DE19823834A1 - Genetisches Verfahren zur Herstellung von Riboflavin - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein genetisches Verfahren zur Herstellung von Riboflavin. Durch die spezielle Auswahl von Genen der Riboflavinbiosynthese bzw. deren Kombination in Organismen, speziell in Bakterien, Pilzen, Hefen und Pflanzen und deren Expression, wird die Riboflavinproduktion in diesen Organismen gesteigert. DOLLAR A Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäurefragmente enthaltend Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 oder SEQ ID No. 5 oder deren funktionelle Äquivalente, Expressionsvektoren enthaltend die Nukleinsäurefragmente und Organismen enthaltend mindestens ein Nukleinsäurefragment oder mindestens einen Vektor.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein genetisches Verfahren zur Herstellung von Riboflavin. Durch die spezielle Auswahl von Genen der Riboflavinbiosynthese bzw. deren Kombination in Organismen speziell in Bakterien, Pilzen, Hefen und Pflanzen und deren Expression wird die Riboflavinproduktion in diesen Organismen gesteigert.

Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäurefragment enthaltend Gene mit den Sequenzen SEQ ID NO. 1, SEQ ID No. 3 oder SEQ ID No. 5 oder deren funktionellen Äquivalente, Expressionsvektoren enthaltend die Nukleinsäurefragmente und Organismen enthaltend mindestens ein Nukleinsäurefragment oder mindestens einen Vektor.

Vitamin-B2, auch Riboflavin genannt, wird von allen Pflanzen und einer Vielzahl von Mikroorganismen hergestellt. Für Mensch und Tier ist es essentiell, da sie nicht in der Lage sind, es zu synthetisieren. Riboflavin spielt eine wichtige Rolle im Meta­ bolismus. So ist es beispielsweise an der Verwertung von Kohlen­ hydraten beteiligt. Bei Vitamin B2-Mangel treten Entzündungen der Mund- und Rachenschleimhäute, Juckreiz und Entzündungen in den Hautfalten und ähnliche Hautschäden, Bindehautentzündungen, ver­ minderte Sehschärfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können Wachstumsstillstand und Gewichtsabnahme auf­ treten. Vitamin-B2 hat deshalb eine große wirtschaftliche Bedeu­ tung beispielsweise als Vitaminpräparat bei Vitaminmangel sowie als Futtermittelzusatz. Es wird verschiedensten Lebensmitteln zugesetzt. Daneben wird es auch als Lebensmittelfarbstoff, bei­ spielsweise in Mayonnaise, Eiscreme, Pudding etc. verwendet.

Die Herstellung von Vitamin B2 erfolgt entweder chemisch oder mikrobiell (siehe z. B. Kurth et al., 1996, Riboflavin, in: Ull­ mann's Encyclopedia of industrial chemistry, VCH Weinheim). Bei den chemischen Herstellverfahren wird Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines Endprodukt gewonnen, wobei relativ kostspielige Ausgangsprodukte, wie z. B. D-Ribose, ein­ gesetzt werden müssen.

Eine Alternative zur chemischen Synthese von Riboflavin ist die fermentative Herstellung des Vitamin B2 durch Mikroorganismen. Als Ausgangsstoffe dienen dabei nachwachsende Rohstoffe, wie Zucker oder pflanzliche Öle. Die Herstellung von Riboflavin durch Fermentation von Pilzen wie Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii ist bekannt (The Merck Index, Windholz et al., eds. Merck & Co., Seite 1183, 1983), aber auch Hefen, wie z. B. Can­ dida, Pichia und Saccharomyces oder Bakterien, wie z. B. Bacillus, Clostridien oder Corynebakterien sind als Riboflavin-Produzenten beschrieben. In EP-A-0 405 370 und EP-A-0 821 063 wird die Her­ stellung von Riboflavin mit rekombinanten Bakterienstämmen be­ schrieben, wobei die Stämme durch Transformation mit Riboflavin- Biosynthesegenen aus Bacillus subtilis erhalten wurden.

In Patent WO 95/26406 bzw. WO 93/03183 sowie in DE 44 20 785 wird die Klonierung der für die Riboflavin-Biosynthese spezifischen Gene aus den eukaryontischen Organismen Ashbya gossypii bzw. Saccharomyces cerevisiae, sowie Mikroorganismen, die mit diesen Genen transformiert wurden, und die Verwendung solcher Mikro­ organismen zur Riboflavinsynthese beschrieben.

In beiden Organismen katalysieren 6 Enzyme ausgehend von Guano­ sintriphosphat (GTP) und von Ribulose-5-Phosphat die Bildung von Riboflavin. Hierbei setzt die GTP-Cyclohydrolase-II (rib1-Gen­ produkt) GTP zu 2,5-Diamino-6-(ribosylamino)-4-(3H)-pyrimidi­ non-5-phosphat um. Diese Verbindung wird anschließend durch die 2,5-Diamino-6-(ribosylamino)-4-(3H)-pyrimidinon-5-phosphat Reduk­ tase (rib7 Genprodukt) zu 2,5-Diamino-ribitylamino-2,4-(1H,3H)- pyrimidin-5-phosphat reduziert und dann durch eine spezifische Deaminase (rib2-Genprodukt) zu 5-Amino-6-ribitylamino-2,4-(1H,3H)- pyrimidindion-5-phosphat deaminiert. Durch eine unspezifische Phosphatase wird daraufhin das Phosphat abgespalten.

Ribulose-5-phosphat, neben GTP das zweite Ausgangsprodukt der letzten enzymatischen Schritte der Riboflavinbiosynthese, wird durch die 3, 4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase (rib3-Gen­ produkt) zu 3, 4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat (DBP) umgesetzt.

Sowohl DBP als auch 5-Amino-6-ribitylamino-2,4-(1H,3H)-Pyrimidin­ dion sind die Edukte der enzymatischen Synthese von 6,7-Dime­ thyl-8-ribityllumazin. Diese Reaktion wird durch das rib4-Gen­ produkt (DMRL-Synthase) katalysiert. DMRL wird daraufhin durch die Riboflavin-Synthase (rib5-Genprodukt) zu Riboflavin umgesetzt (Bacher et al. (1993), Bioorg. Chem. Front. Vol. 3, Springer Verlag).

Trotz dieser Fortschritte in der Herstellung von Riboflavin besteht nach wie vor ein Bedarf zur Verbesserung und Steigerung der Vitamin B2-Produktivität um den steigenden Bedarf zu decken und die Herstellung von Riboflavin effizienter zu gestalten.

Es bestand daher die Aufgabe die Vitamin B2-Produktivität weiter zu verbessern. Diese Aufgabe wurde durch ein Verfahren zur ge­ steigerten Herstellung von Riboflavin mit einem Organismus, der in der Lage ist Riboflavin zu synthetisieren, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Aktivität der Enzyme 3,4-Dihydroxy-2- butanon-4-phosphat-Synthase, Dimethyl-8-ribityllumazin-Synthase und Riboflavin-Synthase oder deren Funktionsanalogen im Orga­ nismus erhöht, gelöst. Vorteilhaft wird das Verfahren zur gesteigerten Herstellung von Riboflavin mit einem Organismus, der in der Lage ist Riboflavin zu synthetisieren, durchgeführt, der zusätzlich die Kombination der Gene, die für die Enzyme 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase (= rib3-Genprodukt), Dimethyl-8-ribityllumazin-Synthase (= rib4-Genprodukt) und Ribo­ flavin-Synthase (= rib5-Genprodukt) oder deren Funktionsanalogen kodieren, enthält.

Weiter vorteilhaft zur Steigerung der Vitamin-B2-Produktivität ist die Kombination von Steigerung der natürlichen Enzymaktivität und Einbringen der oben genannten Genkombination zur Erhöhung der Genexpression.

Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für das erfindungsgemäße Ver­ fahren eignen sich prinzipiell alle Organismen, die in der Lage sind Riboflavin zu synthetisieren. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Riboflavin synthetisieren können. Aber auch Organismen, die aufgrund des Einbringens der kompletten Vitamin B2-Synthesegene in der Lage sind Riboflavin zu synthetisieren, sind für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Für das erfin­ dungsgemäße Verfahren sind Organismen wie Bakterien, Hefen, Pilze oder Pflanzen geeignet. Beispielhaft seien eukaryontische Orga­ nismen wie Pilze, die in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1, 2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschrieben werden, wie Ashbya oder Eremothecium, Hefen wie Candida, Saccharomyces oder Pichia oder Pflanzen wie Arabidopsis, Tomate, Kartoffel, Mais, Soja, Raps, Gerste, Weizen, Roggen, Reis, Hirse, Baumwolle, Zuckerrübe, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Canola, Hafer, Tabak, Alfalfa, Salat oder die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies oder proka­ ryontische Organismen wie gram-positive oder gram-negative Bakte­ rien wie Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Clostridium, Cyanobacter, Escherichia oder Klebstella genannt. Bevorzugt wer­ den Organismen ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Coryne­ bacterium, Brevibacterium, Bacillus, Escherichia, Ashbya, Eremo­ thecium, Candida oder Saccharomyces oder Pflanzen wie Mais, Soja, Raps, Gerste, Weizen, Kartoffel oder Tomate. Besonders bevorzugt werden Organismen der Gattung und Art Ashbya gossypii, Eremo­ thecium ashbyii, Saccharomyces cerevisiae, Candida flaveri, Candida famata, Corynebakterium ammoniagenes oder Bacillus subtilis. Als Pflanzen werden besonders bevorzugt Mais, Soja, Raps, Gerste, Weizen, Kartoffel und Tomate.

Die erfindungsgemäße Kombination der rib-Gene rib3, rib4 und rib5 und/oder die Aktivitätserhöhung der Gene und ihrer Genprodukte führt zu einer deutlich gesteigerten Riboflavin-Produktivität. Die genannten Gene lassen sich prinzipiell über alle dem Fachmann bekannten Methoden in die verwendeten Organismen einführen, vor­ teilhaft werden sie über Transformation, Transfektion, Elektro­ poration, mit der sog. Partikelgun oder über Mikroinjektion in die Organismen bzw. deren Zellen eingebracht. Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F. M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (2994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen. Als vorteilhaft seien beispielhaft Methoden wie das Einbringen der DNA über homologe oder heterologe Rekombination beispielsweise mit Hilfe des ura-3-Gens, speziell des ura-3-Gens von Ashbya, wie in der deutschen Anmeldung DE 198 01 120.2 beschrieben und/oder über die im folgenden beschriebene REMI-Methode (= "Restriktion-Enzyme- Mediated-Integration"), genannt.

Die REMI-Technik basiert auf der Kotransformation eines linearen DNA-Konstruktes, das an beiden Enden mit derselben Restriktions­ endonuklease geschnitten wurde, zusammen mit der Restriktions­ endonuklease, die für diese Restriktion des DNA-Konstrukts ver­ wendet wurde, in einen Organismus. Die Restriktionsendonuklease schneidet daraufhin die genomische DNA des Organismus, in den das DNA-Konstrukt zusammen mit dem Restriktionsenzym eingebracht wurde. Dies führt zu einer Aktivierung der zelleigenen Reparatur­ mechanismen. Diese Reparaturmechanismen reparieren die durch die Endonuklease hervorgerufene Strangbrüche der genomischen DNA und bauen dabei mit einer gewissen Frequenz auch das kotransformierte DNA-Konstrukt mit ins Genom ein. In der Regel bleiben dabei die Restriktionsschnittstellen an beiden Enden der DNA erhalten.

Diese Technik wurde von Bölker et al. (Mol Gen Genet, 248, 1995: 547-552) für die Insertionsmutagenese von Pilzen beschrieben. Von Schiestl und Petes (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1991: 7585-7589) wurde die Methode zur Aufklärung, ob es bei Saccharo­ myces eine heterologe Rekombination gibt, verwendet. Zur stabilen Transformation und regulierten Expression eines induzierbaren Reportergens wurde die Methode von Brown et al. (Mol. Gen. Genet. 251, 1996: 75-80) beschrieben. Das System wurde bisher noch nicht als gentechnisches Werkzeug zur Optimierung von Stoffwechselwegen oder zur kommerzielle Überexpression von Proteinen eingesetzt.

Am Beispiel der Riboflavinsynthese wurde gezeigt, daß mit Hilfe der REMI-Methode Biosynthesegene in das Genom der oben genannten Organismen integriert werden kann und damit Produktionsverfahren zur Herstellung von Stoffwechselprodukten des Primär- oder Sekun­ därmetabolismus speziell von Biosynthesewegen beispielsweise von Aminosäuren wie Lysin, Methionin, Threonin oder Tryptophan, Vita­ minen wie Vitamin A, B2, B6, B12, C, D, E, F, S-Adenosylmethionin, Biotin, Panthotensäure oder Folsäure, Carotinoiden wie β-Carotin, Lycopin, Canthaxanthin, Astaxanthin oder Zeaxanthin oder Prote­ inen wie Hydrolasen wie Lipasen, Esterasen, Amidasen, Nitrilasen, Proteasen, Mediatoren wie Cytokine z. B. Lymphokine wie MIF, MAF, TNF, Interleukine wie Interleukin 1, Interferone wie γ-Interferon, tPA, Hormone wie Proteohormone, Glykohormone, Oligo- oder Poly­ petidhormone wie Vassopressin, Endorphine, Endostatin, Angio­ statin, Wachstumsfaktoren Erythropoietin, Transkriptionsfaktoren, Integrine wie GPIIb/IIIa oder α_vβIII, Rezeptoren wie die ver­ schiedenen Glutamatrezeptoren, Angiogenesefaktoren wie Angio­ tensin optimiert werden können.

Mit Hilfe der REMI-Methode können die erfindungsgemäßen Nuklein­ säurefragmente oder andere der oben genannten Gene an trans­ criptionsaktive Stellen im Genom plaziert werden.

Vorteilhafterweise werden die Nukleinsäuren zusammen mit einem mindestens einem Reportergen in ein DNA-Konstrukt kloniert, das in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo- oder Biolumineszenzassay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Anti­ biotikaresistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Glucosidasegene, Peroxidasegen oder Bio­ synthesegene wie die Riboflavingene, das Luciferasegen, β-Galactosidasegen, gfp-Gen, Lipasegen, Esterasegen, Peroxidase­ gen, β-Lactamasegen, Acetyl-, Phospo- oder Adenyltransferasegen genannt. Diese Gene ermöglichen eine leichte Messbarkeit und Quantifizierbarkeit der Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit lassen sich Genomstellen identifi­ zieren, die eine bis zu Faktor 2 unterschiedliche Produktivität zeigen (siehe Fig. 1). Fig. 1 zeigt die Klone ITA-GS-15.2, ITA-GS-17.1 und ITA-GS-01, die nach Integration erhalten wurden, mit ihren unterschiedlichen Vitamin B2- (= Riboflavin)Produktivi­ täten.

Im Falle, daß die Biosynthesegene selber eine leichte Detektier­ barkeit ermöglichen, kann wie beispielsweise im Falle des Ribo­ flavins auf ein zusätzliches Reportergen verzichtet werden.

Sollen mehrere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit einem Reportergen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können. Auch Genfragmente, die für die jeweiligen Aktivi­ täten kodieren können in der REMI-Technik eingesetzt werden.

Für das erfindungsgemäße Verfahren zur Integration von Bio­ synthesegenen in das Genom von Organismen eignen sich prinzipiell alle bekannten Restriktionsenzyme. Restriktionsenzyme, die nur 4 Basenpaare als Restriktionsschnittstelle erkennen, sind weniger bevorzugt, da sie zu häufig im Genom oder im zu integrierenden Vektor schneiden, bevorzugt sind Enzyme die 6, 7, 8 oder mehr Basenpaare als Schnittstelle erkennen wie BamHI, EcoRI, BglII, SphI, SpeI, XbaI, XhoI, NcoI, SalI, ClaI, KpnI, HindIII, SacI, PstI, Bpn1, NotI, SrfI oder SfiI um nur einige der möglichen Enzyme zu nennen. Von Vorteil ist, wenn die verwendeten Enzyme keine Schnittstellen mehr in der einzuführenden DNA haben, dies erhöht die Effizienz der Integration. In der Regel werden 5 bis 500 U, bevorzugt 10 bis 250, besonders bevorzugt 10 bis 100 U der Enzyme im REMI-Ansatz verwendet. Die Enzyme werden vorteilhaft in einer wäßrigen Lösung eingesetzt, die Substanzen zur osmotischen Stabilisierung wie Zucker wie Saccharose, Trehalose oder Glucose, Polyole wie Glycerin oder Polyethylenglycol, eine Puffer mit einer vorteilhaften Pufferung im Bereich von pH 5 bis 9, bevor­ zugt 6 bis 8, besonders bevorzugt 7 bis 8 wie Tris, MOPS, HEPES, MES oder PIPES und/oder Substanzen zur Stabilisierung der Nukleinsäuren enthalten wie anorganische oder organische Salze von Mg, Cu, Co, Fe, Mn oder Mo. Es können gegebenenfalls noch weitere Stoffe enthalten sein wie EDTA, EDDA, DTT, β-Mercapto­ ethanol oder Nukleasehemmstoffe. Es ist aber auch möglich die REMI-Technik ohne diese Zusätze durchzuführen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem Temperaturbereich von 5 bis 80°C, bevorzugt von 10 bis 60°C, besonders bevorzugt von 20 bis 40°C durchgeführt. Für das Verfahren eignen sich alle bekannten Methoden zur Destabilisierung von Zellmembranen wie beispielsweise die Elektroporation, die Fusion mit beladenen Vesikeln oder die Destabilisierung über verschiedene Alkali- oder Erdalkalisalze wie Lithium, Rubidium- oder Calziumsalze bevorzugt sind die Lithiumsalze.

Die Nukleinsäuren können nach dem Isolieren direkt oder nach Auf­ reinigung für die erfindungsgemäße Reaktion verwendet werden.

Die Fig. 2 und 3 geben das erfindungsgemäße Verfahren in einem schematischen Überblick für die Integration der erfindungsgemäßen rib-Genkombination wieder. Die DNA wurde mit dem Enzym SpeI ge­ schnitten und in seiner Gegenwart wurde die DNA in die Organismen eingeführt. Zur leichteren Selektion wurde ein Kanamycin-Resi­ stenzgen im Fragment mit eingebaut, das von TEF-Promotoren- Sequenzen flankiert ist (sog. "direct repeat"). Über diese Sequenzen wird das Resistenzgen über eine Rekombination wieder entfernt (siehe Fig. 3).

Das Einbringen der erfindungsgemäßen Kombination der rib-Gene in Pflanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten­ transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, die Verwendung einer Genkanone, die Elektroporation, die Inkuba­ tion trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikro­ injektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans­ formieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Die Transformation von Pflanzen mit Agro­ bacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Will­ mitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben.

Mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transforma­ tion von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies sowie Leguminosen verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigne­ ten Medien kultiviert werden.

Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.

Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten die Enzymaktivität der rib-Genprodukte in der Zelle zu erhöhen.

Eine Möglichkeit besteht darin; die endogenen rib-Gene 3, 4 und 5 so zu verändern, daß sie für Enzyme mit gegenüber den Ausgangs­ enzymen erhöhter rib 3, 4 bzw. 5-Aktivität kodieren. Eine andere Erhöhung der Enzymaktivität kann beispielsweise erreicht werden, indem durch Veränderung der katalytischen Zentren ein erhöhter Substratumsatz erfolgt oder indem die Wirkung von Enzym­ inhibitoren aufgehoben wird, das heißt sie weisen eine erhöhte spezifische Aktivität auf oder ihre Aktivität wird nicht gehemmt. Auch kann eine erhöhte Enzymaktivität in einer weiteren vorteil­ haften Ausführungsform durch Erhöhung der Enzymsynthese in der Zelle erfolgen, beispielsweise durch Ausschaltung von Faktoren, die die Enzymsynthese reprimieren oder durch Erhöhung der Aktivi­ tät von Faktoren oder Regulatorelementen, die eine verstärkte Synthese fördern, oder bevorzugt durch Einbringen weiterer Gen­ kopien. Durch diese Maßnahmen wird die Gesamtaktivität der Gen­ produkte in der Zelle erhöht, ohne die spezifische Aktivität zu verändern. Es kann auch eine Kombination dieser Methoden verwen­ det werden, das heißt Erhöhung der spezifischen Aktivität sowie Erhöhung der Gesamtaktivität. Diese Änderungen können prinzipiell über alle dem Fachmann bekannten Methoden in die Nukleinsäure­ sequenzen der Gene, Regulationselemente oder deren Promotoren eingebracht werden. Hierzu können die Sequenzen beispielsweise einer Mutageneses wie einer "site directed mutagenesis" unter­ zogen werden wie sie in D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), Kapitel 6, Seite 193 ff beschrieben wird.

Von Spee et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 3, 1993: 777-778) wird eine PCR-Methode unter Verwendung von dITP zur zufälligen Mutagenese beschrieben.

Die Verwendung einer "in vitro" Rekombinationstechnik für die molekulare Evolution wird von Stemmer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 1994: 10747-10751) beschrieben.

Von Moore et al. (Nature Biotechnology Vol. 14, 1996: 458-467) wird die Kombination der PCR- und Rekombinationsmethode beschrie­ ben.

Die veränderten Nukleinsäuresequenzen werden anschließend wieder über Vektoren in die Organismen zurückgebracht.

Es können zur Erhöhung der Enzymaktivitäten auch veränderte Pro­ motorbereiche vor die natürlichen Gene gebracht werden, so daß die Expression der Gene gesteigert wird und damit die Aktivität letztlich angehoben wird. Auch am 3'-Ende können Sequenzen einge­ bracht werden, die beispielsweise die Stabilität der mRNA erhöhen und dadurch eine erhöhte Translation ermöglichen. Dies führt ebenfalls zu einer höheren Enzymaktivität.

Vorzugsweise werden weitere Genkopien der rib-Gene 3, 4 und 5 gemeinsam in die Zelle eingebracht. Diese Genkopien können der natürlichen Regulation unterliegen, einer veränderten Regulation, wobei die natürlichen Regulationsregionen derart verändert wur­ den, das sie eine erhöhte Expression der Gene ermöglicht oder aber es können Regulationssequenzen fremder Gene oder sogar art­ fremder Gene verwendet werden.

Besonders vorteilhaft ist eine Kombination der oben genannten Methoden.

Unter Funktionsanalogen sind beispielsweise funktionelle Homologe der rib-Gene oder deren enzymatischen Aktivitäten, das heißt Enzyme, die dieselben enzymatischen Reaktionen wie die rib-Gene katalysieren, zu verstehen. Diese Gene führen ebenfalls zu einer vorteilhaften Erhöhung der Riboflavinbildung. Auch diese Funkti­ onsanalogen können in der oben genannten Art vorteilhaft muta­ genisiert bzw. verändert und damit ihre Aktivität gesteigert werden.

Die Funktionsanalogen sind vorteilhaft Gene oder Genprodukte, die beispielsweise aus eukaryontischen oder prokaryontischen Organis­ men stammen. Als eukaryontische Organismen seien beispielhaft Pilze, die in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1, 2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschrieben werden, wie Eremothecium, Hefen wie Candida, Saccharomyces oder Pichia oder Pflanzen wie Arabidopsis, Tomate, Kartoffel, Mais, Soja, Raps, Gerste, Weizen, Roggen, Reis, Hirse, Baumwolle, Zuckerrübe, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Canola, Hafer, Tabak, Alfalfa, Salat oder die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies genannt. Als prokaryontische Organis­ men seien beispielhaft gram-positive oder gram-negative Bakterien genannt wie Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Clostri­ dium, Cyanobacter oder Escherichia genannt. Vorteilhaft stammen die Funktionsanalogen aus Pilzen wie Eremothecium, Hefen wie Saccharomyces oder Candida, gram-positiven Bakterien wie Bacillus oder Corynebacterium oder gram-negative Bakterien wie Escherichia cohi. Bevorzugt stammen die Funktionsanalogen aus den Organismen der Gattung und Art Eremothecium ashbyii, Saccharomyces cere­ visiae, Candida flaveri, Candida famata, Escherichia coli, Corynebacterium ammoniagenes oder Bacillus subtilis.

Vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren ist die Kombination der Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 oder deren funktionelle Äquivalente.

Unter funktionellen Äquivalenten der in der erfindungsgemäßen Kombination verwendeten Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 35% Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 40% Homologie, besonders bevorzugt mindestens 45% Homologie, ganz besonders bevorzugt 50% Homologie aufweisen. Die von den genannten Nukleinsäuren ab­ geleitete Aminosäuresequenz ist den Sequenzen SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 und SEQ ID No. 6 zu entnehmen. Allelvarianten umfassen ins­ besondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus den in SEQ ID No. 1, SEQ ID No.3 und SEQ ID No.5 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wo­ bei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine erhalten bleibt.

Solche DNA-Sequenzen lassen sich ausgehend von den in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 beschriebenen DNA-Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybri­ disierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Eukaryonten oder Prokaryonten als Ashbya gossypii wie oben genannt isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereich, die über Ver­ gleiche mit den entsprechenden Genen aus E. coli und B. subtilis in dem Fachmann bekannterweise ermittelt werden können, ver­ wendet.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC und in Gegenwart von 50% Formamid zu verstehen. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben.

Weiterhin sind unter Homologe der Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 beispielsweise eukaryontische oder proka­ ryontische Homologe, verkürzte Sequenzen oder Einzelstrang-DNA zu verstehen.

Außerdem sind unter Homologe der Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 Derivate wie beispielsweise Promotorvarian­ ten zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotid­ sequenzen gemeinsam oder einzeln vorgeschalten sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/­ oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionali­ tät bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Unter Derivaten sind auch vorteilhaft Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz vor dem Startkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird.

Bevorzugt lassen sich Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 oder ihre funktionellen Äquivalente aus Mikroorganismen der Gattungen Clostridium, Corynebacterium, Brevibacterium Cyano­ bacter, Bacillus, Eremothecium, Escherichia, Pichia, Ashbya oder Candida oder aus Pflanzen, besonders bevorzugt aus Mikroorganis­ men der Gattung und Art Bacillus subtilis, Corynebakterium ammoniagenes, Escherichia coli, Candida flaveri, Candida famata oder Pilzen, die in Indian Chem Engr. Section B., Vol. 37, No. 1, 2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschrieben werden, wie z. B. Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii, ganz besonders bevor­ zugt aus Mikroorganismen der Gattung und Art Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii isolieren. So können beispielsweise die zu rib 3, 4, 5 homologen Gene rib A, ribH und ribB, oder Genfrag­ menten aus diesen, aus Bacillus subtilis oder die zu rib3, 4, 5 homologen Genen rib B, rib E und rib C, oder Genfragmenten aus diesen aus E. coli in prokaryotischen Systemen zur Steigerung der Riboflavin-Ausbeute im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft verwendet werden.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Die Genexpression der rib-Gene 3, 4 und 5 kann vorteilhaft durch Erhöhen der rib3,4,5 Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die rib3,4 und 5 Genexpression positiv beeinflussen, erhöht werden. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale wie Promotoren und Enhancer verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der rib3, 4 und 5 mRNA verbessert, oder die Ableseeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird.

Zur Erhöhung der Genkopienzahl können die rib-Gene 3, 4 und 5, oder homologer Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen rib-Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält.

Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken. Alternativ kann auch jedes der beschriebenen Gene in einen einzelnen Vektor gebracht und in den jeweiligen Produktionsorganismus transformiert werden.

Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragment sind die rib- Gensequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 oder deren funktionelle Äquivalente zu verstehen, die mit einem oder mehre­ ren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Gen­ expression funktionell verknüpft wurden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nucleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulations­ sequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenzen SEQ ID No. l, SEQ ID No. 3 oder SEQ ID No. 5 oder deren funktionelle Äquivalente inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können auch allein vor die natürlichen Gene zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die rib-Gene können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver­ fahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im X-P_L-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22(1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, LEB4, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor enthalten. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanol­ oxidase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Weitere vor­ teilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise ein durch Benzensulfonamid-induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetra­ zyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO9321334) Promotor. Vorteilhaft sind insbesonders solche pflanzliche Promotoren, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Biosynthese von Purinen bzw. dessen Vorstufen statt­ findet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blatt­ spezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245). Auch der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder einen anderen Nodien-spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regula­ tionssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthe­ tische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Im Nukleinsäurefragment (= Genkonstrukt) können wie oben be­ schrieben noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie die rib- Gene liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispielsweise um weitere Biosynthesegene, die eine gesteigerte Synthese ermög­ lichen.

Das Nukleinsäurefragment wird zur Expression in den oben genann­ ten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie bei­ spielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermög­ licht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2 µM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004 oder pDH51 oder Derivate der vorstehend genannten Plasmide. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 beschrieben.

Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurefragment zur Expres­ sion der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann bei­ spielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs­ weise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beein­ flussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regu­ latorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptions­ ebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann das erfin­ dungsgemäße Genkonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirts­ organismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurefragment als Vektor bestehen.

Als Vektor kann auch ein beliebiges Plasmid (insbesondere aber ein Plasmid, das den Replikationsursprung des 2 µm Plasmids aus S. cerevisiae trägt) verwendet werden, das in der Zelle autonom repliziert, aber auch wie oben beschrieben ein lineares DNA- Fragment, das in das Genom des Wirtes integriert. Diese Inte­ gration kann über hetero- oder homologe Rekombination erfolgen. Bevorzugt wie erwähnt jedoch über homologe Rekombination (Steiner et al., Genetics, Vol. 140, 1995: 973-987). Dabei können die Gene rib3, rib4 und rib5 einzeln im Genom an verschiedenen Orten oder auf verschiedenen Vektoren vorliegen oder gemeinsam im Genom oder auf einem Vektor vorliegen.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen, die die Kombination der rib-Gene 3, 4 und 5 oder deren funktionelle Äquivalente enthalten, zeigen eine erhöhte Riboflavin-Produktion.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die für die Herstellung von Riboflavin verwendeten Organismen in einem Medium, das das Wachs­ tum dieser Organismen ermöglicht, angezüchtet. Dieses Medium kann ein synthetisches oder ein natürliches Medium sein. Je nach Organismus werden dem Fachmann bekannte Medien verwendet. Für das Wachstum der Mikroorganismen enthalten die verwendeten Medien eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an Vitamine und Spurenelemente.

Vorteilhafte Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Zucker wie Mono-, Di- oder Polysaccharide wie Glucose, Fructose, Mannose, Xylose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose, komplexe Zucker­ quellen wie Melasse, Zuckerphosphate wie Fructose-1,6-bis­ phosphat, Zuckeralkohole wie Mannit, Polyole wie Glycerin, Alkohole wie Methanol oder Ethanol, Carbonsäuren wie Citronen­ säure, Milchsäure oder Essigsäure, Fette wie Sojaöl oder Rapsöl, Aminosäuren wie ein Aminosäurengemisch beispielsweise sog. Casamino acids (Difco) oder einzelne Aminosäuren wie Glycin oder Asparaginsäure oder Aminozucker, die letztgenannten können auch gleichzeitig als Stickstoffquelle verwendet werden.

Vorteilhafte Stickstoffquellen sind organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispiele sind Ammoniumsalze wie NH₄Cl oder (NH₄)₂SO₄, Nitrate, Harnstoff, oder komplexe Stickstoffquellen wie Maisquell­ wasser, Bierhefeautolysat, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Caseinhydrolysat, Hefe oder Kartoffelprotein, die häufig auch gleichzeitig als Stickstoff­ quelle dienen können.

Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium, Natrium, Cobalt, Molybdän, Mangan, Kalium, Zink, Kupfer und Eisen. Als Anion dieser Salze sind besonders das Chlor-, Sulfat- und Phosphation zu nennen. Ein wichtiger Faktor zur Steigerung der Produktivität im erfindungsgemäßen Verfahren ist die Kontrolle der Fe²⁺- oder Fe³⁺-Ionenkonzentration im Produktionsmedium.

Gegebenenfalls werden dem Nährmedium weitere Wachstumsfaktoren zugesetzt, wie beispielsweise Vitamine oder Wachstumsförderer wie Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nicotinsäure, Pantothenat oder Pyridoxin, Aminosäuren wie Alanin, Cystein, Prolin, Asparaginsäure, Glutamin, Serin, Phenylalanin, Ornithin oder Valin, Carbonsäuren wie Citronensäure, Ameisensäure, Pimelinsäure oder Milchsäure, oder Substanzen wie Dithiothreitol.

Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt von der Art der Fermentation ab und wird im Einzelfall festgelegt. Die Mediumkomponenten können alle zu Beginn der Fermentation vorge­ legt werden, nachdem sie falls erforderlich getrennt sterilisiert oder gemeinsam sterilisiert wurden, oder aber je nach Bedarf während der Fermentation kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgegeben werden.

Die Züchtungsbedingungen werden so festgelegt, daß die Organismen optimal wachsen und daß die bestmöglichen Ausbeuten erreicht wer­ den. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen bei 15°C bis 40°C. Besonders vorteilhaft sind Temperaturen zwischen 25°C und 37°C. Vorzugsweise wird der pH-Wert in einem Bereich von 3 bis 9 fest­ gehalten. Besonders vorteilhaft sind pH-Werte zwischen 5 und 8. Im allgemeinen ist eine Inkubationsdauer von wenigen Stunden bis zu einigen Tagen bevorzugt von 8 Stunden bis zu 21 Tagen, be­ sonders bevorzugt von 4 Stunden bis 14 Tagen ausreichend. Inner­ halb dieser Zeit reichert sich die maximale Menge an Produkt im Medium an.

Wie Medien vorteilhaft optimiert werden können, kann der Fachmann beispielsweise dem Lehrbuch Applied Microbiol Physiology, "A Practical Approach (Eds. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL-Press, 1997, Seiten 53-73, ISBN 0 19 963577 3) entnehmen. Vorteilhafte Medien und Anzuchtsbedingungen sind für Bacillus und weitere Organismen beispielsweise der Schrift EP-A-0 405 370 speziell dem Beispiel 9, für Candida der Schrift WO 88/09822 speziell Tabelle 3 und für Ashbya der Schrift von Schmidt et al. (Micro­ biology, 142, 1996: 419-426) zu entnehmen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann kontinuierlich oder diskonti­ nuierlich in batch- oder fed-batch-Weise durchgeführt werden.

Abhängig davon wie hoch die Ausgangsproduktivität des verwendeten Organismus ist, läßt sich die Riboflavin-Produktivität durch das erfindungsgemäße Verfahren unterschiedlich stark steigern. In der Regel läßt sich die Produktivität vorteilhaft um mindestens 5%, bevorzugt um mindestens 10%, besonders bevorzugt um 20%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 100% jeweils gegenüber dem Ausgangsorganismus steigern.

Beispiele:

Die Isolierung der rib-Gene 1, 2, 3, 4, 5 und 7 aus Ashbya gossypii und Saccharomyces cerevisiae wird in den Patenten WO 95/26406 und WO 93/03183 und speziell in den Beispielen beschrieben und wurde entsprechend durchgeführt. Auf diese Schriften wird hier aus­ drücklich Bezug genommen.

Sequenz 1 zeigt das DNA-Konstrukt, das neben dem zur Trans­ formation notwendigen Selektionsmarker die Genfragmente von rib3, rib4 und rib5 trägt.

Allgemeine Nukleinsäureverfahren wie z. B. Klonierung, Restrik­ tionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Verknüpfen von DNA- Fragmenten, Transformation von Mikroorganismen, Anzucht von Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wenn nichts anderes beschrieben wurde wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt.

Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 5463-5467). Fragmente resultierend aus einer Polymerase Ketten­ reaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu exprimierenden Konstrukten sequenziert und überprüft.

Beispiel 1

Klonierung des DNA-Konstruktes, das die rib3, rib4 und rib5 Gen­ kopien enthält (Vektor Tef-G418 rib3,4,5)

Expressionskonstrukte der rib-Gene: rib3 (Vektor pJR874), rib4 (Vektor pJR762) und rib5 (Vektor pJR739) werden in WO95/26406 be­ schrieben. Der Vektor pAG-110 (Steiner und Philipsen (1994) Mol. Gen. Genet., 242; 263-271) wurde mit DraIII geschnitten, mit Klenowpolymerase und Desoxy-Nukleotiden inkubiert (Auffüllen der Enden), gefällt und anschließend mit SalI geschnitten. Das DNA- Fragment, das den Tef-Promotor und das Kanamycin-Resistenzgen enthält wurde mit dem HindIII und SalI geschnittenem Vektor Bluescript KS-(Stratagene), dessen HindIII Enden durch Klenow­ polymerase aufgefüllt waren ligiert. Es entstand der Vektor pBS Tef-G418.

pJR874 wurde im zweiten Klonierungsschritt mit PvuII und SalI ge­ schnitten worden. Das rib3-Genfragment wurde daraufhin mit einem Sall geschnittenen und dephosphorilierten Vektor pBS Tef-G418 ligiert. Da nur die SalI Enden des Fragments und Vektors ligiert werden konnten, sind die nicht-kompatiblen PvuII und SalI Enden mit Klenowpolymerase aufgefüllt und anschließend ligiert worden. Der entstandene Vektor wird im folgenden Tef-G418-rib3 genannt.

Zur Subklonierung des rib5-Gens in den Vektor Tef-G418-rib3 wurde der Vektor pJR739 mit NcoI und NotI geschnitten. Die Enden wurden mit Klenowpolymerase aufgefüllt. Das rib5-Genfragment wurde dann in den mit SalI geschnittenen Vektor Tef-G418-rib3, dessen Enden ebenfalls aufgefüllt waren subkloniert. Es entstand Vektor Tef-G418-Rib3,5.

Im letzten Klonierungsschritt wurde das rib4-Genfragment aus Vektor pJR762 durch PCR mit Hilfe der Primer

5'GATCGATCGATCGCTAGCTGGGAGGATATGTTCTGGG 3'
5'TCCAAGCTTGCTAGCATCTCAAATAAGTGATTAGAAGGACAAGCTGCAAG 3'

gewonnen. Das PCR-Fragmente wurde mit NheI geschnitten und in einen NheI geschnittenen und mit alkalischer Phosphatase behandelten Vektor Tef-G418rib3, 5 subkloniert.

Das resultierende DNA-Konstrukt stellt den Vektor Tef-G418-rib3, 4, 5 dar.

Beispiel 2

Transformation des DNA-Konstruktes in den Pilz Ashbya gossypii Das in Beispiel 1 beschriebene DNA-Konstrukt (Vektor Tef- G418-rib3,4,5) wurde mit dem Restriktionsenzym SpeI vollständig geschnitten und das Insert, das die rib-Gen Sequenzen trägt durch Agarosegelauftrennung aufgereinigt. Das für die Transformation benutzte Insert wird in SEQ ID No. 7 wiedergegeben. Die abge­ leiteten Aminosäurensequenzen der im Insert vorhandenen rib-Gene 3, 4 und 5 sind den Sequenzen SEQ ID No. 8 (= rib3), SEQ ID No. 9 (= rib5) und SEQ ID No. 10 (= rib4) zu entnehmen.

MA2-Medium (10 g/l Bacto-Peptone, 1 g/l Hefeextrakt, 0,3 g/l myo- Inositol und 10 g/l D-Glucose) wurde mit Ashbya gossypii Sporen angeimpft. Die Kultur wurde 12 h bei 4 C und anschließend unter Schütteln für 13 h bei 28°C inkubiert. Die Zellsuspension wurde abzentrifugiert und das Zellpellet in 5 ml 50 mM Kaliumphosphat­ puffer pH 7,5, 25 mM DTT aufgenommen. Nach einer 30-minütigen Wärmebehandlung bei 28°C wurden die Zellen wiederum abzentri­ fugiert und in 25 ml STM-Puffer (270 mM Saccharose, 10 mM TRIS- HCl pH 7,5, 1 mM MgCl₂) aufgenommen. 0,5 ml dieser Suspension wurden dann mit ca. 3 µg des oben aufgereinigten Inserts und 40 U SpeI Enzym versetzt und in einem Biorad Gene Pulser (100 Ω, 20 µF, 1,5 kv) elektroporiert. Nach der Elektroporation sind die Zellen mit 1 ml MA2-Medium versetzt und auf MA2-Agarkulturplatten aus­ gestrichen worden. Zur Antibiotikaselektion überschichtet man die Platten nach 5 h Inkubation bei 28°C mit 5 ml "Low-Melting"-Agarose, die das Antibiotikum G418 (200 µg/ml) enthält. Die Transformanten wurden durch Mikromanipulation klonal aufgereinigt (Steiner und Philipsen (1995) Genetics, 140; 973-987). Die erfolgreiche Inte­ gration des Konstrukts wurde durch PCR-Analyse der genomischen DNA der Transformanten verifiziert. Die Isolation der genomischen DNA wurde wie von Carle und Olson(Proc.Natl.Acad.Sci, 1985, 82, 3756-3760) und Wright und Philipsen (Gene, 1991, 109,99-105) beschrieben durchgeführt. Die PCR mit für das Konstrukt spezi­ fischen Primern ist nach R. Saiki (PCR Protocols, 1990, Academic Press, 13-20) durchgeführt worden. Die Analyse der PCR-Fragmente geschieht durch Auftrennung über ein Agarosegel. Die erfolgreiche Integration der DNA in des Genom der Transformanten wurde mit Hilfe der folgenden Primer durchgeführt:

Primer A: 5'-TCCCTTAATCATTGTCACTGC-3',
Primer B: 5'-CCAAGCTTGCTAGCATCTC-3',
Primer C: 5'-CTGCCTGAGAAGCTGGAAAGC-3',
Primer D: 5'-TGTGAATTAGTAAGCGAAAGG-3',
Primer E: 5'-TAAGGGATTAGGCGAAGTTGA-3',
Primer F: 5'-GCTGCCACCCCTCTGATTCAC-3',
Primer G: 5'-ATAAGCTTTTGCCATTCTCAC-3',
Primer H: 5'-CTTTTGCTTTGCCACGGAACG-3'.

Bei allen Transformanten konnte eine erfolgreiche Integration ins Genom nachgewiesen werden.

Beispiel 3

Riboflavinbestimmung im rekombinanten Ashbya gossypii Klon Ashbya gossypii Ita-GS-01 (Schmidt, G., Stahmann, K.-P., Kaesler, B., & Sahm, H. (1996) Microbiology 142,419-426) und die daraus durch Transformation mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Kon­ strukt hervorgegangenen Stamm Ita-GS-01#17.1 wurde auf Agarmedium bei 28°C 4 Tage lang angezogen. Von dieser Platte wurden drei 100 ml Erlenmeyerkolben mit 10 ml Medium (27,5 g/l Hefeextrakt, 0,5 g/l MgSO₄, 50 ml/l Sojaöl, pH 7,0) beimpft (17.1-1, 17.1-2, 17.1-3). Nach 40 h Stunden Inkubation bei 28°C, 180 rpm auf dem Schüttler wurde je 1 ml der Kulturbrühe in 250 ml Erlenmeyerkol­ ben mit 20 ml YPD-Medium überführt (10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Bactopepton, 20 g/l Glucose). Inkubation 28°C, 300 rpm. Nach 190 h wurde aus jedem Kolben eine 1 ml Probe entnommen und mit 1 ml 1 M Perchlorsäure versetzt. Die Probe wurde filtriert und der Ribo­ flavingehalt mit HPLC-Analytik bestimmt. Dabei wurde eine Eichung mit Riboflavinstandards (10 mg/l, 20 mg/l, 30 mg/l, 40 mg/l, 50 mg/l) vorgenommen.

Parameter der HPLC-Methode zur Riboflavinbestimmung:

Säule: ODS Hypersil 5 mm 200X 2,1 mm (HP)
Eluent A: Wasser mit 340 ml H₃PO₄ (89%) auf pH 2,3
Eluent B: 100% Acetonitril
Gradient
Stopzeit: 100-6 min.: 2% B auf 50% B
6-6,5 min.: 50% B auf 2% Bmin
Fluß: 0,5 ml/min
Detektion: 280 nm
Temperatur: 40°C
Injektion: 2-10 µl

Alle drei Ansätze des Klon 17, der eine zusätzliche Genkopie der rib-Gene 3, 4 und 5 enthalten, zeigen im Vergleich zum Ausgangs­ stamm eine deutlich erhöhte Riboflavinproduktivität (Fig. 4).

Fig. 4 zeigt die Riboflavinausbeuten der verschiedenen Klone. Durch Einbringen der rib3,4 und 5 Gene konnten Steigerungen der Riboflavinausbeuten von bis zu 150% im Vergleich zum unmodifi­ zierten Stamm erreicht werden.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (17)

1. Verfahren zur gesteigerten Herstellung von Riboflavin mit einem Organismus, der in der Lage ist Riboflavin zu synthe­ tisieren, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aktivität der Enzyme 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase, Dimethyl-8-ribityllumazin-Synthase und Riboflavin-Synthase oder deren Funktionsanalogen im Organismus erhöht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kombination der Gene, die für die Enzyme 3,4-Di­ hydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase, Dimethyl-8-ribityl­ lumazin-Synthase und Riboflavin-Synthase oder deren Funktionsanalogen kodieren, zur Aktivitätssteigerung der Enzyme in den Organismus einbringt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Organismus ein Bakterium, eine Hefe, einen Pilz oder eine Pflanze verwendet.

4. verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man Organismen ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Bacillus, Clostridium, Escherichia, Pichia, Candida, Cyanobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Saccharomyces, Eremothecium oder Ashbya oder Pflanzen wie Arabidopsis, Tomate, Kartoffeln, Mais, Raps, Weizen, Gerste, Sonnenblumen, Hirse, Roggen, Hafer, Zuckerrübe, Bohnen­ gewächse oder Soja verwendet.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man Organismen ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Bacillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Escherichia, Candida, Eremothecium oder Ashbya verwendet.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeich­ net, daß Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 oder deren funktionellen Äquivalente ver­ wendet werden.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Äquivalente eine Homologie auf der durch die Sequenzen kodierten und abgeleiteten Aminosäureebene von 35% haben.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeich­ net, daß die Gene, die für die Enzyme 3,4-Dihydroxy-2- butanon-4-phosphat-Synthase, Dimethyl-8-ribityllumazin- Synthase und Riboflavin-Synthase oder deren Funktionsanaloge kodieren, aus eukaryontischen oder prokaryontischen Organis­ men stammen.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Gene oder deren Äquivalente aus Organismen ausgewählt aus der Gruppe Bacillus, Escherichia, Clostridium, Saccharomyces, Candida, Eremothecium oder Ashbya stammen.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Gene oder deren Äquivalente zusammen oder getrennt auf mindestens einem Vektor oder chromosomal lokalisiert sind.

11. Nukleinsäurefragment enthaltend Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 5 oder deren funktionellen Äquivalente, wobei die Gene oder ihre Äquivalente funktionell mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft sind.

12. Expressionsvektor enthaltend das Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 11.

13. Expressionsvektor nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine lineare Nukleinsäure handelt.

14. Organismus enthaltend mindestens ein Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 11 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 12.

15. Verwendung einer Kombination der Gene, die für die Enzyme 3, 4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase, Dimethyl-8- ribityllumazin-Synthase und Riboflavin-Synthase oder deren Funktionsanalogen kodieren, in einen Organismus, der in der Lage ist Riboflavin zu synthetisieren, zur gesteigerten Herstellung von Riboflavin.

16. Verwendung nach Anspruch 15 in Ashbya gossypii.

17. verfahren zur Integration von Nukleinsäuren in das Genom von Organismen, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens ein Riboflavinsynthesegen über eine Restriktionsenzym vermittelte Integration ins Genom des Organismus einführt.