DE19808889A1

DE19808889A1 - Vektoren und Viren zur Gentherapie

Info

Publication number: DE19808889A1
Application number: DE19808889A
Authority: DE
Inventors: Alexander Buerkle; Ralph Meyer
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1998-03-03
Filing date: 1998-03-03
Publication date: 1999-09-09
Also published as: WO1999044943A3; AU3698699A; JP2002505855A; EP1066221A2; WO1999044943A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Vektoren und Viren, die sich zur Gentherapie eignen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Eine gängige Tumortherapie umfaßt die möglichst vollständige operative Entfer nung des Tumors und die Behandlung des Patienten mittels Bestrahlung und/oder systemischer oder regionaler Applikation von Zytostatika (Chemotherapie). Diese Strahlen- und/oder Chemotherapie kann dabei vor oder nach operativer Entfernung des Tumors durchgeführt werden und stellt in Fällen inoperabler Tumoren oft sogar die einzige Therapiemöglichkeit dar. Durch die Strahlen- und/oder Chemotherapie wird versucht, noch vorhandenes Tumorgewebe bzw. gebildete Metastasen abzutöten. Diese Therapiemodalitäten induzieren DNA-Schädigung/Hemmung der DNA-Synthese in den Tumorzellen und sollen die Tumorzellen dadurch abtöten. Wegen starker Nebenwirkungen auf gesundes Gewebe wird die für die Therapie geplante Gesamtdosis zumeist über Wochen und Monate hin fraktioniert gegeben. In denjenigen Tumorzellen, die einen solchen zytotoxischen Therapiestoß jedoch überleben, kann diese Behandlung zu genomischer Instabilität führen bzw. eine solche verstärken. Genomische In stabilität bedeutet, daß es zu strukturellen und numerischen Chromosomenaber rationen, Genumlagerungen, kompletten oder partiellen Gendeletionen, Gen amplifikationen, Punktmutationen etc. kommt. Selbstverständlich können diese genetischen Veränderungen die Genexpression der Zelle in erheblichem Umfang beeinflussen, indem es zur Überexpression, Unterexpression oder deregulierten Expression von normalen Proteinen bzw. zur Expression abnormer Proteine (einzelne Aminosäurenaustausche, Trunkierung von Proteinen etc.) kommt. Wenn solche Proteine betroffen sind, die das Zellwachstum, den Differenzie rungszustand, den programmierten Zelltod oder die Expression von Oberflächen proteinen steuern, kann dies direkt zum typischen "malignen Phänotyp" von Tumorzellen einschließlich gestörter Proliferationskontrolle, Immortalisierung, Differenzierungsstörung, "Immun-Escape", Metastasierung und pathologischer Angiogenese führen. Ein Herbeiführen oder eine Verstärkung von genomischer Instabilität in Tumorzellen, die einen zytotoxischen Therapiestoß überleben, kann also dazu führen, daß der Prozeß der Malignisierung ungewollt beschleunigt wird, daß sich z. B. Therapieresistenz oder eine Metastasierungsneigung ein stellen und dadurch die Heilung der Patienten letzlich unmöglich gemacht wird. Dies steht auch im Einklang mit der klinischen Erfahrung, daß bei sehr vielen Krebspatienten durch Strahlen- bzw. Chemotherapie initial zwar Remissionen induziert werden können, daß aber im weiteren Therapieverlauf die Tumoren therapieresistent werden und die Patienten schließlich daran versterben. Der Erfolg dieser gängigen Tumortherapien ist deshalb gering.

Aber auch bei noch als gesund anzusehenden Zellen ("Normalzellen") tritt genomische Instabilität auf und kann vielleicht sogar als treibende Kraft der Tumorentwicklung gesehen werden. Dies wird durch folgende Tatsachen unter stützt:

a) Es gibt eine Anzahl verschiedener, monogener Erbleiden, deren gemeinsames Merkmal eine verstärkte genomische Instabilität in normalen Zellen bereits bei jungen Probanden ist (z. B. Bloom's Syndrom, Werner-Syndrom etc.). Diese Syn drome sind alle mit einem erhöhten Krebsrisiko assoziiert.
b) Chemische und physikalische Karzinogene können genomische Instabilität hervorrufen, was als Inanspruchnahme von "fehlerproduzierenden" DNA-Repara tursystemen infolge Überlastung von zunächst aktivierten "fehlerfreien" Repara tursystemen angesehen werden kann. Ebenso können bestimmte Genprodukte von Tumorviren genomische Instabilität in den Wirtszellen herbeiführen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu stellen, mit dem gängige Tumortherapien verbessert, eine Prophylaxe gegen die Tumorentstehung und -entwicklung durchgeführt und insbesondere die Erzeu gung von genomischer Instabilität in Tumorzellen und Normalzellen vermieden werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch einen zur Gentherapie geeigneten Vektor er reicht, der eine exprimierbare Insert-DNA umfaßt, die für die im wesentlichen vollständige genetische Information der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (nachste hend mit PARP bezeichnet) codiert.

Die PARP ist ein hochkonserviertes nukleäres Enzym bei höheren Eukaryonten, welches in Anwesenheit von DNA-Strangbrüchen die kovalente Modifikation von Zellkernproteinen mit Poly(ADP-Ribose) katalysiert. Diese Reaktion trägt zur effizienten Basenexzisionsreparatur und zur Erholung proliferierender Zellen von den zytotoxischen Auswirkungen von DNA-Schädigungen durch Alkylantien, Oxidantien bzw. ionisierender Strahlung bei. Diese Erkenntnis wurde bisher be nutzt, um die zelluläre Poly(ADP-Ribose)-Produktion in Tumorzellen durch Hem mung der PARP zu unterbinden, wobei als Konsequenz eine Sensibilisierung der Zellen gegen schädigende Agentien festgestellt wurde und ein Absterben der Tumorzellen eintreten sollte. Dieser therapeutische Ansatz ist beispielsweise in DE-44 44 949 C1 beschrieben. Dort wird in einen zur Gentherapie geeigneten Vektor eine exprimierbare Insert-DNA, die für die DNA-Bindungsdomäne von PARP oder eine zumindest teilweise katalytisch nicht aktive PARP codiert, insertiert und in Tumorzellen eingebracht, um die dort vorhandene PARP in trans dominanter Weise zu hemmen, wodurch die Reparatur von DNA-Schäden dra stisch in ihrer Geschwindigkeit vermindert wird und die Tumorzelle mit großer Wahrscheinlichkeit abstirbt. Die vorliegende Erfindung beruht nun auf der dar über hinausgehenden Erkenntnis, daß zur Vermeidung von genomischer Instabili tät in Tumorzellen nicht die PARP zu hemmen ist, sondern für eine Überexpres sion von PARP in Tumorzellen zu sorgen ist. Diese Erkenntnis ist natürlich auf Normalzellen übertragbar, wo dieser Ansatz im Sinne einer "Krebsprophylaxe" wirken soll.

Der vorstehende Ausdruck "zur Gentherapie geeigneter Vektor" umfaßt jegliche Vektoren, die alleine oder zusammen mit anderen Mitteln in der Gentherapie ver wendet werden können. Dies sind z. B. Plasmid-Vektoren und Virus-Vektoren, die integrierende oder nicht-integrierende Vektorsysteme sein können. Von den Virus-Vektoren sind insbesondere solche von Adenovirus, Herpes Simplex Virus, Adeno-assoziiertem Virus (nachstehend mit AAV bezeichnet), "Minute virus of mice" (nachstehend mit MVM bezeichnet) und Retroviren zu nennen. Ganz besonders bevorzugt werden Virus-Vektoren von AAV, z. B. AAV-sub201 (vgl. Samulski, R.J. et al., J. Virology 61, (1987), 3096-3101), von MVM z. B. pSR2 (vgl. Russell, S.J. et al., J. Virology 66, (1992), 2821-2828) und von Retroviren, z. B. N2 (vgl. Keller, G. et al., Nature 318, (1985), 149-154). Es können auch nicht-virale Vektorsysteme zum Einsatz kommen, wie z. B.

- die Komplexierung der Fremd-DNA mit einem GAL4/Invasin-Fu sionsprotein (Paul et al., Gene Ther. 8, S. 1253-1262 (1997)) oder mit Peptiden (Hart et al., Gene Ther. 2, S. 552-554 (1995); Gott schalk et al., Gene Ther. 3, S. 48-57 (1996));
- verbesserte lipidbasierte Vektoren (z. B. DNA-Assoziation an kationi sche Liposomen; DNA-Verpackung in neutralen oder anionischen Liposomen; liposomen-verpackte, Polykationen-kondensierte DNA; Lee et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, S. 173-206 (1997))
- T7-RNA-Polymerase-basierte Vektoren (Chen et al., Cancer Gene Ther. 2, S. 281-289 (1995);
- die "Transferrinfektion" (Zatloukal et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91, S. 5148-5152 (1994));
- die direkte Injektion der gereinigten DNA von Expressionsplasmiden ohne weitere Zusätze (Wolff, Neuromuscul. Disord. 7, S. 314-318 (1997)).

Erfindungsgemäß wird in einen vorstehenden Vektor eine Insert-DNA eingefügt, die für die im wesentlichen vollständige genetische Information von PARP codiert. Der Begriff "im wesentlichen vollständige genetische Information" bedeutet, daß Insertionen, Deletionen, Basenaustausche oder Modifikationen stattgefunden haben können, die jedoch die Funktion der PARP nicht verändern. Eine solche funktionelle PARP muß katalytisch aktiv sein und muß durch DNA-Strangbrüche aktivierbar sein.

Eine vorstehende Insert-DNA kann aus einem beliebigen Organismus, z. B. aus Mensch oder Tier oder Pflanzen, stammen. Vorzugsweise wird eine Insert-DNA aus dem Menschen, insbesondere menschliche cDNA und besonders bevorzugt jene von Fig. 1 oder eine durch ein oder mehrere Nukleotide davon unterschiedli che DNA verwendet. Eine davon "durch ein oder mehrere Nukleotide davon unterschiedliche DNA" bedeutet, daß die Funktion der PARP trotz Basenaustau sche erhalten geblieben ist. Dies schließt auch allelische Varianten ein.

Die Einfügung vorstehender Insert-DNA in den Vektor erfolgt derart, daß die Insert-DNA exprimiert werden kann. Dies kann erreicht werden, indem die Insert-DNA in eine im Vektor vorhandene Expressionseinheit in Phase inseriert wird. Dazu kann es notwendig sein, eine in der Expressionseinheit vorliegende DNA zumindest teilweise zu entfernen. Auch kann es vorteilhaft sein, Elemente der vorhandenen Expressionseinheit, wie Enhancer, Promotor oder Polyadenylie rungssignale, zumindest teilweise durch andere zu ersetzen. Vorzugsweise wird in eine Expressionseinheit ein Promotor eingeführt, der spezifisch für eine Gewe be-Art ist, wodurch die Expression der unter der Kontrolle des Promotors stehen den Insert-DNA gewebespezifisch wird. Besonders bevorzugt ist ein Promotor, der in Tumorzellen aktiv ist. Ein Beispiel eines solchen Promotors ist der P4-Promotor von MVM (vgl. Russell, S.J. et al., vorstehend).

Die Expression vorstehender Insert-DNA kann ferner in einer Expressionseinheit erreicht werden, die hierzu in den Vektor eingeführt werden muß. Für diese Ex pressionseinheit gelten auch die vorstehenden Ausführungen.

Im Falle von Virus-Vektoren erweist es sich oftmals als günstig, die Insert-DNA in eine im Vektor vorhandene Expressionseinheit einzufügen. Die hiermit u. U. verbundene Entfernung oder Teilentfernung von in der Expressionseinheit vor liegender Virus-DNA führt dann zu einem Virus-Vektor, der in einer Virus-Funk tion einen Defekt aufweist. Dieser Defekt kann als Selektionsmarker genutzt werden. Andererseits kann der Defekt, wenn nötig, durch übliche Verfahren, wie Komplementation in trans, ausgeglichen werden.

Erfindungsgemäß werden Virus-Vektoren bevorzugt, in denen die Insert-DNA so eingefügt ist, daß die Virus-Vektoren alleine nicht mehr zur Bildung der durch sie codierten Viren in der Lage sind. Erfindungsgemäß bevorzugte Vektoren sind in Fig. 3 gezeigt.

Durch übliche Komplementationsverfahren können allerdings auch die durch die Virus-Vektoren codierten Viren gebildet werden. Beispielsweise wird ein das PARP-Insert enthaltender AAV^rep--Vektor in Zellen transfiziert, die gleichzeitig mit einem das rep-Gen exprimierenden DNA-Konstrukt cotransfiziert sind. Es werden Viren erhalten. Diese eignen sich gut zur Gentherapie, da sie sich im Patienten nicht vermehren können.

Durch Transfektion eines Retrovirus-Vektor, der das PARP-Insert enthält, in eine übliche Packaging-Zellinie wird das durch den Virus-Vektor codierte Virus erhal ten. Dieses eignet sich ebenfalls gut zur Gentherapie.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch Viren, die durch vor stehende Virus-Vektoren codiert werden.

Erfindungsgemäße Vektoren und Viren zeichnen sich dadurch aus, daß sie die Entstehung von genomischer Instabilität in Normal- und Tumorzellen hemmen können. Sie eignen sich daher bestens, in Therapien eingesetzt zu werden, wo einer genomischen Instabilität vorgebeugt werden soll. Ganz besonders ist die Eignung der erfindungsgemäßen Vektoren und Viren in der Behandlung von Tumoren, insbesondere zusammen mit konventionellen Bestrahlungs- und/oder Zytostatika-Verfahren, zu sehen. Mit den erfindungsgemäßen Vektoren und Viren behandelte Tumorzellen zeigen erfreulicherweise eine vermehrte Tendenz zum Absterben. Hierbei schlägt besonders zu Buche, daß die erfindungsgemäßen Viren und Vektoren gewebe(tumor)-spezifisch aktiv sein können. Die Effizienz von Strahlen- und Chemotherapie kann damit in hervorragender Weise gesteigert werden. Dazu werden die Tumorzellen vor der geplanten Strahlen- bzw. Chemo therapie durch systemische bzw. intratumorale Applikation des Gentherapievek tors transduziert. Infolge der dann zu erwartenden übersteigerten Poly(ADP- Ribosyl)ierung als zelluläre Antwort auf die DNA-Schädigung durch Strahlen- bzw. Chemotherapie kommt es zur spezifischen Hemmung des Phänomens "genomischer Instabilität" in denjenigen Tumorzellen, die den Therapiestoß überleben. Erwartungsgemäß kommt es zum Ausbleiben von weiterer Tumorzell- Malignisierung und der gefürchteten Therapie-Resistenz. Auch für gesundes Gewebe bei Krebspatienten bzw. für gesunde Personen empfiehlt sich, ins besondere wenn es bereits Hinweise auf ein erhöhtes Krebsrisiko gibt, eine wie derholte Transduktion der Zellen durch systemische Applikation des Gentherapie vektors. Die vorliegende Erfindung ist richtungsweisend für die gentherapeuti sche "Krebsprophylaxe" und die Behandlung schwerster Erkrankungen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Fig. 1 zeigt die Nukleotidsequenz der cDNA der humanen Poly(ADP-Ribo se)-Polymerase

Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenz der humanen Poly(ADP-Ribose)-Poly merase

Fig. 3 erfindungsgemäßer AAV^rep-/cap--Vektor und retroviraler PARP-Vektor

Fig. 4a, b SCE-Frequenzen in COMF-Zellen

Fig. 4c, d SCE-Frequenzen in COR4-Zellen

Fig. 5a, b SCE-Frequenzen in menschlichen HelNDc-Zellen

Fig. 5c, d SCE-Frequenzen in menschlichen HertTAKon-Kontrollzellen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiele Beispiel 1 Herstellung des erfindungsgemäßen Vektors AAV^rep-/cap--PARP

Es wird von dem Vektor AAV-sub201 (Samulski, R.J. et al., vorstehend) ausge gangen. Dieser Vektor wird mit dem Restriktionsenzym Xbal gespalten und sämtliche AAV-Anteile außer den invertierten terminalen Repetitionen werden entfernt. Die Enden des Vektor-Fragments werden "geglättet" In dieses wird ein Insert, P4-PARP-poly A, eingefügt, das von 5, nach 3' folgende Sequenzen mit jeweils geglätteten Enden umfaßt: (1) ein 259 bp BamHI/Ncol-Fragment, das den P4-Promotor enthält. Dieses Fragment stammt z. B. aus dem Plasmid pEG618 (vgl. Astell, C. et al., J. Virology 57, (1986), 656-669); (II) ein durch Partialver dau erzeugtes 3,6 kb Smal/HindIII-Fragment aus pPARP31 (vgl. van Gool et al., Eur. J. Biochem. 244 (1997), 15-20), das sowohl den 3,0 kb offenen Lese rahmen als auch das 630 bp HSV-Thymidinkinase Poly-A-Signal aufweist. Es wird der Vektor AAV^rep-/cap-PARP erhalten.

Beispiel 2 Herstellung des erfindungsgemäßen retroviralen PARP-Vektors

Es wird von dem Vektor N2 (vgl. Keller, G. et al., vorstehend) ausgegangen. Dieser Vektor wird mit EcoRI-Partialverdau 3' des Neomycin-Gen geöffnet. In den Vektor werden dann von 5, nach 3' folgende Sequenzen am 3'-Ende des Neomycin-Gens inseriert: (I) das 0,7 kb poly-A-Signal des β-Globin-Gens (z. B. das EcoRI/SaII-Fragment aus pECV; vgl. Berg, B.G.M. et al., Gene 4 (1989), 407-417); (II) ein 259 bp BamHI/Ncol-Fragment, das den P4-Promotor enthält (vgl. Beispiel 1, (I)); (III) ein durch Partialverdau erzeugtes 3,6 kb Smal/HindIII-Frag ment aus pPARP31 (vgl. Beispiel 1, (II)). Es wird der retrovirale PARP-Vektor erhalten.

Beispiel 3 Hemmung der Entstehung von genomischer Instabilität

Anhand von induzierbar PARP-überexprimierenden Transfektanten wird die Aus wirkung der PARP-Überexpression auf die genomische Stabilität von Zellen unter Bedingungen von genotoxischem Streß untersucht. Als Meßparameter dient die Häufigkeit von Schwesterchromatid-Austausch (SCE)-Vorgängen, ein allgemein anerkannter Marker für genomische Instabilität und ein wichtiger Mechanismus sowohl für die Entstehung von Gendeletionen als auch Genamplifikationen ("un equal sister-chromatid exchange")

a) Durch stabile Transfektion der Hamsterzellinie CO60 mit einem Expres sionsplasmid für den menschlichen Glucocorticoidrezeptor unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors (Kumar, V. et al., Cell 51, S. 941-951, 1987) wurde die Transfektante COR4 erhalten. Durch stabile Trans fektion von COR4-Zellen mit einem auf pPARP31 basierenden Expres sionsplasmid für die vollständige menschliche PARP unter der Kontrolle des "Mouse Mammary Tumor Virus Long Terminal Repeat (MMTV-LTR)- Promotors" (= pPARP 93) wurde die Glucocorticoid-induzierbare Trans fektante COMF erhalten.
Es wurden 3 × 10⁵ Zellen COMF bzw. COR4 in Kulturflaschen (75 cm²) mit 20 ml D-MEM, 10% FKS mit 1% Penicillin/Streptomycin ausgesät (t = -24h). Nach 24 Stunden Kultur (t = Oh) erfolgte die Zugabe von Dexame thason (Endkonzentration 10^-7 M) zur Induktion der Transgenexpression. Danach weitere 24h Kultur. Dann Zugabe von 460 µl Brom-Desoxyuridin (Brd U) Gebrauchslösung (= 270 µg/ml BrdU in PBS) zur 20 ml Kultur (t = +24h). Nachfolgend Zugabe von MNNG-(N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosogua nidin; Endkonzentration 2 µM) bei t = +32h. Zum Zeitpunkt t = +51h erfolgte Zugabe von 20 µl Demecolcine-Stammlösung (10 µg/ml Demecol cine; Fa. Sigma)/20 ml Kultur, dann Inkubation für weitere 4h im Brut schrank. Die Ernte der mitotischen Zellen sowie die weitere Behandlung zur Bestimmung der SCE pro Mitose erfolgte nach dem bekannten Stan dardverfahren (Perry et al., Nature 258, S. 121-125 (1974)).
Zusammenfassend ist festzustellen, daß es nach Inkubation von COMF-Zellen mit Dexamethason (100 nM) über 24 Std. zur starken Überexpres sion der menschlichen PARP in den Zellkernen, zu einer Steigerung des zellulären Gehalts an Poly(ADP-Ribose) nach Gamma-Bestrahlung der Zellen auf das 2- bis 5-fache (gemessen 10 Min. nach Bestrahlung) sowie zu einer signifikant verminderten Häufigkeit von MNNG-induzierten SCEs (s. Fig. 4a und 4b) kommt. In den Ausgangszellen COR4, in denen es nicht zur PARP-Überexpression kommt, ist die Dexamethason-Behandlung jeweils folgenlos (Fig. 4c und 4d).
b) Durch stabile Transfektion der menschlichen Zervixkarzinomzellinie HeLa mit einem Expressionsplasmid für den tetrazyklinsensitiven Transaktivator rtTA (Plasmid pUHD172-1neo; vgl. Gossen et al., Science 268 S. 1766-1769, 1995) wurde die Transfektante HertTA erhalten. Die vollständige menschliche cDNA für PARP wurde in Plasmid pUHD10-3 kloniert und steht dort unter der Kontrolle eines Tetrazyklin/rtTA-sensitiven Promotors (pUHD10-3; vgl. Gossen et al., Science 268 S. 1766-1769, 1995). Durch stabile Transfektion von HertTa-Zellen mit diesem so erhaltenen Expressionsplasmid wurde die Doxycyclin-induzierbare Transfektante HelNDc erhalten. Diese Zellinie enthält zusätzlich das Hygromycinresi stenzplasmid pTKHygro (Küpper et al., Mol. Cell. Biol. 15, S. 3154-3163, 1995). Die Kontrollzellinie HertTAKon wurde durch stabile Transfektion von HertTA mit pTKHygro (ohne PARP-Expressionskassette) erhalten.
Es wurden 3 × 10⁵ Zellen HelNDc- bzw. HertTAKon in Kulturflaschen (75 cm²) mit 20 ml D-MEM, 10% FKS mit 1% Penicillin/Streptomycin ausge sät (t = -24h). Nach 24 Stunden Kultur (t = Oh) erfolgte die Zugabe von Doxycyclin (1 µg/ml Endkonzentration) zur Induktion der Transgenexpres sion. Danach weitere 28h Kultur. Dann Zugabe von 460 µl Brom-De soxyuridin (Brd U) Gebrauchslösung (= 270 µg/ml BrdU in PBS) zur 20 ml Kultur (t = +28h). Nachfolgend Zugabe von MNNG (N-Methyl-N'-Nitro-N- Nitrosoguanidin; 0,1 µM Endkonzentration) bei t = +48h. Zum Zeitpunkt t = +72h erfolgte Zugabe von 20 µl Demecolcine-Stammlösung (10 µg/ml Demecolcine; Fa. Sigma)/20 ml Kultur, dann Inkubation für weitere 4h im Brutschrank. Die Ernte der mitotischen Zellen sowie die weitere Be handlung zur Bestimmung der SCE pro Mitose erfolgte nach dem bekann ten Standardverfahren (Perry et al., Nature 258, S. 121-125 (1974)).
Zusammenfassend ist festzustellen, daß es nach Inkubation von HelNDc-Zellen mit Doxycyclin über 48 Stunden zur Überexpression der mensch lichen PARP in den Zellkernen, zu einer Steigerung des zellulären Gehalts an Poly(ADP-Ribose) nach Gamma-Bestrahlung der Zellen auf das 1,5- bis 1,8-fache (gemessen 10 Min. nach Bestrahlung) sowie zu einer signifikant verminderten Häufigkeit von MNNG-induzierten SCEs (Fig. 5a und 5b) kommt. In den Kontrollzellen HertTAkon, in denen es nicht zur PARP-Überexpression kommt, ist die Doxycyclin-Anwendung jeweils folgenlos (Fig. 5c und 5d).

Als Ergebnis wird festgestellt, daß durch die Überexpression der PARP sowohl in den Hamsterzellen (s. Fig. 4a, b) als auch in den humanen Zellen (s. Fig. 5a, b) die durch das Alkylans N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG) induzier te Häufung von SCEs pro Chromosom signifikant vermindert wird. In den ent sprechenden Kontrollzellinien ohne PARP-Fremdgen (Fig. 4c, d und Fig. 5c, d) bewirkt die Einwirkung der Fremdgen-Indikatorsubstanzen Dexamethason bzw. Doxycyclin keinerlei Veränderung der SCE-Rate. Hierdurch wird die Spezifität des Effekts der SCE-Hemmung durch die PARP-Überexpression bewiesen. Die Zytotoxizität der MNNG-Behandlung wird weder in den COMF-Hamsterzellen noch in den menschlichen HelNDc durch die PARP-Überexpression vermindert. Letzteres beweist, daß die verminderte SCE-Rate nicht durch eine verbesserte DNA-Reparatur bedingt ist.

Claims

1. Vektor mit einer exprimierbaren Insert-DNA, die für die im wesentlichen vollständige genetische Information der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase codiert, wobei der Vektor zur Gentherapie geeignet ist.

2. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor auf einem Virus-Vektor beruht.

3. Vektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Virus-Vektor ein Adeno-assoziierter Virus- oder ein Retrovirus-Vektor ist.

4. Vektor nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Poly(ADP-Ribose)-Polymerase codierende DNA die Sequenz von Fig. 1 oder eine durch ein oder mehrere Nukleotide davon unterschiedliche Sequenz aufweist.

5. Vektor nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Insert-DNA in einem Tumor und/oder in Normalgewebe exprimierbar ist.

6. Verfahren zur Herstellung des Vektors nach Anspruch 1, umfassend die Einfügung der Insert-DNA nach Anspruch 1 in einen Vektor, der zur Gen therapie geeignet ist, derart, daß eine Expression der Insert-DNA durch eine bereits im Vektor vorhandene oder ebenfalls inserierte Expressions einheit erfolgen kann.

7. Virus, codiert durch den Vektor nach Anspruch 2 oder 3.

8. Verwendung des Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder des Virus nach Anspruch 7 zur Gentherapie.

9. Verwendung nach Anspruch 8 zur Therapie und/oder Prophylaxe von Tumorerkrankungen.