JP2002505855A - 遺伝子治療に使用されるベクター及びウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼに関する実質的に完全な遺伝情報をコードする発現可能な挿入ＤＮＡを含有し、かつ遺伝子治療に適するベクターに関する。また、本発明は、遺伝子治療に適する該ベクター及びウイルスの製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、遺伝子治療に適するベクター及びウイルス、その製造方法並びにそ
の使用に関する。

【０００２】 一般的な腫瘍の治療法は、腫瘍の手術によるできるだけ完全な除去、及び放射
線照射及び／又は細胞増殖抑制剤の全身投与または部分投与（化学療法）による
患者の治療を含む。この点について、この放射線療法及び／又は化学療法は、腫
瘍の手術による除去の前又は後に行うことができ、しばしば手術不可能な腫瘍の
場合の唯一の治療可能性ですらある。放射線療法及び／又は化学療法により、ま
だ存在する腫瘍組織及び形成された転移のそれぞれを鎮静することが試みられて
いる。これらの治療方法は、腫瘍細胞においてＤＮＡ損傷／ＤＮＡ合成阻害を誘
導し、これにより腫瘍細胞を鎮静する。健常な組織に対する重度の副作用のため
、治療のために計画される全投与量は、通常、数週間及び数カ月にわたって分割
された形態で与えられる。しかしながら、細胞傷害であるような定量以上の用量
に抗して生き残る腫瘍細胞において、この処理はゲノム不安定性を導きうるし、
又はそれを増強しうる。ゲノム不安定性は、構造的又は数的な染色体の異常、遺
伝子の再配列、完全な又は部分的な遺伝子欠失、遺伝子増幅、点突然変異等が起
こることを意味する。もちろん、これらの遺伝子の変化は、正常なタンパク質の
過剰発現、過少発現若しくは非制御（ｄｅｒｅｇｕｌｉｅｒｔｅｎ）発現、又は
異常タンパク質（個々のアミノ酸交換、タンパク質の切断等）の発現を導くこと
により、関連する程度まで細胞の遺伝子発現に影響しうる。もし、細胞の成長、
分化条件、プログラムされた細胞死又は表面タンパク質の発現を制御するタンパ
ク質が影響をうけた場合、これは、妨害された増殖制御、不死化、分化妨害、「
免疫エスケープ（Ｉｍｍｕｎ−Ｅｓｃａｐｅ）」、転移及び病理学的血管形成を
含む腫瘍細胞の典型的な「悪性表現型」を直接導きうる。したがって、細胞傷害
的な定量以上の用量に抗して生き残る腫瘍細胞におけるゲノム不安定性の誘導又
は増強は、悪性状態にするプロセスが意図されずに加速されるという事実、例え
ば、治療耐性又は転移への傾向が生じることにより患者の治癒が最終的に不可能
になるという事実を導きうる。また、これは、多くの癌患者において放射線療法
又は化学療法により寛解が初期に誘導されるが、治療のさらなる過程において、
腫瘍は、治療耐性となり、患者は最終的にそれが原因で死ぬという臨床経験に一
致する。したがって、これらの現在の腫瘍治療に関連する成功はほとんどない。

【０００３】 しかしながら、まだ健常であるとみなされる細胞（「正常細胞」）の場合でも
ゲノム不安定性は生じ、おそらく腫瘍発現の駆動力とさえみなされうる。これは
、以下の事実により支持される： ａ）一般的な特徴が、すでに幼少の発端者の正常細胞においてゲノム不安定性が
増強されている、種々の単一遺伝子性遺伝性疾患（例えば、ブルーム症候群、ウ
ェーバ症候群等）がいくつかある。これらの症候群はすべて、癌の危険性の増加
に関連する。 ｂ）化学的及び物理的発癌性物質は、ゲノム不安定性を引き起こし得、このこと
は、初期に活性化された「無欠陥」修復システムの過負荷による「欠陥生成」Ｄ
ＮＡ修復系の結果（Ｉｎａｎｓｐｒｕｃｈｎａｈｍｅ）とみなされうる。同様に
、腫瘍ウイルスの特定の遺伝子産物は、宿主細胞においてゲノム不安定性を引き
起こしうる。

【０００４】 したがって、本発明の目的は、一般的な腫瘍治療を改善することができ、腫瘍
の形成及び発現に対する予防を行うことができる産物、特に、腫瘍細胞及び正常
細胞におけるゲノム不安定性の生成を回避することができる産物を提供すること
にある。

【０００５】 本発明によれば、これは、遺伝子治療に適し、かつポリ（ＡＤＰリボース）ポ
リメラーゼ（以下、ＰＡＲＰという）の実質的に完全な遺伝情報をコードする発
現可能な挿入ＤＮＡを含有したベクターにより達成することができる。

【０００６】 ＰＡＲＰは、高等真核生物の高度に保存された核酵素であり、ＤＮＡ鎖切断片
の存在下で、ポリ（ＡＤＰリボース）による細胞核タンパク質の共有結合修飾を
触媒する。この反応は、効率的な塩基除去修復、及び増殖している細胞のアルカ
リ化剤、酸化剤又はイオン化放射線照射によるＤＮＡ損傷の細胞傷害性効果から
の回復に貢献する。この発見は、これまで、ＰＡＲＰの阻害によって腫瘍細胞で
の細胞でのポリ（ＡＤＰリボース）産生を防止するのに使用されている。このこ
とにより、損傷性抗原に対する細胞の感作が検出され、腫瘍細胞の死滅が起こる
はずである。この治療上のアプローチは、例えば、独国特許第４４ ４４ ９４
９ Ｃ１号明細書に記載されている。この刊行物によれば、ＰＡＲＰ又は少なく
とも部分的に触媒的に不活化されたＰＡＲＰのＤＮＡ結合ドメインをコードする
、発現可能な挿入ＤＮＡが遺伝子治療に適したベクターに挿入され、トランスド
ミナント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔｅｎ）な様式で腫瘍細胞に挿入して内部
に存在するＰＡＲＰを阻害すると、ＤＮＡ損傷の修復がその割合について劇的に
低下し、かつ腫瘍細胞が非常に死滅しやすいようになる。ここで、本発明は、そ
れを超える知識、すなわち、腫瘍細胞におけるゲノム不安定性を回避するために
は、腫瘍細胞においてＰＡＲＰが阻害されなければならないのではなく、ＰＡＲ
Ｐの過剰発現が確保されなければならないことに基づいている。もちろん、該知
識は、このアプローチが「癌予防」が意味する範囲で有効となるものとする正常
細胞に適用可能である。

【０００７】 上記の「遺伝子治療に適するベクター」という表現は、遺伝子治療においてそ
のままで、又は他の産物と組み合わせて使用することができる任意のベクターを
包含する。それらには、例えば、組み込まれていても組み込まれていなくてもよ
いベクター系であるプラスミドベクター及びウイルスベクターが含まれる。ウイ
ルスベクターのうち、特にアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノ随伴
ウイルス（以下、ＡＡＶという）、「マウスの微小ウイルス」（以下、ＭＶＭと
いう）及びレトロウイルスを挙げるべきであろう。ＡＡＶのウイルスベクター、
例えば、ＡＡＶ−ｓｕｂ２０１（サムルスキー（Ｓａｍｕｌｓｋｉ），Ｒ．Ｊ．
ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１，（１９８７），３０９６−３１０１参照のこ
と）、ＭＶＭのウイルスベクター、例えば、ｐＳＲ２（ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ
ｌ），Ｓ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６６，（１９９２），２８２１−２
８２８参照のこと）及びレトロウイルスのウイルスベクター、例えば、Ｎ２（ケ
ラー（Ｋｅｌｌｅｒ），Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１８，（１９８５），１４９
−１５４）は、特に好ましい。また、 − 外来ＤＮＡと、ＧＡＬ４／インベーシン融合タンパク質（ポール（Ｐａｕｌ
）ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８、１２５３〜１２６２頁（１９９７））又は、ペ
プチド（ハート（Ｈａｒｔ）ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２、５５２〜５５４頁（
１９９５）；ゴットシャルク（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ）ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
，３、４８〜５７頁（１９９６））との複合体； − 改良された脂質系ベクター（例えば、カチオン性リポソームとのＤＮＡ会合
物；中性又はアニオン性リポソーム内へのＤＮＡパッケージング；リポソームで
パッケージングされたポリカチオン凝縮ＤＮＡ；リー（Ｌｅｅ）ら、Ｃｒｉｔ．
Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１４、１７３〜２０
６頁（１９９７）； − Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ系ベクター（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２、２８１〜２８９頁（１９９５））； − 「トランスフェリン感染」（ザトロウカル（Ｚａｔｌｏｕｋａｌ）ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ− ＵＳＡ ９１、５１４８〜５１５２頁（
１９９４））； − さらなる付加物なしの発現プラスミドの精製ＤＮＡの直接注入（ヴォルフ（
Ｗｏｌｆｆ）、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７、３１４〜３１８頁
（１９９７）） 等の非ウイルスベクター系を使用することも可能である。

【０００８】 本発明によれば、挿入ＤＮＡは、ＰＡＲＰの実質的に完全な遺伝情報をコード
する上記ベクターに挿入される。「実質的に完全な遺伝情報」という表現は、挿
入、欠失、塩基置換又は修飾が起こりうるが、ＰＡＲＰの機能を変えないことを
意味する。かかる機能的ＰＡＲＰは、触媒的に活性でなければならず、かつＤＮ
Ａ鎖切断片により活性化されなければならない。

【０００９】 上述の挿入ＤＮＡは、任意の生物、例えば、ヒト又は動物又は植物に由来しう
る。ヒト由来の挿入ＤＮＡ、特に、ヒトｃＤＮＡ、特に好ましくはＦｉｇ．１の
もの又はそれとは１個若しくは数個のヌクレオチドが異なるＤＮＡを使用するこ
とが好ましい。「それとは１個若しくは数個のヌクレオチドが異なるＤＮＡ」は
、塩基置換にもかかわらずＰＡＲＰの機能が維持されていることを意味する。こ
れは、対立遺伝子バリアントも包含する。

【００１０】 上記挿入ＤＮＡのベクターへの挿入は、該ＤＮＡが発現されうるように行なわ
れる。これは、ベクター内に存在する発現単位に同調して挿入ＤＮＡを挿入する
ことにより達成されうる。この目的のためには、発現単位に存在するＤＮＡを少
なくとも一部除去することが必要でありうる。また、エンハンサー、プロモータ
ー又はポリアデニル化シグナルなどの利用可能な発現単位のエレメントを少なく
とも部分的に、他のもので置き換えることも有利でありうる。好ましくは、プロ
モーターにより制御される挿入ＤＮＡの発現が組織特異的となるように、組織の
種類に特異的であるプロモーターが発現単位に挿入される。腫瘍細胞において活
性なプロモーターが特に好ましい。そのようなプロモーターの例は、ＭＶＭのＰ
４プロモーターである（ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ），Ｓ．Ｊ．ら、上記）。

【００１１】 上記の挿入ＤＮＡの発現は、この目的のためにベクター内に挿入されるべきで
あろう発現単位においても達成されうる。上記の記載はこの発現単位にも当ては
まる。

【００１２】 ウイルスベクターの場合、ベクター内に存在する発現単位に挿入ＤＮＡを挿入
することが好ましいということがしばしば証明される。発現単位に存在するウイ
ルスＤＮＡであって、それと関連する特定の環境下にあるＤＮＡの除去又は部分
的な除去は、ウイルス機能の欠損を有するウイルスベクターをもたらす。この欠
損は、選択マーカーとして使用することができる。一方で、必要であれば、イン
トランス相補（Ｋｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓ）等の通常
の方法により該欠損を補うことができる。

【００１３】 本発明によれば、ウイルスベクターそれ自体が、自身によってコードされるウ
イルスをもはや形成しないように挿入ＤＮＡが挿入されたウイルスベクターが好
ましい。本発明において好ましいベクターはＦｉｇ．３に示される。

【００１４】 しかしながら、ウイルスベクターによりコードされるウイルスは、通常の相補
方法によっても形成されうる。例えば、ＰＡＲＰ挿入物を含むＡＶＶ^rep-ベクタ
ーは、ｒｅｐ遺伝子を発現するＤＮＡ構築物で同時にコトランスフェクトされる
細胞にトランスフェクトされる。ウイルスが得られる。それらは、患者において
複製することができないので、遺伝子治療に十分に適する。

【００１５】 ウイルスベクターによりコードされるウイルスは、ＰＡＲＰ挿入物を含むレト
ロウイルスベクターの一般的なパッケージング細胞株におけるトランスフェクシ
ョンにより得られる。それも遺伝子治療に十分に適する。

【００１６】 したがって、本発明の主題は、上記のウイルスベクターによりコードされるウ
イルスにも関する。

【００１７】 本発明のベクター及びウイルスは、正常細胞及び腫瘍細胞においてゲノム不安
定性の形成を阻害することができる点において自身を差別化する。したがって、
それらは、ゲノム不安定性が回避されなければならない治療における使用に完全
に適している。本発明のベクター及びウイルスの適性は、特に腫瘍の治療におい
て、特に、従来の放射線療法及び／又は細胞増殖抑制剤を使用する方法との併用
において見られるはずである。本発明のベクター及びウイルスにより治療される
腫瘍細胞は、幸い死滅する傾向の増加を示す。ここで、本発明のベクター及びウ
イルスは、組織（腫瘍）特異的活性を示すであろうという恩恵をもたらす。放射
線療法及び／又は化学療法の効率は、これにより非常によく増加しうる。この目
的のためには、計画された放射線療法及び化学療法のそれぞれの前に、遺伝子治
療ベクターの全身投与及び／又は腫瘍内投与により腫瘍細胞が形質導入される。
この場合に期待される過剰なポリ（ＡＤＰリボシル）化により、放射線療法又は
化学療法によるＤＮＡ損傷に対する細胞応答として、定量以上の用量に抗して生
き残るような腫瘍細胞における現象である「ゲノム不安定性」の特異的阻害があ
る。期待されるように、さらに腫瘍細胞が悪性となることはなく、懸念された治
療耐性は生じない。特に、すでに癌の危険性の増加が言及される場合、癌患者又
は健常な人の健常な組織に対して、遺伝子治療ベクターの全身投与による細胞の
反復形質導入することも推奨されている。本発明は、遺伝子治療による「癌予防
」及び最も重篤な疾患の治療のトレンド創出である。

【００１８】 以下の実施例は本発明を説明する。

【００１９】 実施例 実施例１：本発明のベクターＡＡＶ^rep-/cap- −ＰＡＲＰの製造 ベクターＡＡＶ−ｓｕｂ２０１（サムルスキー（Ｓａｍｕｌｓｋｉ），Ｒ．Ｊ
．ら、上記）をベースとして使用する。このベクターを制限酵素ＸｂａＩにより
切断し、逆方向末端反復を除くすべてのＡＶＶ部分を除く。ベクター断片の末端
を「平滑」にする。その内部には、挿入物、Ｐ４−ＰＡＲＰ−ポリＡが挿入され
ており、該挿入物は、５’から３’まで各々平滑末端を有する以下の配列： （Ｉ）Ｐ４プロモーターを含む２５９ｂｐのＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩ断片。この断
片は、例えば、プラスミドｐＥＧ６１８（アステル（Ａｓｔｅｌｌ），Ｃ．ら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７，（１９８６），６５６−６６９を参照のこと）に
由来する；（ＩＩ）部分消化により生成され、かつ３．０ｋｂのオープン・リー
ディング・フレームと６３０ｂｐのＨＳＶ−チミジンキナーゼポリ−Ａ−シグナ
ルとの両方を有するｐＰＡＲＰ３１（バン グール（ｖａｎ Ｇｏｏｌら、Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４（１９９７）、１５−２０を参照のこと）由来
の３．６ｋｂのＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片 を含有する。ベクターＡＡＶ^rep-/cap- −ＰＡＲＰが得られる。

【００２０】 実施例２：本発明のレトロウイルスＰＡＲＰベクターの製造 ベクターＮ２（ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ），Ｇ．ら、上記参照のこと）をベース
として使用する。このベクターを、ネオマイシン遺伝子の３’でのＥｃｏＲＩ部
分消化により開裂する。次いで、５’から３’に以下の配列がベクター中のネオ
マイシン遺伝子の３’末端に挿入されている：（Ｉ）β−グロビン遺伝子の０．
７ｋｂポリ−Ａ−シグナル（例えば、ｐＥＣＶ由来のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片
；バーグ（Ｂｅｒｇ），Ｂ．Ｇ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ ４（１９８９），４０７−
４１７を参照のこと）；（ＩＩ）Ｐ４プロモーターを含む２５９ｂｐのＢａｍＨ
Ｉ／ＮｃｏＩ断片（実施例１、（Ｉ）を参照のこと）；（ＩＩＩ）部分消化によ
り生成された、ｐＰＡＲＰ３１由来の３．６ｋｂのＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断
片（実施例１、（ＩＩ）を参照のこと）。レトロウイルスＰＡＲＰベクターを得
る。

【００２１】 実施例３：ゲノム不安定性の発生（Ｅｎｔｓｔｅｈｕｎｇ）の阻害 誘導ＰＡＲＰ過剰発現トランスフェクタントにより、細胞のゲノム安定性に対
するＰＡＲＰ過剰発現の効果を、遺伝子毒性ストレスの条件下で調べる。ゲノム
不安定性の一般に認識されたマーカーであり、かつ遺伝子欠失の生成と遺伝子増
幅との両方に対する重要な機構（「不等姉妹染色分体交換」）である、姉妹染色
分体交換（ＳＣＥ）前駆体の頻度は、測定パラメータとしての役割を果たす。

【００２２】 ａ）初期ＳＶ４０プロモーターの制御下で、ヒトグリココルチコイドレセプタ
ー用の発現ベクターによるハムスター細胞株ＣＯ６０の安定なトランスフェクシ
ョンにより、トランスフェクタントＣＯＲ４を得た（クマール（Ｋｕｍａｒ），
Ｖ．ら、Ｃｅｌｌ ５１、９４１〜９５１頁、１９８７）。「マウス乳がんウイ
ルス長末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ））プロモーター」（＝ＰＡＲＰ ９３）の
制御下で、完全なヒトＰＡＲＰのためのｐＰＡＲＰ３１を基にした発現プラスミ
ドによるＣＯＲ４細胞の安定なトランスフェクションにより、グルココルチコイ
ド誘導トランスフェクタントＣＯＭＦを得た。

【００２３】 ３×１０⁵ 細胞のＣＯＭＦ及びＯＣＲ４のそれぞれを、２０ｍｌのＤ−ＭＥＭ
、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む１０％ＦＫＳの入った培養ビン（
７５ｃｍ² ）にまいた（ｔ＝−２４ｈ）。培養の２４時間（ｔ＝０ｈ）後、デキ
サメタゾン（最終濃度１０^-7Ｍ）を、導入遺伝子発現の誘導（Ｉｎｄｕｋｔｉｏ
ｎ）ために添加した。その後、培養を２４時間継続した。次いで、２０ｍｌ培養
物への４６０μｌのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）使用溶液（Ｇｅｂｒａ
ｕｃｈｓｌｏｅｓｕｎｇ）（＝ＰＢＳ中２７０μｇ／ｍｌのＢｒｄＵ）の添加（
ｔ＝＋２４ｈ）。次いで、ｔ＝＋３２ｈでのＭＮＮＧ−（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン；最終濃度２μＭ）の添加。ｔ＝＋５１ｈの時、
２０μｌのデメコルチン基準溶液（Ｓｔａｍｍｌｏｅｓｕｎｇ）（１０μｇ／ｍ
ｌデメコルチン；シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）／２０ｍｌ培養物）を添加した後、
インキュベーター内でさらに４時間インキュベートした。有糸分裂細胞（ｍｉｔ
ｏｔｉｓｃｈｅｎ Ｚｅｌｌｅｎ）の回収、及び有糸分裂あたりのＳＣＥの測定
のためのさらなる処理を、公知の標準方法（ペリー（Ｐｅｒｒｙ）ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ２５８、１２１〜１２５頁（１９７４））に従って行なった。

【００２４】 まとめると、ＣＯＭＦ細胞のデキサメタゾン（１００ｎＭ）との２４時間にわ
たるインキュベーションは、細胞核におけるヒトＰＡＲＰの強い過剰発現、細胞
のガンマ線照射後のポリ（ＡＤＰリボース）の細胞内含有量の２〜５倍の値への
増加（照射１０分後、測定）、及びＭＮＮＧ誘導ＳＣＥの頻度の有意な低下をも
たらすことがのべられるべきである（Ｆｉｇ．４ａ及び４ｂ参照のこと）。ＰＡ
ＲＰ過剰発現が起こらない最初の細胞ＣＯＲ４において、デキサメタゾン処理は
各々何の結果もなかった（Ｆｉｇ．４ｃ及び４ｄ参照のこと）。

【００２５】 ｂ）テトラサイクリン感受性トランス作用因子ｒｔＴＡ（プラスミドｐＵＨＤ
１７２−ｌｎｅｏ；ゴッセン（Ｇｏｓｓｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８、１
７６６〜１７６９頁、１９９５を参照のこと）のための発現ベクターによるヒト
子宮頸癌種細胞株ＨｅＬａの安定なトランスフェクションにより、トランスフェ
クタントＨｅｒｔＴＡを得た。ＰＡＲＰの完全なヒトｃＤＮＡを、それがテトラ
サイクリン／ｒｔＴＡ感受性プロモーターにより制御されるプラスミドｐＵＨＤ
１０−３にクローニングした（ｐＵＨＤ１０−３；ゴッセン（Ｇｏｓｓｅｎ）ら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８、１７６６〜１７６９頁、１９９５参照のこと）。こ
のようにして得た発現プラスミドによるＨｅｒｔＴＡ細胞の安定なトランスフェ
クションにより、ドキシサイクリン誘導トランスフェクタントＨｅＩＮＤｃを得
た。この細胞系は、ハイグロマイシン耐性プラスミドｐＴＫＨｙｇｒｏをさらに
含む（ケッパー（Ｋｕｅｐｐｅｒ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５、３
１５４〜３１６３頁、１９９５）。対照細胞株ＨｅｒｔＴＡＫｏｎを、ｐＴＫＨ
ｙｇｒｏによるＨｅｒｔＴＡの安定なトランスフェクションにより得た（ＰＡＲ
Ｐ発現カセットなし）。

【００２６】 ３×１０⁵ 細胞のＨｅＩＮＤｃ及びＨｅｒｔＴＡＫｏｎのそれぞれを、２０ｍ
ｌのＤ−ＭＥＭ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む１０％ＦＫＳの入
った培養ビン（７５ｃｍ² ）にまいた（ｔ＝−２４ｈ）。培養の２４時間（ｔ＝
０ｈ）後、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ最終濃度）を、導入遺伝子発現の誘
導ために添加した。その後、培養を２８時間継続した。その後、２０ｍｌ培養物
への４６０μｌのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）使用溶液（＝ＰＢＳ中２
７０μｇ／ｍｌのＢｒｄＵ）の添加（ｔ＝＋２８ｈ）。続いて、ＭＮＮＧ（Ｎ−
メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン；０．１μＭ最終濃度）のｔ＝
＋４８ｈでの添加。ｔ＝＋７２ｈの時、２０μｌのデメコルチン基準溶液（１０
μｇ／ｍｌデメコルチン；シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）／２０ｍｌ培養物）を添加
した後、インキュベーター内でさらに４時間インキュベートした。有糸分裂細胞
の回収、及び有糸分裂あたりのＳＣＥの測定のためのさらなる処理を、公知の標
準方法（ペリー（Ｐｅｒｒｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２５８、１２１〜１２５頁（
１９７４））に従って行なった。

【００２７】 まとめると、ＨｅＩＮＤｃ細胞のドキシサイクリンとの４８時間にわたるイン
キュベーションは、細胞核におけるヒトＰＡＲＰの過剰発現、細胞のガンマ線照
射後のポリ（ＡＤＰリボース）の細胞内含有量の１．５〜１．８倍の値への増加
（照射１０分後、測定）、及びＭＮＮＧ誘導性ＳＣＥの頻度の有意な低下をもた
らすことがはっきりのべられるべきである（Ｆｉｇ．５ａ及び５ｂ参照のこと）
。ＰＡＲＰ過剰発現が起こらない対照細胞ＨｅｒｔＴＡｋｏｎにおいて、ドキシ
サイクリン投与は各々何の結果もなかった（Ｆｉｇ．５ｃ及び５ｄ参照のこと）
。

【００２８】 その結果、ハムスター細胞（Ｆｉｇ．４ａ，ｂ参照のこと）及びヒト細胞（Ｆ
ｉｇ．５ａ，ｂ参照のこと）の両方におけるＰＡＲＰの過剰発現により、アルキ
ル化剤Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）により
誘導される染色体あたりのＳＣＥの蓄積は、有意に低下するといえる。ＰＡＲＰ
外来遺伝子のない対応の対照細胞において（Ｆｉｇ．４ｃ，ｄ及びＦｉｇ．５ｃ
，ｄを参照のこと）、外来遺伝子インディケーター物質デキサメタゾン及びドキ
シサイクリンのそれぞれの影響は、ＳＣＥ率を変化させない。ＰＡＲＰ過剰発現
によるＳＣＥ阻害の効果の特異性は、これにより証明される。ＭＮＮＧ処理の細
胞傷害性は、ＣＯＭＦハムスター細胞又はヒトＨｅＩＮＤｃのいずれにおいても
ＰＡＲＰ過剰発現によって低下しない。後者は、ＳＣＥ率の低下がＤＮＡ修復の
改善によって引き起こされないということを証明する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｆｉｇ．１は、ヒトポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼのｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列を示す。

【図２】 Ｆｉｇ．２は、ヒトポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼのアミノ酸配列を示
す。

【図３】 Ｆｉｇ．３は、本発明によるＡＡＶ^rep-/cap- ＰＡＲＰベクター及びレトロウ
イルスＰＡＲＰベクターを示す。

【図４】 Ｆｉｇ．４ａ，ｂは、ＣＯＭＦ細胞におけるＳＣＥ頻度を示す。

【図５】 Ｆｉｇ．４ｃ，ｄは、ＣＯＲ４細胞におけるＳＣＥ頻度を示す。

【図６】 Ｆｉｇ．５ａ，ｂは、ヒトＨｅＩＮＤｃ細胞におけるＳＣＥ頻度を示す。

【図７】 Ｆｉｇ．５ｃ，ｄは、ヒトＨｅｒｔＴＡＫｏｎ対照細胞におけるＳＣＥ頻度を
示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年５月５日（２０００．５．５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 35/76 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 マイヤー，ラルフ ドイツ連邦共和国 ルートヴィヒスハーフ ェン デー−67061 リヒァルト−デーメ ル−シュトラーセ ７ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 CA04 DA03 EA02 GA11 HA08 HA17 4B065 AA91X AA93X AA93Y AA95X AA97X AB01 AC14 BA02 CA27 CA44 4C084 AA13 NA14 ZB262 4C086 AA01 AA02 EA16 ZB26 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZB26

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遺伝子治療に適し、かつポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラー
   ゼの実質的に完全な遺伝情報をコードする発現可能な挿入ＤＮＡを含有してなる
   ベクター。
2. 【請求項２】 ベクターが、ウイルスベクターを基にしたものであることを
   特徴とする、請求項１記載のベクター。
3. 【請求項３】 ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター又はレト
   ロウイルスベクターであることを特徴とする、請求項２記載のベクター。
4. 【請求項４】 ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼをコードするＤＮＡが
   Ｆｉｇ．１の配列又はそれとは１個若しくは数個のヌクレオチドが異なる配列を
   含有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか記載のベクター。
5. 【請求項５】 挿入ＤＮＡが腫瘍及び／又は正常組織において発現可能であ
   ることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか記載のベクター。
6. 【請求項６】 ベクターにおいてすでに利用可能となっている発現単位、又
   は内部に同様に挿入された発現単位により挿入ＤＮＡが発現されうるように、遺
   伝子治療に適するベクターに請求項１記載の挿入ＤＮＡを挿入することを含む、
   請求項１記載のベクターの製造方法。
7. 【請求項７】 請求項２又は３記載のベクターによりコードされてなるウイ
   ルス。
8. 【請求項８】 遺伝子治療のための請求項１〜５のいずれか記載のベクター
   又は請求項７記載のウイルスの使用。
9. 【請求項９】 腫瘍性疾患の治療及び／又は予防を介助（Ｕｎｔｅｒｓｔｕ
   ｅｔｚｕｎｇ）するための請求項８記載の使用。