JP2001515592A

JP2001515592A - 蛍光免疫検定を実施する装置および方法

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Publication number: JP2001515592A
Application number: JP54002398A
Authority: JP
Inventors: マルクスモイゼル; ディータートラウ; アンドレアスカーターカンプ
Original assignee: インスティテュートファーヒェモウントビオゼンゾリックミュンスターエー．ファウ．
Priority date: 1997-03-18
Filing date: 1998-03-11
Publication date: 2001-09-18
Also published as: WO1998041843A2; WO1998041843A3; CA2283251A1; RU2194972C2; DK0968412T3; DE19711281C1; EP0968412B1; EP0968412A2; ATE227425T1; DE59806188D1; CA2283251C

Abstract

(57)【要約】本発明は一過性電磁界励起の手段によって特に定量蛍光免疫検定を実施するための装置と方法に関する。定量蛍光免疫検定には種々の公知な一般的レセプター-リガンド系の生化学検定をこの方法の基礎として使用することができる。このために、少なくとも一つの光源からの光が屈折率の異なる二つの媒体の界面に角度αで導かれる。光源は標識物質を励起させるために適する波長を有する実際に単色光を放射するものから選ばれる。光は光学的に透明な基部プレート(1)と試料のセル状収容部位(2)との界面(20)に導かれるが、基部プレート(1)は界面(20)上の材料の屈折率n₂より大きな屈折率n₁を有する材料から構成される。収容部位(2)が基部プレート(1)に対抗して配置する側で被覆プレート(3)によって被覆され、基部プレート(1)と被覆プレート(3)との間に少なくとも一つの機能層(26,27,28,28',29)を配置し、蛍光を検出するための検出器(5)が光源と同じ基部プレート(1)の側に配置されている。

Description

【発明の詳細な説明】蛍光免疫検定を実施する装置および方法本発明は一過性電磁界励起の手段によって特に定量的蛍光免疫検定を実施する装置に関する。本明細書では、抗原-抗体、レクチン-炭化水素、DNAまたはRNA- 相補的核酸、DNAまたはRNA-タンパク質、ホルモンレセプター、酵素-酵素補因子、プロテインGまたはプロテインA-免疫グロブリン、或いはアビジン-ビオチンなどの大多数の多様で周知な一般的レセプター-リガンド系の生化学検定を基本として用いることができる。しかし、抗原-抗体系が望ましい。本発明に拠って特に高分子化合物および低分子化合物(例えば、ハプテン)が検出される。蛍光免疫検定法、或いは蛍光免疫センサでさえ長い間広く利用され、主に液体試料マトリックス中において未知量の特異的な化学物質または生化学物質の定量化に役立ってきた。ここでは抗体は決定される物質に選択的に結合する。この決定される物質は専門家によって抗原と称される。蛍光免疫検定法では、被検体に特異的な抗体が或特定な物質に特異的な波長λ_exで光学的に励起される標識物質によって標識される。そして、一般的にはより長い波長である他の常光を適当な検出器とともに用いて蛍光光の強度を評価する。このような蛍光免疫検定法または蛍光免疫センサを用いた測定を実施する際に一過性電磁界励起を利用することは既に従来技術の一部をなしている。したがって、バドレー(R.A．Badlay)、ドレイク(R．A．L．Drake)、シャンクス(I．A．Shanks)、F.R.S.による国際公開公報第WO94/27137号、スミス(A.M．Smith)及びステファンソン(P．R．Stephenson) による「免疫検定のための光センサ、毛細管充填蛍光装置(Optical biosensors for immunoassays:fluoresce.ncecapillary-fill device)」，フィル・トランス・R・ソサイエティー・Lund．(Phil．Trans． R．Soc．Lund.)B316，143頁-160頁（1987年）、クリステンセン(D．Christensen )、ダイル(S．Dyer)、フォワーズ(D．Fowers)、ヘロン(J．Herron)による「平面導波管免疫センサの励起と捕集形態の解析(Analysis of Excitation and Co llection Geometries for Planar Waveguide Immunosensors)」，プロシーディングス・エス・ピー・アイ・イー−インターナショナル・オプティカル・エンジニアリング(Proc．SPIE-Int．Soc．Opt．Eng.)第1986巻，医学上の診断に用いる光ファイバーセンサ(Fiber Optic Sensors in Medical Diagnostics),2頁-8 頁(1993年)において様々な解決法がすでに記述されている。しかしながら、周知な解決法は、特定の検定方式のみに適していて、対応するプロセス管理が必要な高価な機構を必要とする欠点を有している。したがって、本発明の目的は極めて簡単に構築された装置を用いて種々の生化学検定で定量的蛍光免疫検定が実施できる方法を創出することである。本発明に拠ると、この目的は請求項１記載の特徴部に記載された特徴を有する装置および請求項11の特徴を有する方法によって達成される。本発明の有利な実施例および展開は従属項に含まれる特徴を利用することで提起される。未公開で特許されたドイツ特許公報第DE19611025号に開示された装置では、少なくとも一つの光源からの光が屈折率の異なる二つの媒体の界面に角度αで導かれる。ここでの光源は、標識物質、この場合は発蛍光団、の励起に適切な波長を持つ実際に単色光を発する光源が選択される。光源はレーザダイオードであることが望ましい。レーザダイオードは小型でエネルギー消費が低く、ビームプロファイルが適切で発光効率が十分であるからである。しかしながら、単色光を発するその他の光源を利用することもできる。放射光が界面に達する角度αは、界面までの光束路に配置された材料およびそれに近接する材料の屈折率に加え、光の波長、一過性電磁界の透過深度ｄを決定する。界面までの光束路に配置された材料の屈折率n₁は界面で全反射を可能にするものでなければならず、したがって界面の後に配置された他の材料の屈折率n₂ よりも大きくなければならない。角度αはsin(α)〉n₂/n₁になるように選ぶことが好ましい。この前提条件が満たされてると、全ての光が界面で反射し、全反射が実現する。しかしながら、この条件が満たされると、比較的小部分の光が界面を通過して材料内に透過し、一過性電磁界が生じる。一過性電磁界を介して、界面の極近傍に位置した標識物質だけが光学的に励起される。蛍光免疫検定を実施する場合、この結果は抗体の標識物質または界面の表面に結合した抗原だけが励起されるということである。これらの発蛍光団から放射された光の蛍光強度はしたがって標識抗体または界面に結合した抗原の濃度に正比例し、使用された生化学検定により、抗原濃度に正比例または反比例する。ドイツ特許公報第DE19611025号に記載された装置は少なくとも１個の光源を使用している。この光源は実際に単色光を放射し、単色光を一過性電磁界に透過深度ｄを与える角度で、単色光に対して透明な基部プレート上に導く。基部プレートの屈折率n₁は1.33より大きくなければならない。基部プレートの反対側にキュベット状の収容部位が被覆プレートの間に形成されている。基部プレートとキュベット状収容部位との間に前記界面が形成され、一過性電磁界がキュベット状収容部位内の所定透過深度ｄで通常のレセプター-リガンド系の表面に結合した標識された化学的パートナーまたは生化学的なパートナーに作用し、標識物質として使用された発蛍光団を励起する。このようにして発生した蛍光は対応する強度で検出器によって測定される。検出器は光源と同じ側の基部プレート上に配置されている。ここでは検出器として、単一光感応検出器、直線または面配置した複数の光感応検出器を使用することができる。決定される試料上に偏光を導くことが望ましいことも記載されている。このためには、光源に続き偏光子を光の光束路に配置することができる。スペーサおよび多分に利用されるであろう分離層は肉厚が0.001から10mm、好ましくは50μmであり、スペーサ内のくぼみが試料の収容部位を形成する。スペーサおよび分離層は生物適合性接着フィルムで、両面接着であることが好ましい。本発明による方法は、既に説明したように、規定試料容積がキュベット状収容部位に導かれ、そこで一過性界磁励起を受けるということに本質的に基づいている。試料容積は吸引、加圧、毛管力の手段によってキュベット状収容部位および機能層へ導かれる。有利な実施の形態では、被覆プレートに少なくとも１個の入口開口部が設けられていて、この開口内に試料容器が挿入または配置される。開口部は連結が入口開口部または試料容器と収容部位との間に生じるように被覆プレートに配置している。さらに、キュベット状収容部位と連結する第２の開口部があり、流出口に該当する。第２の開口部も被覆プレートに設けられている。外部ポンプをこの第２の開口部に連結することも、或いは内部ポンプを挿入することもできる。本発明の特徴は本発明による装置の比較的簡単な基本形態を変更したり、様々な形態に利用できることである。したがって、基本要素、基部プレート、被覆プレートおよびキュベット状収容部位を有するスペーサは、必要に応じて中間に配置した、しかも試料を流通させる機能層、分離層を介して、殆どの異なる方法に組み合わせることができる。しかし、一つ以上のこのような機能層を試料が収容部位に流入する領域、入口開口部または入口開口部へ挿入される試料容器または入口開口部の連結部と収容部位との間の連結部に配置することによっても、流入域の一部を形成することができる。本発明に拠り異なる検定方式を実施することができ、これによって高分子化合物および低分子化合物が同様に検定される。サンドイッチ-滴定/競合方式や置換方式などの周知な全ての検定を行うことができる。機能層の間に分離層を使用する場合、または分離層を封入する場合、試料容積が装置全体を経由して確実に流れるように、対応するこれらの開口部を分離層に設ける必要がある。分離層として、接着フィルムを使用して、例えば、打抜き加工でフィルムに開口部を設けることができる。以下に、実施の形態によって本発明を更に詳細に説明する。図面を簡単に説明する。図１は試料を収容するための本発明による装置の一部である。図２は２個の光源を有する本発明によって構成される装置の実施の形態を表す模式図である。図３は試料容器を備えた装置である。図４は円筒状の中空体を有する装置である。図５は機能層を付加した平行流の装置である。図６は複数の機能層を付加した横断流の装置である。図７、８は時間依存型蛍光強度のパターンを示す。図９はサンドイッチ検定方式を示す。図11は滴定または競合検定方式を示す。図12、13は被検体濃度と信号強度の比が正比例する競合または置換検定の方式を示す。図14は固相を付加的に用いる検定方式を示す。図15は固相を付加した置換検定である。図16は更に他の置換検定を示す。図17は図９乃至図16に示した検定方式への一般的手引きである。本発明による装置の基本構造の一部を図１に示す。図１に示された基部プレート１、スペーサ４と被覆プレート３の３つの部品は蛍光免疫検定が行われる前に相互連結されるか、既に完全な最終ユニットに形成され、フロースルーセルおよび測定キュベットに類似する構造であってもよい。ここで、基部プレート１は屈折性の高い透明な材料、例えばガラスまたは屈折率n1>1.33のポリマー(PMMAまたはPC)などのプラスチック材から構成される。基部プレートの肉厚は0.01乃至10mm、好ましくは0.5乃至1mmの範囲でもよい。スペーサ４は薄いフォイルが好ましく、両面に接着フィルムで装着されるか、薄い接着フィルムを最初に基部プレート１に、次に被覆プレート３に適用してもよい。使用した接着剤を含むスペーサの合計肉厚は0.001乃至10mm、好ましくは0 .01乃至0.2mmの範囲でなければならず、50μmが最も好ましい。スペーサ４内に開口部を作りキュベット状の収容部位２を形成する。図１においては、被覆プレート３も認識でき、被覆プレートに連続する開口部９および11がこの実施の形態の導孔として形成されている。これらの機能については後ほど説明する。開口部９および11はスペーサ４の収容部位２の領域と少なくとも部分的に重なるように配置される。スペーサ４も生物適合性接着フィルムから構成されことが好ましい。またこの接着フィルムは取り外し可能な保護層で両面に装着されるのが好ましく、既に市販されている。図２に示した実施の形態は本発明によって構成された装置であり、２個の光源 7、7'、フィルタ19、19'および偏光子が用いられている。光源7'は第１の光源７からの波長と異なる波長の光を放射する。この実施の形態では、偏光の使用が望ましい。図２に示した装置は異なる波長で励起する異なる標識物質を用いる場合に好ましい。これらの実施の形態は発蛍光団Cy5およびCy7である。発蛍光団Cy5 を励起させるために、レーザダイオードが波長範囲635乃至655nmの光で用いられ、発蛍光団Cy7では波長範囲730乃至780nmの光を放射するレーザダイオードが用いられる。この実施の形態での測定は交互にどちらかに切り替わるダイオード7、7'による方式かまたは、例えば対応する同調チョッパーを用いて行い、光源７または7' のいづれか１つの光だけが、それぞれ試料に到達して試料を励起することを確実にし、間違いが起こらないようにしている。しかしながらここでは、二つの異なる蛍光信号が同じフィルタを通過しなければならないので、もはや広帯域フィルタ８を使用することはできない。したがって、２個のフィルタ８および8'を連続的に配置して励起光源7、7'の波長を選択的に阻止する。この目的には、例えばノッチフィルタを使用することができる。この配置によって、最初に基準信号が得られ、測定信号の内部補正が可能になる。基準測定では、試料からの抗原に指向しない基準抗体を用いる。基準抗体が最初に定量化され、異なった標識物質を用いて、判定すべき被検体に特異的な抗体Akと識別することができる。表面に実際に結合した基準抗体の量は第２の光源 7'で確定することができ、この光源7'の光が異なる標識物質の蛍光、第２の散乱光フィルタ8'および検出器５の動因となる。この基準抗体の量を確定することによって標識被検体に特異的な抗体 Akまたは抗原Agの喪失、すなわち表面に結合していない抗体または抗原を計量することができる。しかし、基準信号を得る他に、相互に独立して行われる２種類の免疫検定を実施することもでき、この違いは異なる発蛍光団を使用することで生じる。図３は被覆プレート３の開口部９に向けて試料容器10が配置する仕方を示し、このようにして開口部９を介して試料容器10と収容部位２との間が連結される。ここで試料容器10は標識物質発蛍光団で標識された既知量の生体成分が確定される試料と混合する容器を形成する。試料容器10は試料容積を明確に規定することができ、こうして固定した既知量の試料から抗原濃度に関する定量的表現が得られる。したがって試料容器10は、再現可能な結果が得られるように、常に同じ量で充満されていなければならない。常に最大限に満たされることが好ましい。実施される検定方式のなかには、特定の生体成分がそれぞれ試料容器10の表面に存在し、液体試料との接触を介して表面から脱離して試料内に到達する。更に、生体成分が試料容器10の中に加えられた固相上に見いだされることもある。簡易、且つ公知の方法では、凍結乾燥した抗体を試料容器10の表面に適用することからなる。この方法では、実際に免疫検定を実施する前に全体を比較的長期にわたって保存することができる。収容部位２は基部プレート上の表面を規定し、この面上で化学物質または生化学物質が、検定方式にしたがって、それぞれ固定される。図４は望ましくは円筒である中空体12を示している。この円筒中空体12の内部にはピストン13またはその他の適切な被覆体が収容され、この両者がポンプの働きをする。ピストン13が円筒中空体12の外に移動すると、負圧を生産して試料物質が収容部位２を介して試料容器10から円筒中空体12の方向に吸引される。この流れは試料容積の全体が収容部位２から搬送されるまで、収容部位２における毛細管力および吸湿羊毛で維持される。円筒中空体12は収容部位２と連結するように設定され、或いはその基部に穴を具備する。これは被覆プレート３での連結の可能性として第２の開口部11を介して実現することができる。被覆プレート３を使用しない場合、連結の可能性は他の方法で構築される。しかしながら、外部ポンプを開口部11に連結することもできる。試料を適用した後に(試料容器10によって)、所望の結合が一般的レセプタ-リガンド系のパートナー間で完全に行われるように、相当する時間待機する必要がある。その後にポンプ12、13を作動させ、全ての液体が収容部位２を介して移送されるまで待機する。光源７または光源7、7'で励起した後に、抗原濃度が確定され、このために図２に示した本発明による構造が用いられる。この構造は、既に図示し説明したように、異なる生化学検定の殆どに利用可能であり、説明を更なる実施の形態に戻す。図１、５および６から特に分かるように、本発明になる装置の主要部分は極めて変更可能な設計にすることができる。したがって、異なる要素(プレート、層) が殆どの異なる形態でキットを構成することができ、必要に応じて種々の検定方式がその場で利用可能である。図５は本発明になる装置の実施の形態を示し、平行流の機能層が付加されている。ここでは図１で既に説明した構造に、更に機能層26、27および分離層25、25 'が組み込まれている。この実施の形態では、２個の機能層26および27が相互に上下に配置し、全ての側が分離層25および25'によって包囲されている。分離層は、好ましくは、接着フィルムで構成され、他の実施の形態で既に説明したように開口部がフィルムに形成されている。これらの開口部が入口開口部９、機能層26、27、収容部位２と出口開口部11 との間の連結を可能にしている。図５に示す矢印は流れの方向を表す。異なる検定方式に適合させるには、機能層26と27の配置を変化させること、若しくはそれらの選択を変えること、またはその両方を実施することにより実現できる。したがって、機能層26および27は、例えば、試薬貯蔵層または純粋な反応層である場合もあり得る。しかしここに示していないが、少なくとも二つの異なる機能層を一つの平面に連続して通過するように配置する可能性もある。図６に示した本発明になる装置の一部の構造は横断流が実現する図５に示した実施の形態と異なる。この例では、３個の機能層28、28'および29が基部プレート上に相互に直接上下に配置している(すなわち、分離層が存在しない)。機能層 28、28'および29でこのように形成した集積層内に、キュベット状の収容部位２を持つスペーサ４が、この実施の形態では、被覆プレート３の下側に配置されている。ここにおいても図６に示す矢印は流れの方向を示す。図６に示す構造とは異なり、横断流を確保する他の配置も当然ながら構成することができる。既に説明したように、機能層はその数、配置および機能の選択を変えることができる。実施の形態に示した方法と逆の方法では、スペーサ４の上に配置するように設計する。この実施の形態でも分離層が用いられているが、横断流が阻害されていないことに留意すべきである。機能層は試薬貯蔵層または反応層として作用する。本発明に拠って用いられる機能層は完全で総合測定系を創出するという利点を有し、試料だけを構造体に導入すればよい。横断流と平行流との組合せ(図５および図６の例の組合せ)も可能である。機能層26、27、28、28'および29は試料の調製作業(中でも緩衝、濾過、分離、妨害物質の除去)に利用することができ、試薬担持層(例えば、複合体放出)または反応層(例えば、誘導化、生体成分の固定、または化学および免疫化学反応のいづれか一方、または双方の過程)としても利用される。異なる機能層に適切な材料には次のものがある。試料調製として、血漿および赤血顆粒を分離するための繊維性材料からできた膜、例えばポール・バイオサポート社（Pall Biosupport）から市販されている “ヘマダイン膜(Hemadyne-Membrane)”がある。しかしながら、セルロースまたは再生セルロースからなる濾紙も利用される。試薬担持層として、100％セルロースからなる紙もまた用いられ、或いは活性化ナイロン66が流動特性を変えるために、表面を変更または活性化するために用いられ(ポール・バイオサポート社から“プロダイン・オーダーACCUWIK膜(Prody ne order ACCUWIK-Membrane)”の商標名で市販されている)、特に平行流系には、変更された表面を有するポリエステル担体が用いられ流動特性を制御することができる。反応層として、ニトロセルロースからなるいわゆるニトロ流動膜、PVDF(ポリビニル二フッ化物)膜(ミリポル社（Millipor）から商標名“イモビロン(Immobil on)”で市販されている)が用いられ、表面を変更することができる。一般に、繊維性材料、セルロース、ニトロセルロース、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリビニル二フッ化物、ヒドロゲル(例えば、デキストラン、アクリルアミド、寒天、カラゲナン、アルギン酸)、高分子電解質(例えば、アクリル酸、ポリ-L-リシン、ポリ-L-グルタミン酸)、飛翔膜、或いはガラス繊維膜が利用される。測定信号を評価できる可能な基本的方法を図７および８に示す。図７は、時間に対する測定された蛍光信号の強度を示す。蛍光信号強度の直線的な上昇が発蛍光団の一過性な変化に関連付けられる。信号の上昇を微分することによって信号強度が確定される。この発蛍光団の一過性な変化は本発明の装置で測定される。この方法では、測定時間を極めて短時間に保つことができる。これは、化学検定または生化学検定の実施においては、蛍光強度の上昇は、それが検定の開始時点に生じるか、またはその後の時点に生じるかとは関係なく、短時間に判定しさえすれば良いからである。飽和範囲だけに留意し、測定が蛍光強度の一時的な変化を検出できる時間域においてだけ行われるように注意しなければならない。これとは別に、図８に他の可能性の原理を示す。ここでは、初期値と最終値との差が生じて、評価に用いられる。確定される被検体が時間t₁に添加される前に基本信号S₁を最初に受信し、被検体の添加の後に、所定の時間t₂に測定した蛍光強度の最終値S₂を確定する。次に、S₁値とS₂値との差から被検体の濃度を確定する。時間t₂とt₁との差は平衡が達成される十分な大きさでなければならない。図９乃至図16に、本発明で実施される可能性がある検定方式を示す。図９は実際に高分子化合物(中でもタンパク質)だけに適するサンドイッチ検定方式を示す。このサンドイッチ方式は原理的に少なくとも一つの機能層を用いる図５または図６に示す装置で実施される。この方式では、最初に被検体を標識抗体でインキュベートし、次に基部プレート３の検出部内に導いて一過性電磁界励起および対応する蛍光を検出する。サンドイッチ検定方式を逐次形態で実施するその他の方法では、最初に被検体、次に標識抗体が逐次サンドイッチを形成するように行われる。抗体を基部プレート部に固定する更なる可能な方法は次のステップからなる。 1. 吸着 2. 共有結合 3. 親和力結合(例えば、A-プロテインA/Gまたはアビジンへのビオチニル化の後 ) 4. 抗体上に置かれた核酸標識(単鎖RNAまたはDNA)を相補配列とハイブリット化させて単鎖核酸(RNAまたはDNA)として固定一過性電磁界励起のために、基部プレート部をプロテインA/G、中でもアビジンで被覆することは、それ以上に(殆どの異なる被検体に)普遍成分を生産する可能性を提供する。特に好ましい実施の形態はビオチニル化された(コレクタ)抗体および蛍光標識された(検出器)抗体を伴う被検体のプレインキュベーションを提供する。この二つの抗体は、例えば、機能化された層から同時または逐次的に放出される。全免疫複合体はアビジン(替わる選択肢として、ストレプトアビジンまたは中性アビジン)で被覆されたセンサの表面に結合することによって拘束される。信号形成において重要なのはビオチンとアビジンとの間の極めて高い親和力であり、これが検定感度の改善に繋がる。この実施の形態には、図２による装置が２種類の異なる標識物質と同時に用いられ、２種類の異なる被検体についての濃度確定がほぼ同時に、且つ収容部位内のそれぞれの結合部位に別々に実施され、標識生体成分を局部的、選択的に行う必要はない。しかしながら、図10に示すように、抗体および標識抗体のフラグメント(例えば、Fc部分またはScFvフラグメント)が被検体と同時にインキュベートされる中で検定方式を実施することもできる。ここでは、完全な抗体だけが結合し（プロテインA/Gまたはビオチニル化の後にアビジンと)、インキュベートの必要性がなくなる。この方式によって、使用した構造を再生する基礎的な可能性がある。だが、これはアビジン/ビオチンにおいては可能でない。サンドイッチ検定における被検体、抗体および標識抗体フラグメントの同時インキュベートでは、図10に示すように、標識抗体のフラグメントおよび抗体を、例えば、図５に示す例の機能層27に包含することができる。コレクタ抗体を固定する代わりに、他の生体成分、被検体の結合を固定することもできる(例えば、抗体を確定するサンドイッチ検定の場合におけるプロテインA/G)。全てのサンドイッチ検定において、信号と抗体濃度との間に正比例の関係が生じる。更に、免疫化学反応成分の一つまたはそれ以上の成分を、例えば複合体放出の場合におけるように、機能層上で調製することができる。図11は滴定/競合方式の可能性を示し、免疫成分に関する同時または逐次インキュベーションの違いによってお互いに異なる。これら二つの検定方式は特にサンドイッチを形成できない低分子化合物の確定に適している。図11に示す検定方式は、更に、被検体濃度と測定された蛍光強度との間に正比例の関係がなく、逆比例関係がある。したがって、図11の上の実施の形態では標識抗体は、例えば図５の実施の形態における機能層27中に存在し得る。図11の中間の実施の形態では、標識被検体が、例えばこの層に包含されるように構築されている。図11の下の実施の形態は標識被検体が、例えば機能層26に、抗体が図５の実施の形態の層27に含まれるように実施されている。しかし、図11に示す下の実施の形態の具体例では、抗体を機能層26 に、標識被検体を図５の実施の形態の層27に包含させることもできる。このことから、図11に示す検定方式では、当然ながら被検体もしくは抗体のいずれかが固定されることになる(図11中、上の実施の形態および中間の実施の形態を参照)。したがって、サンドイッチ方式について説明した方法を、少なくとも部分的に、用いることができる。このように一般的な抗体(図11の下の実施の形態参照)、或いはプロテインA/G(特異的抗体、ビオチニル化の後のアビジン)を固定することができる。この場合、固定された免疫成分は添加された特異的抗体を富化するためのみに働くので、過度に固定される。被検体濃度と蛍光信号強度との間に正比例の関係がある更なる検定方式について以下に説明する。これには基本的に二つの可能性があり、固相を付加するか、或いは溶液中でそれぞれの検定を行うかである。例えば、全成分を溶液中でインキュベートすることができる。図12に示す検定方式では反応成分がプレインキュベーションされ、結合平衡が形成される。遊離被検体は標識被検体と抗体への結合に関して競合し、この抗体も溶液中に含まれているので検出域の基部プレート上に固定される。この固定はサンドイッチ検定方式におけるように行われる。遊離した、すなわち抗体に結合していない、標識被検体だけが確定されるので、被検体濃度と蛍光信号強度との間に正比例の関係が生じる。更に、固定された生体成分が専らハプテン-蛍光複合体の富化のみに働くので、過度に固定される。しかしながら、特異的抗体の固定によって、本発明になる装置に同等な構造はそれぞれ一つの被検体だけに用いられる。図12に示す検定方式では、標識被検体が機能層26に、且つ抗体が機能層27に含まれていれば、図５に示す装置で実施することができる。標識被検体の代わりに標識被検体の類似体(抗体との親和力は明らかに低下している)が用いられる場合は既に説明した置換検定を実施する。これを図13に示す。標識被検体または被検体類似体は、例えば図６の実施の形態の機能層28に含まれている。しかし、固相を付加して利用することもでき、この固相は別の反応空間に納められても、または基部プレート３の検出部直上の機能層として収納されてもどちらでもよい。付加された固相は原理的に機能層と同じ機能を果たす。試料容器10(図３および４に示す)などの別の反応空間を利用することは一般的な構造、すなわち全ての被検体に使用できる構造が利用できるという利点を持つ。この普遍的な構造では、特異的でない一般的な抗-抗体、中でもプロテインA/G 、アビジン(抗体のビオチニル化の後)が固定される。一つの生体成分だけが基部プレート３上で富化されるので、固定成分は過剰に適用される。手順は、一般的に、一つの免疫成分(標識抗体または標識被検体)が固相、例えばハプテン-プロテイン複合体を伴った機能層の背面上に保持されるようにする。遊離被検体の存在の下においてのみ、標識成分の一部が固相に拘束されずに検出部の基部プレート３上で測定される。この状況を図14に模式的に示す。遊離被検体および固相上に固定された被検体は、図14の第１ステップ(上の図) が示すように、特異的抗体と完全に結合している。図14の下の図が示すように、被検体に予め結合した抗体は固相を通過する。この結果、被検体に結合した抗体だけが、例えば一般的な抗-抗体によって検出される。ここでも、被検体濃度と測定蛍光強度との間に正比例の関係が存在する。図14の具体例に膜を構造と一体化させて付加した固相として利用すると、図14 に示す実施の形態に固相を機能層26(標識抗体の貯蔵場所)および図５に示す実施の形態の層27として用いることができる。種々の材料が固相として作用するが、中でも特に膜は機能層として容易に一体化される。このような膜には、ニトロセルロース、免疫ダイニン、複合体放出膜、再生セルロースが含まれる。それぞれの生体成分がここで吸着、共有結合によって、或いは親和力結合によって固定される。ハプテンはハプテン-プロテイン複合体として固定される。横断流の膜と反対に、平行流の膜および充填カラムは平衡が反復して確立する利点を有し、生体成分の定量的な結合を可能にする。充填カラムとして適切な材料には、セファローズ、多孔質媒体がある。利用可能な容器の壁、例えば既に説明した試料容器10の壁、或いは供給パイプの壁は固相として作用する。この中には、例えば、ポリスチレン容器または毛管ガラスがある。試料が固体粒子(中でも磁性粒子、ラテックス)とともに懸濁している粒子懸濁を利用することもできる。これらの粒子は磁場を与えることにより、または後に続く濾過によって分離される。本発明を用いていわゆる置換検定方式を実施することもでき、原理的に二つの変異形が可能である。置換は機能層に付加した固相上で、或いは検出部の基部プレート３の外(すなわち、一体化した機能層内でなく)またはその直上で行われる。図15に固相が付加された置換検定の例を原理的に示す。固相は既に説明した試料容器10、供給パイプまたは機能層のいずれでもよい。標識抗体または被検体はここで特異的リガンド-レセプタ-作用によって捕捉される。遊離被検体を加えることによって、生体成分の置換が達成される。固相は、例えば、図５の実施の形態における機能層26であってもよい。図15に示す実施の形態では、標識抗-体は一般的な抗-抗体、中でもプロテイン A/G、アビジンによって検出部の基部プレート３上に捕捉される。しかし、反対の操作を行って標識被検体が固定された抗体と結合してから置換されると、基部プレート３上の検出部で被検体に向けられた特異的抗体が固定される。いずれの場合においても、置換成分が常に検出されるので、それぞれの被検体濃度と蛍光信号強度との間に正比例の関係が存在する。しかしながら、一つの試料だけが素子を経由して導かれるので、非常に簡単な検定形態として、基部プレート３上の検出部で置換を直接行うこともできる。プレインキュベーションまたは類似なステップは採られない。試料の調製は対応する機能層を一体化させることで実現される。図16に被検体または特異的抗体を固定する異なる二つの可能な方法を示す。ここでは、蛍光信号の強度の減少がそれぞれ測定され、被検体濃度と蛍光信号強度との間に逆比例の関係がある。しかし、蛍光強度信号の上昇の絶対値は被検体濃度に正比例し、既に説明した方法で評価される。図17は図９乃至16に示した異なる検定方式に関する一般的手引きを示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年２月１３日（１９９９．２．１３）【補正内容】明細書の補正書 R．Soc．Lund.）B316，143頁-160頁(1987年)、クリステンセン(D．Christensen) 、ダイル(S．Dyer)、フォワーズ(D．Fowers)、ヘロン(J．Herron)による「平面導波管免疫センサの励起と捕集形態の解析(Analysis of Excitation and Co llection Geometries for Planar Waveguide Immunosensors)」，プロシーディングス・エス・ピー・アイ・イー−インターナショナル・オプティカル・エンジニアリング(Proc．SPIE-Int．Soc．Opt．Eng.)第1986巻，医学上の診断に用いる光ファイバーセンサ(Fiber Optic Sensors in Medical Diagnostics),2頁-8 頁(1993年)において様々な解決法がすでに記述されている。さらに、国際公開公報第WO90/05295号に光バイオセンサシステムが記述されている。このシステムでは、１個以上の試料がダクトからポンプおよび弁を利用して１個以上のフロースルー測定セルに導かれる。このフロースルー測定セルは上部が開放されていて、その上に配置した光学的構造によって生体分子が定量的に検出される。新しい試料を連続測定するためには、測定誤差を避けるための相当な純化費用が当然要求される。この目的のための適切な素子または手段の名前が挙げられていないので、このために必要な試料調製は通常実際の測定の前に系外で行われるものと思われる。国際公開公報第WO90/06503号にセンサが記述されていて、励起光が適切な角度で界面上の光学的に透明な基板を介して光学的に透明な緩衝層へ導かれる。この上に導波管層がさらに適用され、決定される被検体がそれに結合する。緩衝層の屈折率は基板の屈折率および導波管の屈折率よりも小さい。基板/緩衝境界層で励起光の角度を適切に選択することで全反射が起こる。また、ここで生じた一過性電磁界を介して、励起光が緩衝層上に位置した導波管に結合する。導波管に結合した光は全反射によって導波管に導かれ、この過程における一過性電磁界の形成が蛍光励起に利用される。試料は１個以上のキャビティに収容され、キャビティの対応する寸法はキャビティ内の試料を毛管力の手段によって輸送することができる大きさの程度だけで制約される。試料がキャビティに収容された後、試料のさらなる流動または移動は行われない。しかしながら、周知な解決法は一般的に欠点を有し、特異的な検定方式だけに適切であり、対応するプロセス管理を伴う高価な構造を必要とする。しかしながら、周知な解決法は、特定の検定方式のみに適していて、対応するプロセス管理が必要な高価な機構を必要とする欠点を有している。したがって、本発明の目的は極めて簡単に構築された装置を用いて種々の生化学検定で定量的蛍光免疫検定が実施できる方法を創出することである。本発明に拠ると、この目的は請求項１記載の特徴部に記載された特徴を有する装置および請求項11の特徴を有する方法によって達成される。本発明の有利な実施例および展開は従属項に含まれる特徴を利用することで提起される。未公開で特許されたドイツ特許公報第DE19611025号に開示された装置では、少なくとも一つの光源からの光が屈折率の異なる二つの媒体の界面に角度αで導かれる。ここでの光源は、標識物質、この場合は発蛍光団、の励起に適切な波長を持つ実際に単色光を発する光源が選択される。光源はレーザダイオードであることが望ましい。レーザダイオードは小型でエネルギー消費が低く、ビームプロファイルが適切で発光効率が十分であるからである。請求の範囲の補正 1. 一過性電磁界励起の手段によって蛍光免疫検定を実施するための装置において、実際に単色光を放射する少なくとも一つの光源(7,7')を配置すること、屈折率n₁が界面(20)上の材料の屈折率n₂よりも大きな材料からなる光学的に透明な基部プレート(1)と試料のキュベット状収容部位(2)との間の前記界面(20)上に所定の透過深度ｄを介して一過性磁場を決定する角度αで一般的レセプター-リガンド系の化学的または生化学的パートナーに結合した標識物質が蛍光を発生させる波長を持つ光束を導くこと、前記収容部位(2)が前記基部プレート(1)と対抗して配置する側において被覆プレート(3)で被覆されていた前記基部プレート(1)と前記被覆プレート(3)または前記試料が前記収容部位(2)内に流入するための流入部との間に少なくとも一つの機能層(26,27,28,28',29)を配置して吸引、加圧または毛管力の手段によって平行または横方向に流通して試料を調製すること、前記光源と同じ前記基部プレート(1)の側に蛍光を検出する検出器(5)を配置することを特徴とする蛍光免疫検定を実施するための装置。 2. 前記基部プレート(1)と前記被覆プレート(3)との間にスペーサ(4)を配置して前記キュベット状収容部位(2)を形成することを特徴とする請求項１記載の装置。 3. 入口開口部と出口開口部(9,11)が前記被覆プレートに存在することを特徴とする請求項１または２記載の装置。 1. 前記機能層(26,27,28,28',29)が繊維性材料、セルロース、ニトロセルロース、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリビニル二フッ化物、或いはヒドロゲル、高分子電解質、飛翔膜またはガラス繊維膜からなること、または充填されたカラムとして構成されるを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の装置。 5. 前記収容部位(2)の少なくとも一つの前記機能層(29)が前記基部プレート(3) に直接接触していることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の装置。 6. 分離層(25,25')で分離された複数の前記機能層(26,27)が交互に上下に配置して前記収容部位(2)を介して開口部の手段によって前記入口および前記出口開口部(9,11)の連結を可能にすることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。 7. 少なくとも二つの異なる前記機能層(28,28',29)を一平面内に相互に傍に配置することを特徴とする請求項５記載の方法。 8. 複数の前記機能層(28,28',29)を直接相互に上下に配置することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。 9. 規定の試料容積を予め決定する前記試料容器(10)が前記キュベット状収容部位(2)と前記試料容器(10)との間に連結を形成させるように配置していることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の装置。 10. 固定層が流入ダクト内の前記試料容器(10)内または前記収容部位(2)内に形成され、または前記機能層がそのように形成されることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の装置。 11. 試料容積が吸引または加圧による手段、または毛管力によって前記機能層( 26,27,28,28',29)を介して導かれて試料を調製すること、その後に前記キュベット状収容部位(2)を経由して生化学検定に拠って決定される標識された化学成分または生化学成分を前記収容部位(2)で表面に結合すること、一過性電磁界励起を介して検出器(5)で蛍光を測定すること、時間依存性であることを特徴とする一過性電磁界励起の手段によって蛍光免疫検定を行うための方法。 12. 前記機能層(26,27,28,28',29)で妨害物質の濾過、分離、除去、試薬の放出または化学反応が行われることを特徴とする請求項11記載の方法。 13. 測定された蛍光強度の上昇を被検体濃度の決定に用いることを特徴とする請求項11または12記載の方法。 14. 所定の間隔で測定された二つの蛍光強度信号(S₁,S₂)間の差を被検体濃度の決定に利用することを特徴とする請求項11または12記載の方法。 15. 抗原-抗体、レクチン-炭化水素、DNAまたはRNA-相補的核酸、DNAまたはRNA タンパク質、ホルモンレセプター、酵素-酵素補因子、プロテインGまたはプロテインA-免疫グロブリン、或いはアビジン-ビオチンなどの一般的レセプター-リガンド系の生化学検定が実施されることを特徴とする請求項11から14のいずれか一項に記載の方法。 16. サンドイッチ、滴定、競合および/または置換検定が実施されることを特徴とする請求項11から15のいずれか一項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者カーターカンプアンドレアスドイツ連邦共和国ミュンスターＤ― 48149 ヴィルヘルムシュトラーセ 65

Claims

【特許請求の範囲】 1. 一過性電磁界励起の手段によって蛍光免疫検定を実施するための装置において、実際に単色光を放射する少なくとも一つの光源(7,7')を配置すること、屈折率n₁が界面(20)上の材料の屈折率n₂よりも大きな材料からなる光学的に透明な基部プレート(1)と試料のキュベット状収容部位(2)との間の前記界面(20)上に所定の透過深度ｄを介して一過性電磁界を決定する角度αで一般的レセプター-リガンド系の化学的または生化学的パートナーに結合した標識物質が蛍光を発生させる波長を持つ光束を導くこと、前記収容部位(2)が前記基部プレート(1)に対抗して配置する側において被覆プレート(3)で被覆されている前記基部プレート(1)と前記被覆プレート(3)または前記試料が前記収容部位(2)内に流入するための流入部との間に少なくとも一つの機能層(26,27,28,28',29)を配置すること、前記光源と同じ前記基部プレート(1)の側に蛍光を検出する検出器(5)を配置することを特徴とする蛍光免疫検定を実施するの装置。 2. 前記基部プレート(1)と前記被覆プレート(3)との間にスペーサ(4)を配置して前記キュベット状収容部位(2)を形成することを特徴とする請求項１記載の装置。 3. 前記被覆プレートに入口開口部と出口開口部(9,11)があることを特徴とする請求項１または２記載の装置。 4. 前記機能層(26,27,28,28',29)が繊維性材料、セルロース、ニトロセルロース、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリビニル二フッ化物、或いはヒドロゲル、高分子電解質、飛翔膜またはガラス繊維膜からなることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の装置。 5. 前記収容部位(2)の少なくとも一つの前記機能層(29)が前記基部プレート(3)に直接接触していることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の装置。 6. 分離層(25,25')で分離された複数の前記機能層(26,27)が交互に上下に配置して前記収容部位(2)を介して開口部の手段によって前記入口および前記出口開口部(9,11)の連結を可能にすることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。 7. 少なくとも二つの異なる前記機能層(28,28',29)を一平面内に相互に傍に配置することを特徴とする請求項５記載の方法。 8. 複数の前記機能層(28,28',29)を直接相互に上下に配置することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。 9. 規定の試料容積を予め決定する前記試料容器(10)が前記キュベット状収容部位(2)と前記試料容器(10)との間に連結を形成させるように配置していることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の装置。 10. 固定層が流入ダクト内の前記試料容器(10)内または前記収容部位(2)内に形成され、または前記機能層がそのように形成されることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の装置。 11. 試料容積が吸引または加圧による手段、或いは毛管力によって前記機能層( 26,27,28,28',29)および前記キュベット状収容部位(2)のいづれか一方、または双方を介して導かれること、生化学検定に拠って決定される標識された化学成分または生化学成分が前記収容部位(2)で表面に結合すること、一過性電磁界励起を介して蛍光が前記検出器(5)で測定されること、時間依存性であることを特徴とする一過性電磁界励起の手段によって蛍光免疫検定を行うための方法。 12. 前記測定された蛍光強度の上昇を被検体濃度の決定に用いることを特徴とする請求項11記載の方法。 13. 所定の間隔で測定した二つの蛍光強度信号(S₁,S₂)間の差を被検体濃度の決定に利用することを特徴とする請求項11記載の方法。 14. 抗原-抗体、レクチン-炭化水素、DNAまたはRNA-相補的核酸、DNAまたはRNA タンパク質、ホルモンレセプター、酵素-酵素補因子、プロテインGまたはプロテインA-免疫グロブリン、或いはアビジン-ビオチンなどの一般的レセプター-リガンド系の生化学検定が実施されることを特徴とする請求項11から13のいずれか一項に記載の方法。 15. サンドイッチ、滴定、競合および置換検定のいづれか一方、または双方が実施されることを特徴とする請求項11から14のいずれか一項に記載の方法。