DE19711281C1 - Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmunotests - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchfüh­ rung von insbesondere quantitativen Fluoreszenztests mittels Evanescentfeldanregung. Dabei können ver­ schiedenste bekannte biochemische Assays von allge­ meinen Rezeptor-Ligand Systemen, wie z. B. Antikörper- Antigen, Lectin-Kohlenhydrat, DNA oder RNA-komplemen­ täre Nukleinsäure, DNA oder RNA-Protein, Hormonrezep­ tor, Enzym-Enzymcofaktoren, Protein G oder Protein A- Immunglobin oder Avidin-Biotin zugrunde gelegt wer­ den. Bevorzugt werden jedoch Antikörper-Antigen Sy­ steme bewertet. Insbesondere können hochmolekulare und niedermolekulare Verbindungen (z. B. Haptene) nach der Erfindung detektiert werden.

Fluoreszenzimmunotests oder auch Fluoreszenzimmuno­ sensoren werden üblicherweise bereits seit längerer Zeit eingesetzt und sie dienen dazu, hauptsächlich in einer flüssigen Probenmatrix eine unbekannte Menge einer bestimmten chemischen oder biochemischen Sub­ stanz zu quantifizieren. Dabei werden Antikörper se­ lektiv an die zu bestimmende Substanz gebunden. Die zu bestimmende Substanz wird vom Fachmann auch als Antigen bezeichnet. Bei den Fluoreszenzimmunotests werden die analytspezifischen Antikörper mit einem Markierungsstoff markiert, der bei einer bestimmten stoffspezifischen Wellenlänge λ_ex optisch angeregt wird und das Fluoreszenzlicht mit einer anderen Wel­ lenlänge, die in der Regel größer ist, mit einem ge­ eigneten Detektor unter Auswertung der Fluoreszenz­ lichtintensität genutzt. Die Ausnutzung der Evanes­ centfeldanregung bei der Durchführung solcher Fluo­ reszenzimmunotests respektive den Fluoreszenzimmuno­ sensoren gehört bereits zum Stand der Technik. So sind verschiedene Lösungen bereits in WO 94/27137, von R.A. Badlay, R.A.L. Drake, I.A. Shanks, F.R.S., A.M. Smith und P.R. Stephenson in "Optical biosensors for immunoassays fluorescence capillary-fill devi­ ce", Phil. Trans. R. soc. Lund. B 316, 143 bis 160 (1987) und D. Christensen, S. Dyer, D. Fowers and J. Herron, "Analysis of Exitation and Collection Geome­ tries for Planar Waveguide Immunosensors", Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. Vol. 1886, Fiber Optic Sen­ sors in Medical Diagnostics, S. 2 bis 8 (1993) be­ schrieben.

Die bekannten Lösungen haben jedoch generell den Nachteil, daß sie nur für bestimmte Assayformate ge­ eignet und ein aufwendiger Aufbau mit entsprechender Verfahrensführung erforderlich ist.

In WO/05295 ist ein optisches Biosensorsystem be­ schrieben, bei dem eine aufwendige Optik Anregungs­ licht auf sensitive Bereiche eines ebenfalls aufwen­ digen Kanalsystems, durch das Probenvolumen mittels gesteuerten Ventilen und Pumpen geführt wird, gerich­ tet werden kann und das durch Fenster aus den sensi­ tiven Bereichen austretende Fluoreszenzlicht wieder auf einen Detektor zur Intensitätsmessung gerichtet werden kann. Neben dem bereits erwähnten nachteiligen komplizierten und aufwendigen Aufbau erfordert dieses System vor bzw. nach Durchführung eines Testes eine Reinigung sowohl der Pumpen, wie auch des gesamten Kanalsystems, um nachfolgende Meßfehler ausschließen zu können.

Des weiteren ist aus DE 41 21 493 A1 eine Analysevor­ richtung zur quantitativen, immunologischen Bestimmung von Schadstoffen bekannt. Der nachzuweisende Schad­ stoff wird mit einem Antikörper zu einer immunologi­ schen Reaktion gebracht und zusätzlich markierte Ana­ lyten, sogenannte Tracer verwendet. Die Antikörper und die Tracer werden in einem permeablen, undurch­ sichtigen Bereich einer Vorrichtung dem Analyten aus­ gesetzt und nach erfolgter immunologischer Reaktion, diffundieren die freien, nicht an einen Antikörper gebundenen Tracer in einen transparenten Teilbereich, so daß das Fortschreiten der Tracerdiffusion von au­ ßen durch Verfärbung sichtbar wird. Hierfür wird ein Träger verwendet, der mehrschichtig aber auch als einzelne Membran ausgebildet sein kann. Eine solche Membran kann in unterschiedliche Membranschichtberei­ che aufgeteilt sein. Eine Schicht oder ein Bereich der Membran dient als Nachweisschicht. Durch die Vor­ richtung kann eine Probe bzw. Pufferlösung unter Ver­ wendung einer Pumpe geführt werden.

In DE 38 14 370 A1 ist ein einfacher Testträger für Analysen und Verfahren zur Durchführung solcher Ana­ lysen beschrieben. Es sollen immunologische Bestim­ mungsverfahren durchführbar sein. Hierfür werden ver­ schiedene Schichten verwendet. In einer Konjugat­ schicht soll ein erster Bindungspartner enthalten sein. Diese Schicht soll mit einer porösen Fixierungsschicht, die einen für den ersten Bindungs­ partner spezifischen zweiten Bindungspartner enthält, in Kontakt stehen. Eine Flüssigkeit kann mit relativ hoher Geschwindigkeit durch die Fixierungsschicht transportiert werden und die Ausbreitungsgeschwindig­ keit der Flüssigkeit so groß sein, daß die spezifi­ sche Bindungsreaktion bei ausreichender Inkubations­ zeit abläuft.

Eine optische Nachweisschicht wird durch entsprechen­ de Bewegung mit der Fixierungsschicht nachfolgend in Kontakt gebracht und ein Flüssigkeitsaustausch zwi­ schen diesen Schichten wird möglich.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine Möglichkeit zu schaffen, mit einer sehr einfach aufgebauten Vor­ richtung quantitative Fluoreszenzimmunotests mit ver­ schiedenen biochemischen Assays durchführen zu kön­ nen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die im Anspruch 1 enthaltenen Merkmale für die Vorrichtung und die Merkmale im Anspruch 11 für das Verfahren gelöst. Vorteilhafte Ausgestal­ tungsformen und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich mit der Verwendung der in den untergeordneten Ansprüchen enthaltenen Merkmale.

Bei einer in der nicht vorveröffentlichten DE 196 11 025 beschriebenen Vorrichtung wird Licht mindestens einer Lichtquelle unter einem Winkel α auf die Grenz­ fläche zweier Medien mit unterschiedlichem Brechungs­ index gerichtet. Dabei wird eine Lichtquelle ausge­ wählt, die nahezu monochromatisches Licht mit einer Wellenlänge aussendet, die geeignet ist, den Markie­ rungsstoff, in diesem Fall das Fluorophor, anzuregen. Als Lichtquelle eignen sich dabei insbesondere Laser­ dioden, da diese ein geeignetes Strahlprofil und eine ausreichende Lichtleistung, bei kleiner Baugröße und geringem Energieverbrauch aufweisen.

Es können aber auch andere monochromatisches Licht aussendende Lichtquellen Verwendung finden.

Der Winkel α mit dem das ausgesendete Licht auf die Grenzfläche gesendet wird, bestimmt neben dem Brechungsindex, des im Strahlengang vor der Grenzflä­ che angeordneten Materials und dem sich daran an­ schließenden Material gemeinsam mit der Wellenlänge des Lichtes, die Eindringtiefe d für das evanescente Feld. Dabei muß der Brechungsindex n₁ des Materials, das im Strahlengang vor der Grenzfläche angeordnet ist, Totalreflexion an der Grenzfläche ermöglichen und sollte daher größer als der Brechungsindex n₂ des anderen, danach angeordneten Materials sein. Der Win­ kel α wird bevorzugt so gewählt, daß gilt: sin(α) < n₂/n₁. Wird diese Voraussetzung erfüllt, wird alles Licht an der Grenzfläche reflektiert und somit Total­ reflexion erreicht. Bei Erfüllung dieser Bedingung dringt jedoch ein relativ kleiner Teil des Lichts durch die Grenzfläche in das Material, das im Strah­ lengang nach der Grenzfläche angeordnet ist, ein und das evanescente Feld entsteht. Durch das evanescente Feld werden nur solche Markierungsstoffe optisch an­ geregt, die sich in unmittelbarer Nähe der Grenzflä­ che befinden. Für die Durchführung der Fluoreszenzim­ munotests ergibt sich daraus, daß ausschließlich die Markierungsstoffe der Antikörper oder Antigene ange­ regt werden, die auf der Oberfläche der Grenzfläche gebunden sind. Die Fluoreszenzintensität des von die­ sen Fluorophoren emittierten Lichtes ist damit direkt proportional zur Konzentration der an der Oberfläche gebundenen markierten Antikörper oder Antigene und je nach dem benutzten biochemischen Assay proportional oder umgekehrt proportional zur Antigenkonzentration.

Die in DE 196 11 025 beschriebene Vorrichtung verwen­ det nunmehr mindestens eine Lichtquelle, die nahezu monochromatisches Licht aussendet und dieses in ei­ nem, die Eindringtiefe d für das evanescente Feld vorgebenden Winkel α auf eine für dieses Licht trans­ parente Bodenplatte richtet. Der Brechungsindex n₁ der Bodenplatte sollte größer als 1,33 sein. Auf der anderen Seite der Bodenplatte wird zwischen einer Deckplatte ein küvettenförmig ausgebildeter Aufnahme­ bereich ausgebildet. Zwischen Bodenplatte und dem küvettenförmig ausgebildeten Aufnahmebereich ist be­ sagte Grenzfläche ausgebildet und das evanescente Feld kann sich mit der vorgegebenen Eindringtiefe d innerhalb des küvettenförmigen Aufnahmebereiches auf an die Oberfläche gebundenen markierten chemischen oder biochemischen Partner eines allgemeinen Rezep­ tor-Ligand Systems auswirken und die als Markierungs­ stoff verwendeten Fluorophore anregen.

Die so hervorgerufene Fluoreszenz wird mit der ent­ sprechenden Intensität mit einem Detektor gemessen. Der Detektor ist dabei an der gleichen Seite der Bo­ denplatte, wie die Lichtquelle angeordnet.

Als Detektor kann dabei ein einzelner lichtempfindli­ cher Detektor, eine lineare oder eine flächenhafte Anordnung von mehreren lichtempfindlichen Detektoren verwendet werden.

Dort wird ebenfalls beschrieben, daß es vorteilhaft ist, polarisiertes Licht auf die zu bestimmende Probe zu richten. Hierfür kann in den Strahlengang des Lichtes im Anschluß an die Lichtquelle ein Polarisa­ tor angeordnet werden.

Der Abstandshalter und ggf. zu verwendende Trenn­ schichten weisen eine Dicke von 0,001 bis 10 mm, be­ sonders bevorzugt 50 µm auf und eine Aussparung im Abstandshalter bildet den Aufnahmebereich für die Probe aus. Abstandshalter und Trennschichten können bevorzugt ein biokompatibler Klebefilm sein, der beidseitig haftend ausgebildet ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht im wesentlichen darauf, daß ein definiertes Probenvolumen durch den küvettenförmigen Aufnahmebereich geführt und dort einer Evanescentfeldanregung unterzogen wird, wie dies bereits beschrieben wurde. Das Probenvolumen kann dabei durch Saug-, Druckwirkung oder Kappilarkräfte durch den küvettenförmigen Aufnahmebereich und die funktionelle(n) Schicht(en) geführt werden.

In einer vorteilhaften Ausführung ist in einer Deck­ platte zumindest eine Zuflußöffnung vorgesehen, in die ein Probencontainer einsetzbar oder angeordnet sein kann, dabei ist die Öffnung in der Deckplatte so angeordnet, daß eine Verbindung zwischen Zuflußöff­ nung bzw. Probencontainer und Aufnahmebereich her­ stellbar ist. Zusätzlich ist eine zweite Öffnung vor­ handen, die ebenfalls mit dem küvettenförmigen Auf­ nahmebereich verbunden ist und einen Abfluß dar­ stellt.

Die zweite Öffnung kann ebenfalls in der Deckplatte vorgesehen sein. An diese zweite Öffnung kann eine externe Pumpe angeschlossen oder eine eigene Pumpe eingesetzt werden.

Die Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß ein re­ lativ einfach aufgebautes Grundmuster einer erfin­ dungsgemäßen Vorrichtung in verschiedenster Form va­ riiert bzw. verwendet werden kann. So können die we­ sentlichen Elemente Boden-, Deckplatte und Abstands­ halter mit küvettenförmigen Aufnahmebereich durch funktionelle Schichten, die gegebenenfalls durch zwi­ schen liegend angeordnete Trennschichten, jedoch ei­ nen Probendurchfluß erlaubend, in verschiedenster Form kombiniert werden.

Mit der Erfindung können die verschiedenen Assay-For­ mate durchgeführt und dabei hoch- und niedermolekula­ re Verbindungen gleichermaßen detektiert werden. Es können alle bekannten Assay-Formate, wie Sandwich- Titrations-/Kompetitions- und Verdrängungsformat durchgeführt werden.

Für den Fall, daß Trennschichten zwischen funktionel­ len Schichten bzw. diese einschließende Trennschich­ ten verwendet werden, müssen diese entsprechend korrespon­ dierende Durchbrechungen aufweisen, so daß gesichert ist, daß das Probenvolumen die gesamte Vorrichtung durchströmen kann. Als Trennschichten können bei­ spielsweise Klebefolien verwendet werden, in die Durchbrechungen durch Ausstanzen hergestellt werden.

Nachfolgend soll die Erfindung beispielhaft näher beschrieben werden.

Dabei zeigt:

Fig. 1 einen Teil der erfindungsgemäßen Vorrich­ tung zur Aufnahme einer Probe;

Fig. 2 eine schematische Darstellung einer Ausfüh­ rungsform einer erfindungsgemäß ausgebilde­ ten Vorrichtung mit zwei Lichtquellen;

Fig. 3 eine Vorrichtung mit Probencontainer;

Fig. 4 eine Vorrichtung mit zylinderförmigen Hohl­ körper;

Fig. 5 eine Vorrichtung mit zusätzlichen funktio­ nellen Schichten mit lateralem Durchfluß;

Fig. 6 eine Vorrichtung mit mehreren funktionellen Schichten und transversalem Durchfluß;

Fig. 7+8 zeitabhängige Fluoreszenzintensitätsverläu­ fe;

Fig. 9 ein Sandwich-Assayformat;

Fig. 10 ein weiteres Sandwich-Assayformat;

Fig. 11 ein Titrations- bzw. Kompetitions-Assayfor­ mat;

Fig. 12 + 13 ein Kompetitions- bzw. Verdrängungs- Assayformat mit direkt proportionalem Ver­ hältnis von Analytkonzentration und Signal­ intensität;

Fig. 14 ein Assayformat unter Nutzung einer zusätz­ lichen festen Phase;

Fig. 15 einen Verdrängungsassay mit zusätzlicher fester Phase;

Fig. 16 einen weiteren Verdrängungsassay und

Fig. 17 eine allgemeine Legende für die in der Fig. 9 bis 16 gezeigten Assayformate.

In der Fig. 1 ist der prinzipielle Aufbau eines Tei­ les der erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt. Die dort abgebildeten drei Teile, die Bodenplatte 1, der Abstandshalter 4 und die Deckplatte 3, können vor der Durchführung des Fluoreszenzimmunotestes mitein­ ander verbunden werden oder bilden bereits eine fer­ tig komplettierte Einheit und gleichen in ihrem Auf­ bau einer Durchflußzelle und einer Meßküvette.

Dabei besteht die Bodenplatte 1 aus einem hoch­ brechenden transparenten Material, wie beispielsweise Glas oder einem Kunststoff, wie einem Polymer (PMMA oder PC) mit einem Brechungsindex n₁ < 1,33. Die Dicke der Bodenplatte kann in einem Bereich von 0,01 bis 10 mm, bevorzugt zwischen 0,5 und 1 mm liegen.

Der Abstandshalter 4 ist bevorzugt eine dünne Folie, die beidseitig mit einem Klebefilm versehen ist, oder ein dünner Klebefilm ist einmal auf die Bodenplatte 1 und zum anderen auf die Deckplatte 3 aufbringbar. Die gesamte Dicke des Abstandshalters inklusive des ver­ wendeten Klebemittels sollte in einem Bereich zwischen 0,001 bis 10 mm, bevorzugt zwischen 0,01 und 0,2 mm und ganz besonders bevorzugt bei einer Dicke von 50 µm liegen. In den Abstandshalter 4 ist eine Durchbrechung herausgearbeitet, die einen küvetten­ förmigen Aufnahmebereich 2 ausbildet.

In der Fig. 1 ist außerdem die Deckplatte 3 in der durchgehende Öffnungen 9 und 11, bei diesem Beispiel als Bohrungen ausgebildet, erkennbar. Auf deren Funk­ tion wird später noch zurückzukommen sein. Die Öff­ nungen 9 und 11 sind dabei so angeordnet, daß sie zumindest teilweise den Bereich des Aufnahmebereiches 2 des Abstandshalters 4 übergreifen. Der Abstandshal­ ter 4 kann vorzugsweise auch aus einem biokompatiblen Klebefilm, der bevorzugt beidseitig mit einer abzieh­ baren Schutzschicht versehen ist und bereits kommer­ ziell erhaltbar ist, bestehen.

Das in der Fig. 2 dargestellte Beispiel einer erfin­ dungsgemäß ausgebildeten Vorrichtung benutzt zwei Lichtquellen 7, 7', Filter 19, 19' und Polarisatoren 18, 18'. Die Lichtquelle 7' sendet Licht einer Wel­ lenlänge, die sich von der ersten Lichtquelle 7 un­ terscheidet. Bei diesem Beispiel wird vorzugsweise polarisiertes Licht verwendet. Die in der Fig. 2 gezeigte Vorrichtung kann vorteilhaft eingesetzt wer­ den, wenn unterschiedliche Markierungsstoffe, die bei verschiedenen Wellenlängen angeregt werden können, verwendet werden. Beispiele hierfür sind die Fluoro­ phore Cy5 und Cy7. Dabei wird zur Anregung des Fluo­ rophor Cy5 eine Laserdiode mit einem Licht einer Wel­ lenlänge zwischen 635 und 655 nm und für die Fluoro­ phore Cy7 eine Laserdiode, die Licht mit einer Wel­ lenlänge zwischen 730 bis 780 nm sendet, verwendet.

Die Messung erfolgt bei dieser Ausführungsform in der Weise, daß die Dioden 7, 7' entweder alternierend geschaltet oder beispielsweise entsprechend synchro­ nisierte Chopper eingesetzt werden, so daß gesichert ist, daß jeweils nur Licht einer Lichtquelle 7 oder 7' zur Anregung auf die Probe gelangen kann und da­ durch keine Verfälschungen auftreten.

Da aber hierbei zwei verschiedene Fluoreszenzsignale das gleiche Filter passieren müssen, kann ein breit­ bandiges Filter 8 nicht mehr verwendet werden. Es sollten daher zwei Filter 8, 8' nacheinander angeord­ net werden, die selektiv die Wellenlängen der anre­ genden Lichtquellen 7, 7' sperren. Hierfür können z. B. Notch-Filter verwendet werden.

Mit dieser Anordnung kann einmal ein Referenzsignal erhalten werden, das eine interne Kalibrierung des Meßsignals ermöglicht. Zur Referenzmessung wird ein Referenzantikörper, der nicht gegen ein Antigen aus der Probe gerichtet ist, verwendet. Der Referenzanti­ körper ist vorab quantifiziert und mit einem unter­ schiedlichen Markierungsstoff vom zu bestimmenden analytspezifischen Antikörper Ak unterscheidbar ge­ macht. Die Menge der an die Oberfläche tatsächlich gebundenen Referenzantikörper kann mit einer zweiten Lichtquelle 7', die Licht einer Fluoreszenz des un­ terschiedlichen Markierungsstoffes hervorruft, einem zweiten Streulichtfilter 8' und dem Detektor 5 be­ stimmt werden. Mit dieser Bestimmung können die Ver­ luste der nicht an die Oberfläche gebundenen markier­ ten analytspezifischen Antikörper Ak bzw. Antigene Ag berücksichtigt werden.

Neben der Gewinnung eines Referenzsignales können aber auch zwei unabhängig voneinander laufende Immu­ notests durchgeführt werden, wobei die Unterscheidung an Hand der unterschiedlichen Fluorophore erfolgt.

In der Fig. 3 ist dargestellt, wie ein Probencontai­ ner 10 zur Öffnung 9 in der Deckplatte 3 angeordnet ist und so eine Verbindung zwischen Probencontainer 10 über Öffnung 9 zum Aufnahmebereich 2 herstellbar ist. Dabei bildet der Probencontainer 10 den Behäl­ ter, in dem die bekannte Menge mit dem Markierungs­ stoff Fluorophor markierte Biokomponente in der zu bestimmenden Probe vermischt werden. Dabei kann der Probencontainer 10 das Probenvolumen eindeutig defi­ nieren, so daß mit einem festen und bekannten Proben­ volumen eine quantitative Aussage über die Antigen­ konzentration erhalten werden kann. Der Probencontai­ ner 10 muß daher immer mit der gleichen Menge befüllt werden, um reproduzierbare Ergebnisse erhalten zu können. Günstig sollte er dabei immer maximal befüllt werden. Bei allen durchführbaren Assayformaten befin­ det sich die spezifische Biokomponente jeweils auf der Oberfläche des Probencontainers 10, und durch den Kontakt mit der flüssigen Probe löst sich diese von der Oberfläche und gelangt in die Probe. Weiterhin können sich die Biokomponenten auf zusätzlichen fe­ sten Phasen im Probencontainer 10 befinden. Eine ein­ fache und bereits bekannte Methode besteht darin, ly­ ophilisierte Antikörper auf die Oberfläche des Pro­ bencontainers 10 aufzubringen. Dadurch wird es mög­ lich, das Ganze relativ lange vor der eigentlichen Durchführung des Immunotests zu lagern. Der Aufnahme­ bereich 2 definiert die Oberfläche auf der Bodenplat­ te 1, auf der je nach Assayformat die jeweils ent­ sprechenden chemischen oder biochemischen Substanzen immobilisiert werden.

In der Fig. 4 ist ebenfalls ein bevorzugt zylinder­ förmiger Hohlkörper 12, in dem ein Kolben 13 oder eine andere geeignete Abdeckung aufgenommen ist, dar­ gestellt, die beide zusammen als Pumpe dienen. Wird der Kolben 13 aus dem zylinderförmigen Hohlkörper 12 herausbewegt, entsteht ein Unterdruck, der Probenma­ terial aus dem Probencontainer 10 durch den Aufnahme­ bereich 2 in Richtung auf den zylinderförmigen Hohl­ körper 12 saugt. Durch Kapillarkräfte im Aufnahmebe­ reich 2 und durch ein saugfähiges Vlies wird der Fluß aufrechterhalten, bis das gesamte Probenvolumen durch den Aufnahmebereich 2 gefördert worden ist. Der zy­ linderförmige Hohlkörper 12 ist aufgesetzt oder hat ein Loch im Boden, so daß eine Verbindung zum Aufnah­ mebereich 2 vorhanden ist. Dies kann durch die zweite Öffnung 11 als Anschlußmöglichkeit in der Deckplatte 3 realisiert werden. Wird keine Deckplatte 3 verwen­ det, kann die Anschlußmöglichkeit auch anders ausge­ bildet sein.

Es kann aber auch an die Öffnung 11 eine externe an­ dere Pumpe angeschlossen werden.

Nach Aufbringen der Probe (mit dem Probencontainer 10) muß eine entsprechende Zeit gewartet werden, so daß die gewünschte Bindung zwischen den Partnern ei­ nes allgemeinen Rezeptor-Ligand Systems vollständig erfolgen kann. Im Anschluß daran wird die Pumpe 12, 13 aktiviert und es wird gewartet, bis die gesamte Flüssigkeit durch den Aufnahmebereich 2 gepumpt wor­ den ist. Nach Anregung mit der Lichtquelle 7 bzw. den Lichtquellen 7 und 7' kann dann die Antigenkonzentra­ tion bestimmt werden, wobei der erfindungsgemäße Auf­ bau, wie er in der Fig. 2 dargestellt worden ist, angewendet werden soll.

Der Aufbau, wie er bisher dargestellt und beschrieben worden ist, kann für die verschiedensten biochemische Assay's genutzt werden, wobei auf weitere Beispiele noch zurück zukommen sein wird.

Wie dies insbesondere den Fig. 1, 5 und 6 zu ent­ nehmen ist, kann der wesentliche Teil der erfindungs­ gemäßen Vorrichtung sehr variabel ausgestaltet wer­ den. So können die verschiedenen Elemente (Platten, Schichten) aus einem Bausatz in den verschiedensten Konfigurationen zusammengesetzt und dementsprechend für verschiedene Assayformate nach Bedarf vor Ort zur Verfügung gestellt werden.

So zeigt Fig. 5 ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei dem zusätzliche funktionelle Schich­ ten mit Lateraldurchfluß dargestellt ist. Dabei sind zusätzlich funktionelle Schichten 26 und 27 und tren­ nende Schichten 25, 25' in den, bereits bei der Be­ schreibung der Fig. 1 erklärten Aufbau einbezogen. Bei diesem Beispiel wurden zwei funktionelle Schich­ ten 26 und 27 übereinander angeordnet, wobei sie all­ seitig von Trennschichten 25 und 25' umschlossen sind. Die Trennschichten 25 und 25' können dabei be­ vorzugt, wie bereits am anderen Ort beschrieben, als Klebefolien ausgebildet sein, in die Durchbrechungen ausgebildet sind. Diese Durchbrechungen dienen dazu, daß eine Verbindung zwischen Zuflußöffnung 9, den funktionellen Schichten 26, 27, dem Aufnahmebereich 2 und der Abflußöffnung 11 möglich wird. Die Durchfluß­ richtung geben dabei die in der Fig. 5 eingezeichne­ ten Pfeile wieder.

Eine Anpassung an verschiedene Assayformate kann durch Variation der Anordnung und/oder Auswahl der funktionellen Schichten 26, 27 erreicht werden. So können die funktionellen Schichten 26 und 27 bei­ spielsweise Reagenzienreservoir bzw. eine reine Reak­ tionsschicht sein.

Es besteht aber auch die nicht dargestellte Möglich­ keit, mindestens zwei unterschiedliche funktionelle Schichten in einer Ebene anzuordnen, so daß sie nach­ einander durchflossen werden.

Der in der Fig. 6 gezeigte Aufbau eines Teiles einer erfindungsgemäßen Vorrichtung unterscheidet sich von dem in der Fig. 5 gezeigten Beispiel dadurch, daß ein transversaler Durchfluß erreicht werden kann. Bei diesem Beispiel sind drei funktionelle Schichten 28, 28' und 29 unmittelbar übereinander, d. h. ohne Trenn­ schichten, direkt auf der Bodenplatte 1 angeordnet. Innerhalb des so ausgebildeten Schichtstapels aus funktionellen Schichten 28, 28' und 29 ist bei diesem Beispiel der Abstandshalter 4 mit dem küvettenförmi­ gen Aufnahmebereich 2 unterhalb der Deckplatte 3 an­ geordnet. Auch hier geben die in der Fig. 6 einge­ zeichneten Pfeile die Durchflußrichtung an.

Abweichend von dem in der Fig. 6 dargestellten Auf­ bau, können selbstverständlich auch andere Anordnun­ gen, die einen transversalen Durchfluß sichern, auf­ gebaut werden. Dabei können die funktionellen Schich­ ten, wie bereits erwähnt, in ihrer Anzahl, Anordnung und Funktionsauswahl variiert werden. Die Anordnung kann entgegengesetzt zum gezeigten Beispiel auch oberhalb des Abstandshalters 4 ausgeführt werden.

Auch bei diesem Beispiel können Trennschichten einge­ setzt werden, wobei jedoch zu beachten ist, daß ein transversaler Durchfluß nicht behindert werden darf. Die funktionellen Schichten können wiederum als Rea­ genzienreservoir bzw. Reaktionsschicht dienen.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden funktionellen Schichten haben dabei den Vorteil, daß ein komplettes integriertes Meßsystem entsteht und lediglich die Probe durch den Aufbau geleitet werden muß.

Auch Kombinationen von transversalem und lateralem Durchfluß (Kombination der Beispiele Fig. 5 und 6) sind möglich.

Die funktionellen Schichten 26, 27, 28, 28' und 29 können die Aufgaben der Probenvorbereitung (Puffern, Filtration, Eliminierung von Interferenzen u. a.), als Reagenzträgerschicht (z. B. zur Konjugatfreisetzung) oder als Reaktionsschicht (z. B. zur Immobilisierung von Biokomponenten oder für den Ablauf von immunche­ mischen Reaktionen) verwendet werden.

Geeignete Materialien für die verschiedenen funktio­ nellen Schichten sind:
für die Probenvorbereitung - z. B. Membrane aus fibrö­ sem Material zur Separation von Plasma und roten Blutkörperchen, die beispielsweise von der Firma Pall Biosupport als "Hemadyne-Membran" erhältlich sind. Es können aber auch Filterpapiere aus Cellulose bzw. regenerierter Cellulose für diese Funktion eingesetzt werden.

Reagenzträgerschicht - hierfür kann ebenfalls Papier aus 100% Cellulose oder aktiviertes Nylon 66, wobei die Oberflächen aktiviert oder modifiziert sein kön­ nen, um die Fließeigenschaften zu verändern (kommer­ ziell von der Firma Pall Biosupport unter der Handelsbezeichnung "Prodyne oder ACCUWIK-Membrane" erhältlich) oder speziell für laterale Durchflußsy­ steme Polyesterträger mit modifizierter Oberfläche, bei denen die Fließeigenschaften steuerbar sind, ver­ wendet werden.

Reaktionsschichten - als sogenannte Nitroflowmembrane aus Nitrocellulose, PVDF (Polyvinyldifluorid)-Membran (kommerziell erhältlich bei Firma Millipor mit Han­ delsnamen "Immobilon"), wobei auch hier die Oberflä­ chen modifiziert sein können.

Allgemein können fibröse Materialien, Cellulose, Ni­ trocellulose, Polypropylen, Polycarbonat, Polyvinyl­ difluorid, Hydrogele (z. B. Dextran, Acrylamid, Agar- Agar, Carrageenan, Alginsäure), Polyelektrolyten (z. B. Acrylsäure, Poly-L-Lysin, Poly-L-Glutaminsäure) oder Kernspur- oder Glasfasermembranen verwendet wer­ den.

In den Fig. 7 und 8 sind prinzipielle Möglichkei­ ten für die Auswertung der Meßsignale dargestellt.

In der Fig. 7 ist die Intensität des gemessenen Fluoreszenzsignales zeitabhängig dargestellt. Mit dem linearen Anstieg der Intensität des Fluoreszenzsigna­ les genügt es, den Signalanstieg durch Differenzie­ rung zu bestimmen, da der Anstieg mit der zeitlichen Änderung der Fluophormenge, die mit der erfindungs­ gemäßen Vorrichtung gemessen werden kann, korreliert. Dadurch kann die Meßzeit sehr kurz gehalten werden, da der Anstieg der Fluoreszenzintensität nur über einen kurzen Zeitraum bestimmt werden muß, unabhän­ gig, ob dies zu Beginn oder einem späteren Zeitpunkt, bei der Durchführung des chemischen bzw. biochemi­ schen Assay's erfolgt. Es ist lediglich der Sät­ tigungsbereich zu beachten und zu berücksichtigen, daß nur in einem Zeitbereich gemessen wird, in dem eine zeitliche Änderung des Fluoreszenzintensitäts­ signals erfaßbar ist.

Abweichend hiervon ist in der Fig. 8 eine andere Möglichkeit prinzipiell dargestellt. Hierbei wird die Differenz eines Anfangs- und Endwertes gebildet und zur Auswertung herangezogen. Dabei wird zunächst ein Grundsignal S₁ vor der Zugabe des zu bestimmenden Analyten zur Zeit t₁ aufgenommen und im Anschluß an die Analytzugabe zu einem vorgebbaren Zeitpunkt t₂ ein Endwert S₂ der gemessen Fluoreszenzintensität bestimmt. Die Analytkonzentration kann dann durch die Differenz der Werte S₂ und S₁ bestimmt werden. Die Differenz zwischen den Zeiten t₂ und t₁ muß dabei je­ doch so groß sein, daß sich ein Gleichgewicht ausge­ bildet hat.

In den Fig. 9 bis 16 sind mögliche, mit der Erfin­ dung durchführbare Assayformate dargestellt.

Die Fig. 9 zeigt dabei ein Sandwich-Assayformat, das praktisch nur für hochmolekulare Verbindungen (Pro­ teine, u. a.) geeignet ist.

Dieses Sandwich-Format kann dabei prinzipiell in ei­ ner Vorrichtung, wie sie in der Fig. 5 oder Fig. 6 dargestellt ist, durchgeführt werden, wobei mindes­ tens eine funktionelle Schicht zu verwenden ist.

Dabei soll der Analyt mit dem markierten Antikörper erst inkubiert und anschließend zur Evanescentfeld­ anregung und entsprechender Fluoreszenz in den Detek­ tionsbereich der Bodenplatte 3 geleitet werden.

Eine andere Möglichkeit zur Durchführung eines Sand­ wich-Assayformates in sequentieller Form wird so durchgeführt, daß zuerst der Analyt und dann der mar­ kierte Antikörper schrittweise den Sandwich ausbil­ den.

Weitere Möglichkeiten zur Immobilisierung des Antikör­ pers im Bodenplattenbereich sind:

• 1. Adsorption
• 2. kovalente Bindung
• 3. Affinitätsbindung (z. B. A-Protein A/G oder nach Biotinylierung an Avidin).

Die Beschichtung des Bodenplattenbereiches zur Eva­ nescentfeldanregung mit Protein A/G, Avidin, u. a. bietet außerdem die Möglichkeit, ein universelles Element (für verschiedenste Analyte) herzustellen.

Es kann aber auch ein Assayformat durchgeführt wer­ den, bei dem ein Antikörper und ein markiertes Anti­ körperfragment (z. B. ein Fc-Teil oder ein ScFv-Frag­ ment) simultan mit dem Analyt inkubiert werden, wie dies in Fig. 10 gezeigt ist. Dort bindet nur der komplette Antikörper (an Protein A/G oder nach Bioti­ nylierung auch an Avidin), dadurch entfällt die Er­ fordernis einer Inkubation. Bei diesem Format besteht die prinzipielle Möglichkeit, den verwendeten Aufbau zu regenerieren. Dies ist aber bei Avidin/Biotin nicht möglich.

Bei der simultanen Inkubation von Analyt, Antikörper und markiertem Antikörperfragment bei einem Sandwich- Assay, wie es in Fig. 10 dargestellt ist, kann das markierte Antikörperfragment und der Antikörper bei­ spielsweise in der Funktionsschicht 27 des in Fig. 5 dargestellten Beispieles, enthalten sein.

Anstelle der Immobilisierung eines Fängerantikörpers können auch andere, den Analyt bindende, Biokomponen­ ten immobilisiert werden (z. B. Protein A/G im Fall eines Sandwich-Assay's zur Bestimmung von Antikör­ pern).

Bei allen Sandwich-Assayformaten tritt ein direkt proportional er Zusammenhang zwischen der Konzentra­ tion des Analyten und dem Signal auf.

Eine oder mehrere Komponenten der immunchemischen Reaktion können außerdem auf funktionellen Schichten bereitgestellt werden, wie dies beispielsweise für eine Konjugatfreisetzung der Fall ist.

In der Fig. 11 sind Möglichkeiten für Titrations-/Kom­ petitions-Formate dargestellt, die sich unterein­ ander durch eine sequentielle oder gleichzeitige In­ kubation der Immunkomponenten unterscheiden. Diese beiden Assayformate eignen sich insbesondere für die Bestimmung niedermolekularer Verbindungen, die keinen Sandwich ausbilden können.

Außerdem haben die in Fig. 11 gezeigten Assayformate keinen direkt proportionalen Zusammenhang zwischen der Analytkonzentration und der Intensität des gemes­ senen Fluoreszenzsignales. Es besteht also ein umge­ kehrt proportional er Zusammenhang.

So kann bei dem oberen in der Fig. 11 gezeigten Beispiel der markierte Antikörper beispielsweise in der funktionellen Schicht 27, beim in Fig. 5 gezeig­ ten Beispiel, vorhanden sein.

Das mittlere Beispiel der Fig. 11 kann so ausgebil­ det sein, daß ein markierter Analyt, z. B. ebenfalls in dieser Schicht enthalten sein kann. Die untere Darstellung der Fig. 11 kann so durchgeführt werden, daß ein markierter Analyt beispielsweise in der funk­ tionellen Schicht 26 und ein Antikörper in Schicht 27 des in Fig. 5 dargestellten Beispieles enthalten sind. Die Durchführung des unteren Beispiels, das in Fig. 11 gezeigt ist, kann aber auch so durchgeführt werden, daß ein Antikörper in der funktionellen Schicht 26 und der markierte Analyt in der Schicht 27, bei dem in der Fig. 5 dargestellten Beispiel, enthalten sind.

Daraus folgt, daß bei den in der Fig. 11 gezeigten Assayformaten entweder der Analyt oder der Antikörper immobilisiert werden kann (vgl. oberes und mittle­ res Beispiel der Fig. 11). Somit können auch die bei den Sandwich-Assayformaten beschriebenen Methoden zumindest teilweise eingesetzt werden. So kann ein generischer anti-Antikörper (vgl. unteres Beispiel in Fig. 11) oder aber auch Protein A/G (nach Biotiny­ lierung des spezifischen Antikörpers auch Avidin) immobilisiert sein. In diesem Fall, dient die immobi­ lisierte Biokomponente ausschließlich zur Anreiche­ rung des zugesetzten spezifischen Antikörpers und kann daher im Überschuß immobilisiert werden.

Nachfolgend sollen weitere Assayformate mit direkt proportionalem Zusammenhang zwischen Analytkonzentra­ tion und Fluoreszenzsignalintensität beschrieben wer­ den.

Hierfür sind prinzipiell zwei Möglichkeiten vorhan­ den, wobei der jeweilige Assay mit einer zusätzlichen festen Phase oder in Lösung durchführbar ist.

Es können beispielsweise alle Komponenten in Lösung inkubiert werden. Das in Fig. 12 gezeigte Assayfor­ mat sieht eine Vorinkubation der Reaktanden und die Ausbildung eines Bindungsgleichgewichtes vor. Ein freier Analyt konkurriert mit dem markierten Analyt um die Bindung zum Antikörper, wobei auf der Boden­ platte 3 im Detektionsbereich der gleiche Antikörper immobilisiert ist, der auch in der Lösung enthalten ist.

Die Immobilisierung kann wie bei Sandwich-Assayfor­ maten durchgeführt werden.

Da nur freier, d. h. nicht-Antikörper-gebundener mar­ kierter Analyt bestimmt wird, resultiert ein direkt proportionaler Zusammenhang zwischen der Analytkon­ zentration und dem Fluoreszenzsignal.

Außerdem dient die immobilisierte Biokomponente aus­ schließlich der Anreicherung des Hapten-Fluorophor- Konjugates und kann somit im Überschuß immobilisiert sein. Durch Immobilisierung eines spezifischen Anti­ körpers kann ein entsprechender Aufbau der erfin­ dungsgemäßen Vorrichtung jedoch nur für jeweils einen Analyten eingesetzt werden.

Das in Fig. 12 gezeigte Assayformat kann mit einer Vorrichtung, wie sie in Fig. 5 dargestellt ist, durchgeführt werden, wenn in der funktionellen Schicht 26 ein markierter Analyt und in der funktio­ nellen Schicht 27 Antikörper enthalten sind.

Für den Fall, daß anstelle des markierten Analyten ein markiertes Analyt-Analogon verwendet wird, das eine deutlich herabgesetzte Affinität zum Antikörper aufweist, kann auch ein bereits beschriebener Ver­ drängungsassay durchgeführt werden. Dies ist in der Fig. 13 dargestellt, wobei ein markierter Analyt oder ein Analyt Analogon beispielsweise in der funk­ tionellen Schicht 28, des in Fig. 6 gezeigten Bei­ spieles, enthalten sein kann.

Es kann aber auch eine zusätzliche feste Phase ausge­ nutzt werden, die entweder in einem separaten Reak­ tionsraum oder als funktionelle Schicht direkt auf dem Detektionsbereich der Bodenplatte 3 untergebracht sein kann.

Die zusätzliche feste Phase kann prinzipiell die gleichen Funktionen ausüben, wie die funktionellen Schichten.

Die Verwendung eines separaten Reaktionsraumes (z. B. ein Inkubationsröhrchen), wie dies beispielsweise der Probencontainer 10, der in den Fig. 3 und 4 ge­ zeigt ist, sein kann, hat den Vorteil, daß generi­ sche, d. h. für alle Analyten verwendbare Aufbauten eingesetzt werden können.

Auf diesen universellen Aufbau wird nicht ein spezi­ fischer, sondern ein generischer anti-Antikörper oder aber Protein A/G, Avidin (nach Biotinylierung des Antikörpers) u. a. immobilisiert. Da lediglich eine Biokomponente oberhalb der Bodenplatte 3, ange­ reichert wird, können die immobilisierten Komponenten im Überschuß aufgebracht werden.

Dabei kann generell so verfahren werden, daß eine der Immunkomponenten (der markierte Antikörper oder mar­ kierte Analyt) auf einer festen Phase zurückgehalten wird, beispielsweise einer funktionellen Schicht mit Hapten-Protein-Konjugat. Dabei wird nur bei Anwesen­ heit von freien Analyten ein Teil der markierten Kom­ ponenten nicht an die feste Phase gebunden und kann anschließend oberhalb der Bodenplatte 3 im Detek­ tionsbereich gemessen werden. Dieser Sachverhalt ist im in der Fig. 14 gezeigten Beispiel schematisch dargestellt.

Dabei konkurriert freier und auf der festen Phase immobilisierter Analyt um die Bindung zum spezifi­ schen Antikörper, wie dies in einem ersten Schritt oben in Fig. 14 dargestellt ist.

Die feste Phase wird nur von Antikörpern, die zuvor an Analyt gebunden haben, passiert, wie dies im unte­ ren Teil der Fig. 14 dargestellt ist. Demzufolge kann nur Analyt gebundener Antikörper, beispielsweise von einem generischen anti-Antikörper detektiert wer­ den. Auch hier besteht ein direkt proportionaler Zu­ sammenhang zwischen der Analytkonzentration und der Intensität der gemessenen Fluoreszenz.

Wird im konkreten Fall der Fig. 14 eine Membran als zusätzliche feste Phase verwendet, die in dem Aufbau integriert wird, so kann beispielsweise die funktio­ nelle Schicht 26 (Reservoir für den markierten Anti­ körper) und die feste Phase als Schicht 27, des in der Fig. 5 gezeigten Beispieles, bei dem in der Fig. 14 gezeigten Beispiel verwendet werden.

Als feste Phasen können verschiedene Materialien die­ nen, von den sich insbesondere Membranen leicht als funktionelle Schichten integrieren lassen. Solche Membranen können Nitrocellulose, Immuno-Dyne, Konju­ gat-Release-Membranen, regenerierte Cellulose, u. a. sein. Dabei kann die jeweilige Biokomponente durch Adsorption, kovalente Bindung oder durch Affinitäts­ bindung immobilisiert werden. Haptene können als Hap­ ten-Protein-Konjugat immobilisiert werden.

Gegenüber transversal durchflossenen Membranen bieten lateral durchflossene Membranen und gepackte Säulen Vorteile durch eine wiederholte Gleichgewichtsein­ stellung und ermöglichen eine quantitative Anbindung der Biokomponenten. Geeignete Materialien für gepack­ te Säulen sind:
Sepharose, Porosmedien u. a.
Die Wandung eines möglichen verwendbaren Gefäßes, beispielsweise die Wandung des genannten Probencon­ tainers 10 bzw. die Zuleitungen, können ebenfalls als feste Phase dienen und beispielsweise Polysterolgefä­ ße oder Glaskapillaren sein. Weiter können Partikel­ suspensionen, in denen die Probe eine Suspension mit festen Partikeln (Magnetpartikel, Latex, u. a.) sein kann, verwendet werden. Diese Partikel können dann durch Anlegen eines Magnetfeldes oder durch Filtration im Nachgang ge­ trennt werden.

Mit der Erfindung ist es auch möglich, sogenannte Verdrängungs-Assayformate durchzuführen, wobei hier­ für prinzipiell zwei Varianten möglich sind. Dabei kann die Verdrängung auf einer zusätzlichen festen Phase in einer funktionellen Schicht oder extern, also nicht in einer integrierten funktionellen Schicht oder direkt auf der Bodenplatte 3 im Detek­ tionsbereich stattfinden.

In der Fig. 15 ist ein Beispiel eines Verdrängungs­ assay's mit zusätzlicher fester Phase prinzipiell dargestellt. Die feste Phase kann entweder der ge­ nannte Probencontainer 10, eine Zuleitung oder eine funktionelle Schicht sein. Dabei wird ein markierter Antikörper oder Analyt durch spezifische Ligand/Re­ zeptor-Wirkung gebunden. Durch Zugabe eines freien Analyten kann die Verdrängung der Biokomponente er­ reicht werden.

Die feste Phase kann beispielsweise die funktionelle Schicht 26, im Beispiel nach Fig. 5, sein.

Im in der Fig. 15 gezeigten Beispiel wird der mar­ kierte Antikörper auf der Bodenplatte 3 im Detek­ tionsbereich von einem generischen anti-Antikörper oder aber Protein A/G, Avidin u. a. gebunden.

Wird aber gegenteilig verfahren und ein markierter Analyt an einen immobilisierten Antikörper gebunden und anschließend verdrängt, so wird im Detektionsbe­ reich auf der Bodenplatte 3 ein spezifischer, gegen den Analyten gerichteter Antikörper immobilisiert. Da in jedem Fall immer die verdrängte Komponente detek­ tiert wird, besteht ein direkter proportionaler Zu­ sammenhang zwischen der Konzentration des jeweiligen Analyten und der Fluoreszenzsignalintensität.

Die Verdrängung kann aber auch direkt im Detektions­ bereich auf der Bodenplatte 3 als sehr einfache As­ saykonfiguration durchgeführt werden, da lediglich eine Probe durch das Element geführt wird.

Es finden keine Vorinkubationen oder ähnliche Schrit­ te statt. Eine Konditionierung der Probe kann durch Integration entsprechender funktioneller Schichten erzielt werden. Auch hier bieten sich zwei verschie­ dene Möglichkeiten an, den Analyten oder den spezifi­ schen Antikörper zu immobilisieren, wie dies in Fig. 16 gezeigt ist.

Dabei wird jeweils die Abnahme des Fluoreszenzinten­ sitätssignals gemessen, so daß ein umgekehrt propor­ tionaler Zusammenhang zwischen der Analytkonzentra­ tion und der Fluoreszenzsignalintensität auftritt. Der Absolutwert des Anstieges des Fluoreszenzintensi­ tätssignals ist jedoch der Analytkonzentration direkt proportional und kann in der bereits beschriebenen Form ausgewertet werden.

Die Fig. 17 dient als generelle Legende für die in den Fig. 9 bis 16 gezeigten verschiedenen Assay- Formate.

Claims (14)

1. Vorrichtung zur Durchführung von Fluoreszenz­ tests mittels Evanescentfeldanregung, bei der mindestens eine nahezu monochromatisches Licht aussendende Lichtquelle (7, 7'), Licht­ strahlen mit einer Fluoreszenz eines an einem chemischen oder biochemischen Partner eines all­ gemeinen Rezeptor-Ligand-Systems gebundenen Mar­ kierungsstoffes hervorrufenden Wellenlänge, in einem durch eine vorgebbare Eindringtiefe d für das evanescente Feld bestimmenden Winkel α auf eine Grenzfläche (20) zwischen einer optisch transparenten Bodenplatte (1) aus Material, des­ sen Brechungsindex n₁ größer ist als der Brechungsindex n₂ des Materials oberhalb der Grenzfläche (20) und einem küvettenförmig ausge­ bildeten Aufnahmebereich (2) für die Probe rich­ tend, angeordnet ist,
der Aufnahmebereich (2) auf der entgegengesetzt zur Bodenplatte (1) angeordneten Seite mit einer Deckplatte (3) abgedeckt ist, wobei zwischen Bodenplatte (1) und Deckplatte (3) mindestens eine funktionelle Schicht (26, 27, 28, 28', 29) angeordnet ist, und
ein Detektor (5) zur Erfassung des Fluoreszenz­ lichtes gleichseitig zur Bodenplatte (1), wie die Lichtquelle, angeordnet ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Bodenplatte (1) und Deckplatte (3) ein den küvettenförmigen Aufnahmebereich (2) ausbildender Abstandshalter (4) angeordnet ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der Deckplatte (3) eine Zufluß- und eine Abflußöffnung (9, 11) vorhanden sind.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionelle(n) Schicht(en) (26, 27, 28, 28', 29) aus fibrösem Material, Cellulose, Nitrocellulose, Polypropy­ len, Polycarbonat, Polyvinyldifluorid oder aus einem Hydrogel oder aus Polyelektroly­ ten oder aus Kernspur- oder Glasfasermembranen bestehen.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine funktionelle Schicht (29) im Aufnahmebereich (2) im direkten Kontakt mit der Bodenplatte (3) steht.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere durch Trenn­ schichten (25, 25') getrennte funktionelle Schichten (26, 27) eine Verbindung der Zufluß- und Abflußöffnung (9, 11) über den Aufnahmebe­ reich (2) mittels Durchbrechungen ermöglichend, alternierend übereinander angeordnet sind.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei un­ terschiedlich funktionelle Schichten in einer Ebene nebeneinander angeordnet sind.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere funktionelle Schichten (28, 28', 29) unmittelbar übereinander angeordnet sind.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein ein definiertes Probenvolumen vorgebender Probencontainer (10) so angeordnet ist, daß eine Verbindung zwischen küvettenförmigem Aufnahmebereich (2) und Proben­ container (10) gebildet ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine feste Phase im Probencontainer (10) in einem Zuflußkanal, im Aufnahmebereich (2) oder eine funktionelle Schicht als solche ausgebildet ist.

11. Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenztests mittels Evanescentfeldanregung unter Verwendung einer Vorrichtung gemäß dem Anspruch 1, bei dem ein Probenvolumen mittels Saug-, Druckwir­ kung oder Kapillarkräften durch die funktionelle(n) Schicht(en) (26, 27, 28, 28', 29) und/oder den küvettenförmigen Aufnahmebereich (2) geführt wird, die je nach biochemischen Assay zu bestimmenden markierten chemischen oder biochemischen Kompo­ nenten an der Oberfläche im Aufnahmebereich (2) gebunden werden, und durch Evanescentfeldanregung mit einem Detektor (5) das Fluoreszenzlicht zeitab­ hängig gemessen wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Anstieg der ge­ messenen Fluoreszenzlichtintensität zur Bestim­ mung der Analytkonzentration benutzt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Differenz zweier in vorgebbaren Abständen gemessenen Fluoreszenz­ intensitätssignalen (S₁ und S₂) zur Bestimmung der Analytkonzentration benutzt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche von 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß Sandwich-, Titra­ tions-, Kompetitions- und/oder Verdrängungsassays durchgeführt werden.