DE19732194C1 - Verfahren zur Gewinnung eines epithelialen Zellverbandes - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung eines epithelialen Zellverbandes, das den Zeitaufwand für die Züchtung humaner Haut- und Epidermistransplantate erheblich vermindert.

Es ist bekannt, daß bei ausgedehnten Hautdefekten oder schwer heilenden Wunden, z. B. großflächigen Verbrennungen oder chronischen Ulcera gute Behandlungserfolge mit autologen Transplantaten erzielt werden können. Hierbei werden dem Patienten gesunde Hautareale entnommen und auf das Wundgebiet desselben Patienten verpflanzt. Diese Verfahrensweise hat den Vorteil, daß die übertragene Hautfläche vom Organismus nicht abgestoßen wird. Die dem Patienten entnommenen gesunden Hautstücke sind allerdings in der Regel viel zu klein, um die defekten Hautpartien vollständig überdecken zu können.

Es sind deshalb auch schon Verfahren entwickelt worden, mit denen die dem Patienten entnommenen Hautstücke und die in ihnen enthaltenen Keratinozyten, Melanozyten und Fibroblasten in einer Zellkultur vermehrt werden können. Dieser als Expansion der Zellen bezeichnete Vorgang wird zweckmäßiger­ weise so durchgeführt, daß die in der Kultur gezüchteten Epidermiszellen anschließend auf ein Trägermaterial auf ge­ bracht werden, dort anwachsen und mit diesem Trägermaterial entweder transplantiert oder nach enzymatischer Ablösung von dem Trägermaterial als mehrschichtiger, konfluenter Zellrasen auf die Wunden aufgetragen werden.

So ist es aus dem Jpn. J. Cancer Res. 82, 1991, S. 553-558 bekannt, Epithelzellen in Kollagengelen zu kultivieren. Dabei werden die Zellen zunächst als Monolayer-Kulturen gehalten und dann in eine Kollagen-Kultur übertragen, die mit einem serumfreien Medium überströmt wird. Insbesondere unter dem Einfluß lactogener Hormone wird dann eine morphologische Ausgestaltung des Zellverbandes festgestellt.

Der derzeitige Stand der Technik auf dem Gebiet der Hautkultu­ ren zur Erzeugung von transplantationsfähigem Gewebe wird in der Veröffentlichung von H.O. Rennekampff, V. Kiessig, J.F. Hansbrough: Current concepts in the development of cultured skin replacements. Journal of Surgical Research 62 : 288-295 (1996) zusammenfassend beschrieben. Auch in Römpp Lexikon Biotechnologie, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1992 wird im Abschnitt "Tierzellkulturen" beschrieben, daß zur Gewinnung von Gewebekulturen zunächst eine Primärkultur in Rollerflaschen gezüchtet und dann zur Vergrößerung der Aufwuchsfläche auf Mikrocarriern kultiviert wird, um zu­ sammenhängende Zellverbände zu erhalten.

Die bisher entwickelten Verfahren sind jedoch noch mit erheblichen Nachteilen verbunden. Vor allem ist die Wachstums­ geschwindigkeit der Keratinozyten und auch die der Fibrobla­ sten noch recht gering. Die Zeitdauer zwischen der Entnahme des Zellmaterials und der Transplantation der autologen, expandierten Zellen sollte natürlich so kurz als möglich sein, weil erst nach erfolgter Transplantation der Heilungsprozeß beginnen kann.

Ein weiteres Problem besteht darin, eine ausreichende Adhäsion der Zellen an einem artifiziellen Substrat zu erreichen. Die Adhäsion ist mitbestimmend für die Proliferationsgeschwindig­ keit der Zellen und ist eine Voraussetzung für eine erfolgrei­ che Übertragung der Zellen aus der Kultur auf eine Wundfläche. Die Adhäsion kann zwar durch die Verwendung von "Feeder-layer- Fibroblasten" verbessert werden, jedoch erhöhen diese die Gefahr einer Abstoßung des Transplantats, so daß sie nach Möglichkeit nicht eingesetzt werden.

Schwierigkeiten bei der Transplantation können auch dadurch entstehen, daß der auf einem artifiziellen Substrat gezüchtete epitheliale Zellverband nach seinem enzymatischen Ablösen von dem Substrat Veränderungen der Zelloberflächen zeigt, durch die die Haftung des Transplantats auf dem Wundgewebe beein­ trächtigt wird.

Schließlich besteht auch die Gefahr, daß der auf dem Substrat herangewachsene epitheliale Zellverband nach Ablösung von seiner festen Grundlage schrumpft. Dieses Problem kann derzeit nur durch Aussäen von Zellsuspensionen auf biologisch abbaubaren Trägermaterialien gelöst werden.

Es stellte sich deshalb die Aufgabe, die bisher bekannten Verfahren zur Gewinnung von transplantationsfähigen Zellen menschlicher Haut zu verbessern und insbesondere zu be­ schleunigen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Gewinnung eines epithelialen Zellverbandes, bei dem eine Zellkultur von humanem Hautgewebe nach mehrtägiger Behandlung in einem Kulturmedium auf eine biologisch abbaubare Matrix, in der Fibroblasten enthalten sind, übertragen und einer mechanischen Beanspruchung ausgesetzt wird, bis die Matrixoberfläche mit einem zusammenhängenden, epithelialen Zellverband bedeckt ist.

Das für die Zellkultur verwendete humane Hautgewebe besteht aus Epithelzellen der Epidermis, also aus Keratinozyten, Melanozyten und Fibroblasten, die der Epidermis oder der Haut des Patienten entnommen und unter Zellkulturbedingungen vermehrt werden. Erfindungsgemäß wird das Wachstum des Zellverbandes durch das Einwirken mechanischer Reize wie Druck, Streckung, Stauchung oder das Einwirken von Scher­ kräften erheblich beschleunigt. Besonders günstige Ergebnisse werden erzielt, wenn die mechanische Beanspruchung durch Scherkräfte hervorgerufen wird, die beim Überströmen der Zellkulturen mit Kulturmedium erzeugt werden.

Die Einwirkung mechanischer Kräfte auf die Zellkultur erhöht nicht nur die Proliferationsaktivität der Zellen sondern steigert auch die mechanische Festigkeit der Zellschichten und stimuliert deren Differenzierung. Dadurch wird die Ausbildung mehrschichtiger Epithelien ermöglicht. Fehlt es an dem mechanischen Reiz, entwickeln sich vorwiegend ein- oder zweischichtige Epithelien und die Zeitdauer zwischen dem Aussäen der Zellen und deren Heranwachsen zu einem trans­ plantationsfähigen Zellrasen ist deutlich länger. Obwohl bei der dermatologischen Wundbehandlung stets mit autologen, epithelialen Zellverbänden gearbeitet wird, kann die durch eine mechanische Beanspruchung erzielbare Förderung der Proliferationsgeschwindigkeit und der Gewebedifferenzierung auch an der in Forschungslaboratorien häufig eingesetzten humanen Epidermiszellinie (HaCaT) gezeigt werden. Setzt man eine Kultur derartiger menschlicher Epidermiszellen durch Überströmen mit einem Kulturmedium einem Scherstreß von etwa 0,5 bis 3 dyn.cm^-2 aus, dann beschleunigt sich innerhalb der ersten Tage der Behandlung die Proliferationsgeschwindigkeit etwa um das Vierfache gegenüber Kulturen auf demselben Substrat oder in demselben Medium, die in einer Plastikschale keiner mechanischen Beanspruchung ausgesetzt sind.

Die einzige beigefügte Zeichnung (Fig. 1) zeigt, wie sich unter diesen Bedingungen die das Keratinozytenwachstum kennzeichnende Zellzahl ohne mechanische Reizung und mit mechanischer Reizung über einen Zeitraum von drei Wochen erhöht. Die dabei zwischen dem neunten und zwölften Tag eintretende Zellzahlverringerung ist dadurch zu erklären, daß in dieser Phase ein Zelldifferenzierungsschub stattfindet, durch den die Anzahl der Zellen reduziert wird.

Gleichzeitig mit dem Wachstum des Zellverbandes wird auch die Menge der Adhäsionsmoleküle signifikant erhöht. Die Erhöhung der Proliferationsgeschwindigkeit und die Vermehrung der Adhäsionsmoleküle verlaufen also parallel. Beide Effekte werden durch die Einwirkung der Scherkräfte hervorgerufen. Neben den Scherkräften ist hierfür aber auch die Vermeidung von Diffusionsschichten und damit eine verbesserte Nährstoff­ versorgung als Folge der ständigen Bewegung verantwortlich zu machen. Ähnliche Ergebnisse werden durch das zyklische Strecken der Kulturen erreicht.

In der dermatologischen Praxis werden zur Gewinnung von transplantationsfähigen Zellverbänden zunächst kleine Hautareale einem Patienten entnommen und hieraus nach an sich bekannten Verfahren eine Suspension von Keratinozyten, Melanozyten und/oder Fibroblasten gewonnen. Diese werden entweder in Plastikzellkulturschalen oder auf einer verform­ baren Matrix ausgesät, mit einem handelsüblichen, für Epidermiszellen geeigneten Kulturmedium überschichtet und so zur Vermehrung gebracht. Die Kulturen werden dann über einen Zeitraum von 4 bis 6 Tagen zyklischen Bewegungen des Kulturme­ diums ausgesetzt, dann erneut suspendiert und auf eine biologisch abbaubare Matrix übertragen, in der Fibroblasten enthalten sind. Die Matrix wird dann erneut einer mechanischen Reizung ausgesetzt, die das Wachstum der Zellen weiter anregt und zu einer Konfluenz der Zellen, d. h. zu einer vollständigen Bedeckung der Matrixoberfläche mit Keratinozyten führt. Der dann entstandene Zellverband ist zur Transplantation auf den Empfänger geeignet.

Für die Gewinnung eines zur Transplantation geeigneten Zellverbandes reicht eine bloße Stimulierung der Zell­ proliferation nicht aus. Es muß auch dafür gesorgt werden, daß sich die gebildeten Zellen hinreichend differenzieren. Überraschenderweise konnte nun gezeigt werden, daß die Art der mechanischen Beanspruchung Einfluß darauf hat, ob die Zellproliferation oder die Differenzierung der Zellen überwiegt. Es konnte beobachtet werden, daß unter dem Einfluß von mechanischem Druck die Zelldifferenzierung gegenüber der Zellproliferation begünstigt ist.

Ein besonders vorteilhaftes Verfahren zur Gewinnung von transplantationsfähigen epithelialen Zellverbänden geht von einem biologisch abbaufähigen Material aus, auf dem die Keratinozyten und/oder Melanozyten wachsen. In dieses Material sind dermale Fibroblasten eingebracht, die ihrerseits das Wachstum und die Differenzierung der Epidermis fördern und bereits vor der Transplantation beginnen, die künstliche Matrix durch natürliches extrazelluläres Material zu ersetzen. Eine derartige Kokultur führt bereits ohne mechanische Reizung zu einer deutlichen Stimulierung des Wachstums und zur Vielschichtigkeit der Epidermiszellen. Wird eine derartige Kokultur jedoch einer mechanischen Beanspruchung ausgesetzt, so führt das zu einer Aktivierung der Fibroblasten und damit zu einer erheblichen Beschleunigung des Wachstums des Zellverbandes.

Als biologisch abbaubare Materialien können unterschiedliche Substrate eingesetzt werden, u. a. auch Schichten oder Netzwerke aus künstlich hergestellten und vernetzten Polymeren wie Hyaluronsäure, Poly-Milchsäure oder Polyurethan.

Die Gewinnung des epithelialen Zellverbandes kann in folgender Weise erfolgen:

Beispiele

Es werden zunächst kleine Hautproben aus unverletzten Hautbereichen des Patienten entnommen. Sodann werden nach üblichen Methoden die Keratinozyten und die Fibroblasten des Gewebes voneinander getrennt, die Keratinozyten in eine 6-Well Multischale übertragen und ihnen etwa sechs Stunden Zeit zur Anheftung gegeben. Die Kulturen werden dann vier bis sechs Tage auf einer Wippe behandelt.

Gleichzeitig werden die aus den entnommenen Hautproben gewonnenen Fibrobasten in einer 6-Well Multischale ausgesät und in gleicher Weise behandelt wie die Keratinozyten. Anschließend werden die Fibroblasten aus der Schale durch Trypsinisieren oder durch Einwirkung einer Ethylen-diamin­ tetraessigsäure-Lösung (zur Bindung der Calciumionen) herausgelöst und in eine biologisch abbaubare Matrix, z. B. ein Kollagengel oder eine andere Matrixstruktur, eingebracht. Das Gel wird zusammen mit den Fibroblasten in eine Silikon­ gummikammer etwa 1 bis 2 mm hoch gegossen. Nach Verfestigung des Gels wird die Silikongummikammer zyklischen Streckungen ausgesetzt. Die Streckungen betragen 5 bis 10% der ursprüng­ lichen Länge der Silikonkammer. Die Dauer jedes Dehnzyklus beträgt 2 bis 10 Sekunden.

Anschließend wird die 4 bis 6 Tage auf einer Wippe behandelte Kultur von Keratinozyten auf das Gel aufgebracht. Die Keratinozyten bilden dann eine homogene Zellage und dringen nicht in das Gel ein. Nach weiteren 5 bis 10 Tagen ist das Gesamtsystem bestehend aus Matrix mit Fibroblasten und dem darauf entstandenen, teilweise mehrschichtigen Keratinozyten­ belag transplantierfähig.

Claims (6)

1. Verfahren zur Gewinnung eines epithelialen Zellverbandes, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zellkultur von humanem Hautgewebe nach mehrtägiger Behandlung in einem Kulturmedium auf eine biologisch abbaubare Matrix, in der Fibroblasten enthalten sind, übertragen und einer mechanischen Beanspru­ chung ausgesetzt wird, bis die Matrixoberfläche mit einem zusammenhängenden, epithelialen Zellverband bedeckt ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mechanische Beanspruchung durch Druck, Streckung, Stauchung oder das Einwirken von Scherkräften erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die mechanische Beanspruchung durch Überströmen der Zellkultur mit dem Kulturmedium erfolgt.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als biologisch abbaubare Matrix Schichten oder Netzwerke künstlich hergestellter und vernetzter Polymerer von Hyaluronsäure, Polymilchsäure oder Polyurethan eingesetzt werden.

5. Kokultur, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Fibroblasten enthaltenden, biologisch abbaubaren Matrix besteht, auf deren Oberfläche Keratinozyten und/oder Melanozy­ ten kultiviert werden.

6. Epithelialer Zellverband, dadurch gekennzeichnet, daß er nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 4 erhältlich ist.