BOC-ON); Aldrich.
7. N'-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid Methojodid (EDC), Aldrich.
8. 1-Hydroxy-1H-benzotriazol (HOBT), Aldrich.
9. 4-Methylmorpholin, Diisopropylethylamin (DIPEA), Triethylamin, Aldrich.
10. Trifluoressigsäure (TFA), Aldrich.
11. Dulbecco's modified Eagels Medium (DMEM), Gibco-BRL: Life Technologies Inc.
12. Fötales Kälberserum (FCS), Biochrom.
13. Penicillin, Streptomycin, SIGMA.
646 mg (1.94 mmol, MG 333.4) Octadecylbromid, 135 mg (0.84 mmol, Mg 160.22) N-tert.-
Butyloxycarbonylethylendiamin (BOC-ethylendiamin) und 332 µl (1.94 mmol, MG 129.25, d
0.755) Diisopropylethylamin (DIPEA) werden in 10 ml Acetonitril gelöst und über Nacht unter
Rückfluß gekocht. Nach Zugabe von 100 ml Ether wird mit Wasser gewaschen. Die organische
Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und die Lösungsmittel abgezogen. Das schon
relativ saubere Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.
C43H88O2N2
MG 664.12
Rf = 0.44 (9 : 1 v/v Chloroform/Methanol)
MS (FAB): 665.7 (M + 1)
1H-NMR (CDCl3):
0.88 (tr, 6 H, CH3); 1.26 ("s", 60 H, CH2); 1.40 (m, 4 H, N-CH2CH 2); 1.44 (s, 9 H, CH3BOC); 2.40 (tr, 4 H, N-CH2); 2.50 (tr, 2 H, N-CH2); 3.15 (m, 2 H, OCO-N-CH2).
13C-NMR (CDCl3):
13.1 (CH3); 22.7, 27.0, 25.5 (CH2); 28.5 (CH3BOC); 29.4, 29.6 29.7, 29.7 (CH2); 53.2 (N- CH2); 54.0 (N-CH2); 78.9 (CqBOC); 156.1 (OCO).
Ausbeute: 390 mg (69%)
C43H88O2N2
MG 664.12
Rf = 0.44 (9 : 1 v/v Chloroform/Methanol)
MS (FAB): 665.7 (M + 1)
1H-NMR (CDCl3):
0.88 (tr, 6 H, CH3); 1.26 ("s", 60 H, CH2); 1.40 (m, 4 H, N-CH2CH 2); 1.44 (s, 9 H, CH3BOC); 2.40 (tr, 4 H, N-CH2); 2.50 (tr, 2 H, N-CH2); 3.15 (m, 2 H, OCO-N-CH2).
13C-NMR (CDCl3):
13.1 (CH3); 22.7, 27.0, 25.5 (CH2); 28.5 (CH3BOC); 29.4, 29.6 29.7, 29.7 (CH2); 53.2 (N- CH2); 54.0 (N-CH2); 78.9 (CqBOC); 156.1 (OCO).
Ausbeute: 390 mg (69%)
157 mg (0.236 mmol, MG 665.12) N-tert.-Butyloxycarbonyl-N',N'-Dioctadecylethylendiamin
werden in 4 ml eines 1 : 3 v/v Gemisches aus Trifluoressigsäure (TFA) und Methylenchlorid
aufgenommen. Nach 2-3 h wird abrotriert und 0.5 h am Hochvakuum getrocknet.
Anschließend wird in 6 ml eines 1 : 1 v/v Gemisches aus DMF und Methylenchlorid
aufgenommen und mit 300 µl 4-Methylmorpholin versetzt. Anschließend werden 152.6 mg
(0.236 mmol, MG 646.8) Tetra-BOC-Carboxyspermin in 2 ml eines 1 : 1 v/v Gemisches aus
Dimethylformamid (DMF) und Methylenchlorid gelöst und zugegeben. Weiterhin werden 45 mg
(0.330 mmol) 1-Hydroxy-1H-benzotriazol (HOBT) und 98 mg (0.330 mmol) N'-(3-
Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid Methojodid (EDC) zugegeben und 50 h bei RT
gerührt. Die Lösungsmittel werden abrotiert und der Rückstand in Methylenchlorid
aufgenommen. Danach wird mit Wasser gewaschen, die organische Phase mit Natriumsulfat
getrocknet und abrotiert. Das Rohprodukt wird über Flashchromatographie gereinigt.
C51H136N6O9
MG 997,65
Rf = 0.40 (9 : 1 v/v Methylenchlorid/Methanol)
1H-NMR (CDCl3):
0.88 (tr, 6 H, Ch3); 1.25 ("s", 64 H, CH2); 1.44 (m, 36 H, CH3BOC); 1.67 (m, 8 H, Spermin: CH2CH 2CH2); 236 (mr, 4 H, Stearyl: N-CH2); 2.51 (m, 2 H, Ethylendiamin: N-CH2); 3.1-3.25 (m, 10 H, OC-N-CH2).
Ausbeute: 135 mg (59%)
C51H136N6O9
MG 997,65
Rf = 0.40 (9 : 1 v/v Methylenchlorid/Methanol)
1H-NMR (CDCl3):
0.88 (tr, 6 H, Ch3); 1.25 ("s", 64 H, CH2); 1.44 (m, 36 H, CH3BOC); 1.67 (m, 8 H, Spermin: CH2CH 2CH2); 236 (mr, 4 H, Stearyl: N-CH2); 2.51 (m, 2 H, Ethylendiamin: N-CH2); 3.1-3.25 (m, 10 H, OC-N-CH2).
Ausbeute: 135 mg (59%)
70 mg N-[Tetra-tert.-butyloxycarbonyl-[(2,5-bis(3-aminopropyl)amino)-1-oxopentyl]]- N',N'-
dioctadecylethylendiamin werden in 2 ml eines Gemisches aus Methylenchlorid und
Trifluoressigsäure (3 : 1 v/v) gelöst und 1.5 h bei RT gerührt. Danach wird abrotiert, in 10 ml
eines Gemisches aus Wasser/tert.-Butanol (1 : 1 v/v) aufgenommen und lyophilisiert.
C53H104ON6 (× 4 CF3COOH)
MG 793.52 (+ 4 × 114 = 1249.52)
Ausbeute: 100%
C53H104ON6 (× 4 CF3COOH)
MG 793.52 (+ 4 × 114 = 1249.52)
Ausbeute: 100%
500 mg (3.12 mmol, MG 160.22) N-tert.-Butyloxycarbonylethylendiamin werden in 5 ml
Wasser gelöst und 0.65 ml (9.8 mmol, MG 53.06) Acrylnitril zugegeben. Danach wird 7 Tage
bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird mit Essigester überschichtet, ausgeschüttelt und die
organische Phase abgetrennt. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird abrotiert.
C13H22O2N4
MG 266.34
Rf = 0.69 (9 : 1 v/v Chloroform/Ethanol)
Ausbeute: 660 mg (80%)
C13H22O2N4
MG 266.34
Rf = 0.69 (9 : 1 v/v Chloroform/Ethanol)
Ausbeute: 660 mg (80%)
660 mg (2.48 mmol, MG 266.34) N',N'-Bis-(2-cyanoethyl)-N-tert.-butyloxycarbonylethylen
diamin werden in 10 ml eines 1 : 3 v/v Gemisches aus Trifluoressigsäure und Methylenchlorid
aufgenommen. Nach 2-3 h wird abrotriert und 0.5 h am Hochvakuum getrocknet. Danach wird
aus Butanol/Wasser (1 : 1 v/v) lyophilisiert. Das erhaltene Trifluoracetat wird in 40 ml trockenen
Acetonitril zusammen mit 2.43 g (7.28 mmol, MG 333.4) Octadecylbromid und 2.23 ml (1.68 g,
13.02 ml, MG 129.25, d 0.755) Diisopropylethylamin (DIPEA) gelöst und 24 Stunden unter
Rückfluß gekocht. Das Rohprodukt wird über Flashchromatographie gereinigt.
C44H86N4
MG 671.16
Rf = 0.42 (9 : 1 v/v Methylenchlorid/Methanol)
1H-NMR (CDCL3):
0.88 (tr, 6 H, CH3); 1.26 ("s", 60 H, CH2); 1.42 (m, 4 H, N-CH2CH 2) 2.42 (m, 4 H, N-CH2); 2.48 (tr, 4 H, CH2-CN); 2.50 (m, 2 H, N-CH2); 2.50 (m, 2 H, N-CH2); 2.92 (tr, 4 H, N-CH2).
Ausbeute: 330 mg (20%)
C44H86N4
MG 671.16
Rf = 0.42 (9 : 1 v/v Methylenchlorid/Methanol)
1H-NMR (CDCL3):
0.88 (tr, 6 H, CH3); 1.26 ("s", 60 H, CH2); 1.42 (m, 4 H, N-CH2CH 2) 2.42 (m, 4 H, N-CH2); 2.48 (tr, 4 H, CH2-CN); 2.50 (m, 2 H, N-CH2); 2.50 (m, 2 H, N-CH2); 2.92 (tr, 4 H, N-CH2).
Ausbeute: 330 mg (20%)
2.5 g Raney-Nickel werden zu 50 ml Wasser gegeben. Dazu wird unter Rühren 4.5 g
Natriumhydroxid so schnell zugegeben, daß das Wasser gerade nicht überkocht und
anschließend eine halbe Stunde gerührt. 320 mg (0.48 mmol, MG 671.2) N',N'-Bis-(2-
cyanoethyl)-N,N-dioctadecylethylendiamin werden in 500 ml 0.5 M Kaliumhydroxidlösung (in
EtOH/Wasser 95 : 5 v/v) aufgenommen. Das aktivierte Raney-Nickel wird vom Überstand durch
abdekantieren getrennt und zur Eduktlösung gegeben. Danach wird 24 Stunden an einer
Hydrieranlage hydriert. Nach Einrotieren des Lösungsmittels wird der Rückstand in 5 ml
Methylenchlorid gelöst. Dazu werden 500 mg (2.02 mmol, MG 246.27) O-(tert.-
Butoxycarbonyl)-phenylglyoxyl-säurenitriloxim (BOC-ON) gegeben und bei Raumtemperatur
24 Stunden gerührt. Danach wird einrotiert. Das Rohprodukt wird über Flashchromatographie
gereinigt. Danach wird das Produkt in 10 ml eines 1 : 3 v/v Gemisches aus Trifluoressigsäure
und Methylenchlorid aufgenommen. Nach 2-3 h wird abrotriert und 0.5 h am Hochvakuum
getrocknet. Zuletzt wird aus Butanol/Wasser (1 : 1 v/v) lyophilisiert.
C44H94N4 × 4 CF3COOH
MG 679.21 (+4 × 114 = 1135.21)
MS (ESI): 680.2
Ausbeute: 250 mg (58% bezogen auf Nitril)
C44H94N4 × 4 CF3COOH
MG 679.21 (+4 × 114 = 1135.21)
MS (ESI): 680.2
Ausbeute: 250 mg (58% bezogen auf Nitril)
500 mg (2.28 mmol; MG 218.94) 3-Brom-1-propylamin Hydrobromid (Aldrich) werden
zusammen mit 1.13 (4.59 mmol; MG 246.27) O-(tert.-Butoxycarbonyl)-phenylglyoxyl
säurenitriloxim (BOC-ON) und 0.65 ml (0.46 g; 4.6 mmol) Triethylamin in einem Gemisch aus
Aceton und Wasser (1 : 1, v/v) gelöst. Nach 2 Stunden Rühren wird eingeengt und in
Methylenchlorid aufgenommen. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, mit
Natriumsulfat getrocknet und einrotiert. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie
gereinigt.
C8H16O2NBr
MG 238.31
Rf = 0.84 (9 : 1 v/v Methylenchlorid/Methanol)
1H-NMR (CDCl3):
1.36 (br s, 9 H, CH3BOC); 1.98 (m, 2 H, C-CH2-C); 3.19 (M, 2 H, Br-CH 2); 3.38 (m, 2 H, N-CH2); 4.90 (br s, 1 H, N-H).
13C-NMR (CDCl3):
28.2 (CH3); 30.6, 32.6, 38.8 (CH2); 79.1 (Cq); 155.8 (C=O).
Ausbeute: 250 mg (46%)
C8H16O2NBr
MG 238.31
Rf = 0.84 (9 : 1 v/v Methylenchlorid/Methanol)
1H-NMR (CDCl3):
1.36 (br s, 9 H, CH3BOC); 1.98 (m, 2 H, C-CH2-C); 3.19 (M, 2 H, Br-CH 2); 3.38 (m, 2 H, N-CH2); 4.90 (br s, 1 H, N-H).
13C-NMR (CDCl3):
28.2 (CH3); 30.6, 32.6, 38.8 (CH2); 79.1 (Cq); 155.8 (C=O).
Ausbeute: 250 mg (46%)
200 mg (0.3 mmol, MG 665.12) N-tert.-Butyloxycarbonyl-N',N'-dioctadecylethylendiamin
werden in 2 ml eines Gemisches aus Trifluoressigsäure und Methylenchlorid (1 : 3 v/v) gelöst.
Nach zwei Stunden wird abrotiert und 2 Stunden im Hochvakuum getrocknet. Danach wird in
20 ml Chloroform aufgenommen und 1 ml (920 mg, 4.5 mmol, MG 101.15, d = 0.92)
4-Methylmorpholin zugegeben. Anschließend werden 640 mg (2.68 mmol, MG 238.13) N-(tert.-
Butyloxycarbonyl)-3-brompropylamin zugegeben. Nach 48 Stunden Kochen unter Rückfluß
wird einrotiert und das BOC-geschützte Vorläuferprodukt durch Flashchromatographie
gereinigt. Abschließend wird in 2 ml eines Gemisches aus Trifluoressigsäure und
Methylenchlorid (1 : 3 v/v) gelöst, einrotiert und lyophilisiert.
C44H94N4 × 4 CF3COOH
MG 679.21 (+4 × 114 = 1135.21)
MS (ESI): 680.2
Ausbeute: 46 mg (13%)
C44H94N4 × 4 CF3COOH
MG 679.21 (+4 × 114 = 1135.21)
MS (ESI): 680.2
Ausbeute: 46 mg (13%)
950 mg Natriumhydroxid werden in 20 ml Wasser gelöst. In der Natronlauge werden 2 g
(11.86 mmol, MG 168.62) Ornithin Hydrochlorid gelöst. Danach werden 3 ml (45.57 mmol)
Acrylnitril zugetropft und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Zugabe von 1.7 ml
25%iger Salzsäure fällt ein Feststoff aus. Dieser wird nach Kühlung abgenutscht.
C14H21O2H5 × HCl
MG 327.82
Rf = 0.71 (1 : 1 : 1 v/v/v Isopropanol/Ethanol/Wasser)
1H-NMR (D2O):
1.58 (m, 2 H, CH 2-CHOrn); 1.90 (m, 2 H, CH2Orn); 2.61 (m, 6 H, NC-CH 2); 2.86 (tr, 4 H, N-CH2); 2.98 (tr, 2 H, N-CH2-CH 2); 3.39 (tr, 2 H, N-CH2); 368 (tr, 1 H, CHOrn).
Ausbeute: 2.1 g (54%)
C14H21O2H5 × HCl
MG 327.82
Rf = 0.71 (1 : 1 : 1 v/v/v Isopropanol/Ethanol/Wasser)
1H-NMR (D2O):
1.58 (m, 2 H, CH 2-CHOrn); 1.90 (m, 2 H, CH2Orn); 2.61 (m, 6 H, NC-CH 2); 2.86 (tr, 4 H, N-CH2); 2.98 (tr, 2 H, N-CH2-CH 2); 3.39 (tr, 2 H, N-CH2); 368 (tr, 1 H, CHOrn).
Ausbeute: 2.1 g (54%)
980 mg Natriumhydroxid werden in 20 ml Wasser gelöst. In der Natronlauge werden 2 g
(11.86 mmol, MG 168.62) Ornithin Hydrochlorid gelöst. Danach werden 3.9 ml (59.3 mmol)
Acrylnitril zugetropft und 8 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Danach werden nochmals 3 ml
Acrylnitril zugetropft und weitere 6 Stunden gerührt. Nach der Zugabe von 1.7 ml 25%iger
Salzsäure wird das Produkt 3 × mit Essigester ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über
Natriumsulfat getrocknet und einrotiert.
C17H24O2N6 × HCl
MG 344.4182
Rf = 0.84 (1 : 1 : 1 v/v/v Isopropanol/Ethanol/Wasser)
1H-NMR (D2O):
1.60 (m, 2 H, CH 2-CHOrn); 1.92 (m, 2 H, CH2Orn); 2.52 (m, 8 H, NC-CH 2); 2.61 (tr, 4 H, CH2Orn); 2.87 (tr, 4 H, N-CH2); 3.03 (tr, 4 H, N-CH2); 3.38 (m, 1 H, CHOrn).
Ausbeute: 2.4 g (59%)
C17H24O2N6 × HCl
MG 344.4182
Rf = 0.84 (1 : 1 : 1 v/v/v Isopropanol/Ethanol/Wasser)
1H-NMR (D2O):
1.60 (m, 2 H, CH 2-CHOrn); 1.92 (m, 2 H, CH2Orn); 2.52 (m, 8 H, NC-CH 2); 2.61 (tr, 4 H, CH2Orn); 2.87 (tr, 4 H, N-CH2); 3.03 (tr, 4 H, N-CH2); 3.38 (m, 1 H, CHOrn).
Ausbeute: 2.4 g (59%)
Dioleoylphosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatidylcholin, Cholesterol oder Cholesteryl
amin werden in einem organischen Lösungsmittel (z. B. Chloroform) gelöst. Das Lipid aus
Beispiel 1 wird als solches in Form seines Salzes, zum Beispiel Trifluoracetat-Salzes in
einem organischen Lösungsmittel (z. B. Chloroform) gelöst. Durch Kombination verschiedener
Mengen der unterschiedlichen Lösungen werden verschiedene Kompositionen aus Colipiden
und kat. Lipid hergestellt. In einem Glaskolben wird mit Hilfe eines Rotationsverdampfers ein
dünner Lipidfilm erzeugt. Dieser wird im Hochvakuum von Lösungsmittelresten befreit. Der
Film wird mit soviel Wasser oder wäßriger Pufferlösung hydratisiert, daß die Konzentration
2 mg Lipid pro ml Lösung beträgt. Danach wird unter Kühlung mit Ultraschall (3 × 15 min)
behandelt. Die Formulierung wird durch einen Filter (Porenweite 0.2 µm) sterilfiltriert.
Die Lipide werden als solches und in Form ihrer TFA-Salze mit oder ohne Colipiden in Ethanol
gelöst. Durch Mischen mit Wasser erhält man Lösungen unterschiedlicher
Zusammensetzungen.
Die Zelllinien CV-1, Hela S3 und NIH 3T3 werden in "Dulbecco's-modified Eagle's medium"
(DMEM), das 10% fötales Kälberserum (FBS), 2 mM L-Glutamin (Gln), 0.1 mM nicht
essentielle Aminosäuren (NEAA), 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin enthält, in
einem Inkubator (5% CO2-Atmosphäre) kultiviert.
Die Zellen werden auf einer 12-Well-Mikrotiterplatte mit einer Dichte von 1-1.5 × 105
ausplattiert und über Nacht zu annähernd 60-80% Konfluenz inkubiert. Um die Zellen in
einem "Well" zu transfizieren, werden 1.5 µg von pCMV<Sport<β-Gal in 50 µl serum- und
antibiotikafreiem DMEM gelöst. Das kationische Lipid (z. B. 3, 6, 9, 12 µl) als ethanolische
Lösung oder Liposomenformulierung wird ebenfalls in 50 µl serum- und antibiotikafreiem
DMEM gelöst. Die beiden Lösungen werden in einem Polystyrolbehälter gemischt und für 10-15 min
stehengelassen, um die Bildung des Lipid/DNA-Komplexes zu ermöglichen.
Während dessen werden die Zellen einmal mit PBS (phosphate buffered saline) gewaschen. Je
nach gewünschten Bedingungen (Transfektion im serumfreien oder serumhaltigen Milieu)
werden 0.4 ml antibiotikafreies DMEM mit oder ohne Serum zu den Zellen gegeben. Der
DNA/Lipid-Komplex wirkt direkt zu den Zellen gegeben und im Brutschrank 6 h inkubiert.
Danach wird mit serum- und antibiotikahaltigem DMEM in der Weise auf 1 ml aufgefüllt, daß
das Medium eine Endkonzentration von 10% Serum enthält. Die Zellen werden weitere 20 h
kultiviert. Danach wird auf β-Galactosidase nach den Angaben des Herstellers des
β-Galaktosidase-Assay-Kits getestet. Das entwickelte O-Nitrophenol wird photometrisch bei 405 nm
vermessen.
Folgende Tabelle und folgendes Balkendiagramm zeigen Transfektionseffizienzen am Beispiel
von Hela S3 Zellen im Vergleich.
Transfektionsreagenz 1:
N-[2,5-Bis((3-aminopropyl)amino)-1-oxopentyl]-N',N'-dioctadecylethylen-diamin (TFA-Salz) wurde als Liposomenformulierung mit 25 Mol-% Dioleoylphosphatidylethanolamin in wäßriger steriler Lösung eingesetzt. Gesamtlipidmenge: 2 mg/ml.
N-[2,5-Bis((3-aminopropyl)amino)-1-oxopentyl]-N',N'-dioctadecylethylen-diamin (TFA-Salz) wurde als Liposomenformulierung mit 25 Mol-% Dioleoylphosphatidylethanolamin in wäßriger steriler Lösung eingesetzt. Gesamtlipidmenge: 2 mg/ml.
Transfektionsreagenz 2:
N',N'-Bis-(3-aminopropyl)- N,N-dioctadecylethylendiamin (TFA-Salz) wurde als Liposomenformulierung mit 50 Mol-% Dioleoylphosphatidylethanolamin in wäßriger steriler Lösung eingesetzt. Gesamtlipidmenge: 2 mg/ml.
N',N'-Bis-(3-aminopropyl)- N,N-dioctadecylethylendiamin (TFA-Salz) wurde als Liposomenformulierung mit 50 Mol-% Dioleoylphosphatidylethanolamin in wäßriger steriler Lösung eingesetzt. Gesamtlipidmenge: 2 mg/ml.
Transfektionsreagenz 3:
Lipofectamin™ (Gibco-BRL: Life Technologies Inc.) wurde vom Hersteller erworben.
Lipofectamin™ (Gibco-BRL: Life Technologies Inc.) wurde vom Hersteller erworben.
Claims (16)
1. Verbindungen der allgemeinen Formel I:
Formel I:
die bei Vorhandensein eines Asymmetriezentrums in der D-, L- oder DL-Form vorliegen, einschließlich ihrer Salze, wobei
R1 ein lipophiler Rest folgender allgemeiner Formel ist:
in welcher R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl, Octadecenyl oder andere Alkylreste, die in allen möglichen Kombinationen gesättigt, ungesättigt, verzweigt, unverzweigt, fluoriert oder nicht fluoriert sein können, und aus 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 oder 30 Kohlenstoffatomen aufgebaut sind,
und X eine der folgenden Gruppierungen ist:
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für den Fall g = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können.
In allen vorstehenden Fällen soll b kleiner oder gleich 1 sein, wenn a = 0 ist und f kleiner oder gleich 1 sein, wenn e = 0 ist.
Formel I:
die bei Vorhandensein eines Asymmetriezentrums in der D-, L- oder DL-Form vorliegen, einschließlich ihrer Salze, wobei
R1 ein lipophiler Rest folgender allgemeiner Formel ist:
in welcher R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl, Octadecenyl oder andere Alkylreste, die in allen möglichen Kombinationen gesättigt, ungesättigt, verzweigt, unverzweigt, fluoriert oder nicht fluoriert sein können, und aus 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 oder 30 Kohlenstoffatomen aufgebaut sind,
und X eine der folgenden Gruppierungen ist:
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für den Fall g = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können.
In allen vorstehenden Fällen soll b kleiner oder gleich 1 sein, wenn a = 0 ist und f kleiner oder gleich 1 sein, wenn e = 0 ist.
2. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein kann und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein kann und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
3. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
wobei h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
4. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
wobei r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
5. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
wobei k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
6. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
wobei k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
7. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein kann und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein kann und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
8. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein kann und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein kann und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
9. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
wobei l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
10. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein kann und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein kann und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
11. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein kann und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein kann und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
12. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
13. Formulierungen, die Liposomen oder Micellen enthalten, die Verbindungen der Ansprüche
1-12 kombiniert mit Colipiden mit oder ohne Colipide, wie z. B.
Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Dioleoylphosphatidylcholin, Cholesterol oder
Cholesterylamin enthalten.
14. Verfahren zum Einbringen von biologisch wirksamen Verbindungen, wie DNA, RNA,
Ribozymen, Antisense-DNA, PNA, Peptiden, Peptoiden und Proteinen in eukariotische Zellen,
wobei Verbindungen oder Formulierungen nach einem der Ansprüche 1-13 mit den
einzubringenden Verbindungen komplexieren und die entstandenen Komplexe mit
eukariotischen Zellen in vivo oder in vitro in Kontakt gebracht werden.
15. Verwendung der Verbindungen oder Formulierungen nach einem der Ansprüche 1-13 als
Reagenz oder Medikament oder als Bestandteil von einem Reagenz oder Medikament zum
Einbringen von biologisch wirksamen Verbindungen, wie DNA, RNA, Ribozymen, Antisense-
DNA, PNA, Peptiden, Peptoiden und Proteinen in eukariotische Zellen in vivo oder in vitro.
16. Verwendung der Verbindungen oder Formulierungen nach einem der Ansprüche 1-13 als
Reagenz oder Medikament oder als Bestandteil von einem Reagenz oder Medikament zum
Einbringen von biologisch wirksamen Verbindungen, wie DNA, RNA, Ribozymen, Antisense-
DNA, PNA, Peptiden, Peptoiden und Proteinen in eukariotische Zellen in vivo oder in vitro in
Kombination mit sogenannten Enhancern, die deren Wirkung verstärken.
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