DE1965940A1

DE1965940A1 - Enzymmischungen

Info

Publication number: DE1965940A1
Application number: DE19691965940
Authority: DE
Inventors: Noe Frederick Force; Faith Jun William Thomas
Original assignee: Rohm and Haas Co
Current assignee: Rohm and Haas Co
Priority date: 1968-11-01
Filing date: 1969-10-29
Publication date: 1970-12-10
Also published as: OA03160A; IL33282A0; BR6913595D0; NL6916488A; FR2022408A1; GB1284575A; DE1954433A1; ES371062A1

Description

Dies· Erfindung betieht sich auf Enzyaunisohungen zum Löslichmachen und Hydrolysierenvon isolierten Eiweißstoffen. .

Die Bezeichnung "isolierter Eiweißstoff'¹, wie sie hier verwendet wird, ist so definiert, daß sie eich auf einen Eiweißstoff oder ein Protein bezieht, daf durch chemische und/ oder physikalische Mittel aus seineni natürlichen Zustand abgetrennt worden ist und das im wesentlichen in Wasser unlöslich ist. Der Ausdruck "lösliohmaohen" und / oder jede sprachliche Abwandlung davon, wie "Löeliehmachung⁰, "tÖslichmachen", '!löslioJi gemacht" und dergleichen, wie er hler unter Bezugnahme auf einen isolierten Eiweißstoff verwendet wird, bedeutet, daß dieser Eiweißstoff sich in einem wässrigen Medium in einer derartigen VTeise befindet, daß er ein

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kolloidales System bildet, aber daraus im wesentlichen in nicht-veränderter Form ausfällbar ist. Weiterhin kann der Auedruck "hydrolysieren" und / oder jede der verschiedenen sprachlichen Abwandlungen "Hydrolysierung", "Hydrolysieren", "hydrolysiert" Mnd dergleichen im Zusammenhang mit einem isolierten Eiweißstoff oder einem isolierten Eiweißstoff, der löslich gemacht worden ist, verwendet werden. In dieser Hinsicht soll das bedeuten, dass, wenn ein Eiweißstoff in eine wässrige Lösung einverleibt oder in ihr löslich gemacht und hydrolysiert worden ist, ist er chemisch verändert und schwerer daraus ausfällbar gemacht worden.

Eiweißstoffe gehören zu den Grundnahrungsmitteln. Zn zahlreichen Nahrungsmitteln werden verhältnismäßig große Mengen an Eiweißstoffen gefunden, z. B. in Fleisch, Sojabohnen, Limabohnen, Alfaalfa, Reis., Weizen, Mais, Erbsen, Milch, Kokosnüssen, Erdnüssen, Leinsamen, Baumwo11samen, Rapssamen, Fischderivaten und dergleichen. Diese Nahrungsmittel und zahlreiche andere eiweißhaltige. Rohstoffe, wie Algen, auf öl gewachsene Mikroorganismen, Hühnerfedern und dergleichen, die alle als eiweißhaltige Materialien bezeichnet werden können, stellen bedeutungsvolle Quellen oder Rohstoffe für Eiweißstoffe dar. Eiweißstoffe sind aber häuf ig auch nach der Abtrennung dtirch enzyraat ische, .chemische und / oder physikalische Mittel relativ unlöslich in Wasser uns sind deshalb schwer zu verwenden. Infolgedessen sind Eiweißstoffe häufig für viele Verwendungen ungeeignet oder schwer für die Herstellung von Getränken, Verdünnungen und industriellen Klebstoffen zu benützen.

Es ist zwar in zahlreichen Fällen möglich, einen isolierten Eiweißstoff durch eine alkalische Behandlung löslich zu machen; diese Arbeitsweise ist im allgemeinen aber nicht geeignet, wenn der Eiweißstoff als Nahrungsmittel oder zur Ergänzung eines Nahrungsmittels verwendet werden soll. Durch die alkalische Behandlung werden häufig bestimmte wesentliche Aminosäuren, die in dem Eiweißstoff vorhanden sind, zerstört. Dadurch wird aber der Wert von derartigen Eiweißstoffen als Nahrungsmittel herabgesetzt. Ausserdem ist eine derartige alkalische Behandlung häufig unwirtschaftlich und dem dabei erhaltenen Eiweißstoff fehlen zahlreiche Eigenschaften, die Ihn geeignet machen würden für eine Verwendung als Lebensmittel. Infolgedessen hat man schon seit langer Zeit und wiederholt nach Mitteln gesucht, durch welche man isolierte Eiweißstoffe besser und auch wirtschaftlicher löslich machen könnte.

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In ähnlicher Weise sind beachtliche Anstrengungen gemacht worden, um ein Mittel zu finden, durch welches man isolierte Eiweißstoffe auch hydrolysieren könnte. Wenn dieses Ziel erreicht werden würde, würde dadurch die Herstellung von Produkten möglich werden, die bisher nur unbefriedigende Eigenschaften hatten oder sogar unbekannt waren. Als Beispiele für derartige Produkte seien eiweißhaltige Getränke genannt. Durch die vorliegende Erfindung wird deshalb eine schon lange vorliegende Aufgabe gelöst und ein beachtlicher Fortschritt erzielt, da es durch die Erfindung möglich wird, isolierte Eiweißstoffe löslich zu machen und sie zu hydrolysieren.

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Ein besonderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein wirtschaftliches und nicht schädliches Verfahren zum Löslichmachen und Hydrolysieren von isoliertem Eiweißstoff. Spezifischer ausgedrückt, bezieht sich die Erfin- μ dung: -

1. auf ein Verfahren, bei dem ein isolierter Eiweißstoff mit einer Enzymzubereitung in einer Menge, die wirksam ist, um diesen Eiweißstoff löslich zu machen, in Berührung gebracht wird; und

2. auf ein Verfahren, bei dem ein isolierter oder löslich gemachter Eiweißstoff mit einer Enzymzubereitung in einer Menge, die wirksam ist, um einen derartigen Eiweißstoff zu hydrolysieren, in Berührung gebracht wird.

Die Enzyrazubereitung, die zum Löslichmachen des isolierten Eiweißstoffes verwendet wird, kann als "Solutase" bezeichnet werden. Diese Enzymzubereitung leitet sich von einem Bakterien-Organismus ab und ist ausserdem dadurch gekennzeichnet, dass sie in der Lage ist, einen isolierten Eiweiß- ( stoff in Wasser in einem derartigen Ausmaß dispergierbar zu machen, dass ein kolloidales System entsteht. Ausserdem ist dabei der so dispergierte Eiweißstoff im wesentlichen durch Ausfällung wieder zürückgewinnbar.

Diese Fähigkeit der Zubereitung des Solutase-Enzymes zum Löslichmachen des isolierten Eiweißstoffes wird als "Solutase-Aktivität" bezeichnet. Ihr Grad oder ihre Intensität wird in'^olutase-Einheiten¹¹ (S.E.) angegeben. Eine S.E. ist diejenige Menge der Enzymzubereitung, die ein Gramm isolierten Eiweißstoff in 100 ml Wasser in 15 Minuten bei einem pH von 7,8 dispergiert, wenn die Mischung mit 275 rpm

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(Umdrehungen pro Minute) bei 40oc gerührt wird, unter "dispergiert¹¹ wird dabei selbstverständlich verstanden, dass ein kolloidales System gebildet wird, aus dem das löslichgetnachte Protein ausgefällt werden kann. Infolgedessen kann die Solutase-Aktivität einer Enzymzubereitung im Rahmen dieser Erfindung bestimmt werden, indem die Menge der Zubereitung ermittelt wird, die erforderlich ist, um eine bekannte Menge des isolierten Eiweißstoffes, der nachher aui der Lösung durch Ausfällen zurückgewinnbar ist, zu dispergieren. Umgekehrt kann die Solutase-Aktivität einer Enzymherstellung auch bestimmt werden, indem man die Menge an Eiweißstoff ermittelt, der durch eine bekannte Menge der Enzymzubereitung dispergiert und durch Fällung wieder zurückgewinnbar ist. Die zur Durchführung dieser Bestimmungen in betracht kommenden Arbeitsweisen sind für den Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt.

Nach der Erfindung wird die Hydrolyse des isolierten Eiweißstoffes und insbesondere des isolierten Eiweißstoffes, der löslich gemacht worden ist, dadurch bewirkt, dass man ihn mit einer Zubereitung eines Pilzenzyms in Berührung bringt. Diese Zubereitung des Pilzenzyms bzw. Fungusenzyms wird als "Hydrolase" bezeichnet; sie zeichnet sich dadurch aus, dass sie in der Lage ist, den Eiweißstoff in dem Ausmaß zu verändern, dass dieser aus seiner wässrigen Lösung nicht ausfällt.

Diese Fähigkeit der Zubereitung des Hydrolase-Enzyms für die Hydrolyse des isolierten Eiweißstoffes und des löslichgemachten isolierten Eiweißstoffes wird im Rahmen der Erfindung als "Hydrolase-Aktivität" bezeichnet. Der Grad oder die Intensität wird in "Hydrolase-Einheiten" (H.E.) angegeben. Eine H.E. ist diejenige Menge einer Enzym-Zubereitung, die 1,0 Gramm des löslichgemachten Eiweißstoffes nicht ausfällbar macht, wenn dieser 16 Stunden bei 40°C und unter Rühren mit 275 rpm bei einem pH von 6,2 mit der Enzyrazubereitung in Berührung gebracht worden ist. Infolgedessen kann die "Hydrolase-Aktivität" einer Enzyezubereitung leicht festgestellt werden.

Wie bereits angegeben wurde, leitet sich die Zubereitung des Solutase-Enzyms von einem Bakterienorganisraus ab.

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Im allgemeinen und vorzugsweise ist dieses eine wachsende Kultur von einem Bacillus, einschließlich der verschiedenen Arten und Mutanten oder Abwandlungen davon. Einige typische Mitglieder der Bacillus Gattung bzw, Familie schließen z. B, ein; B. subtilis, B. mycoides, B, amyloliqulfaciens, B_-1 cereus, B. tnacerans, B. megaterium, Ik sphaericus, B^ clrculans uV dgl.. Ein besonders bevorzugter Organismus für die Herstellung der Solutase ist B. subtilis.

Wie bereits ausgeführt wurde, leitet sich die Hydrolase aus einem Pilzorganismus ab. Im allgemeinen word zu ihrer Herstellung eine wachsende Kultur von Aspergillus, vorzugsweise aus der Aspergillus oryzae-nlger Gruppe, verwendet. Typische Mikroorganismen sind Aspergillus bryzae und Aspergillus niger, wobei die zuletzt angeführte Art bevorzugt ist.

Zahlreiche Arten und Abwandlungen von Bacillus und Asper» gillus Organismen, die bei dieser Erfindung verwendbar sind, werden in. Öffentlichen Sammlungen von derartigen Kulturen gezüchtet und sind dort erhältlich, z.B. bei der American Type Culture Collection inRockviiie> Maryland, USA.

Die Organismen für sowo'hl die Soltitasey als auch die Hy* drolase-Herstellung könrten entweder in einer flüssigen SUb"-mersen^^ oder Qberf lächenkultur in eineift^^ Medium gezüchtet werden, das eine verwendbare Quelle für die Energie, den assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält. Selbstverständlich können derartige Kulturmedien alle in der Regel verwendeten Wachstum!!faktoren und Mineralsalze oder Kombinationen davon enthalten.

Typische derartige Medien schließen ζ. B. ein, das unter der Bezeichnung ^MDifco Nutrient Byoth" im Handel erhältliche Nährmittelprodukt, das von der Firma Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA hergestellt wird, Andere > geeignete Nährmittel sind: Saccharose, Dextrose, Maltose, Maisstärke, andere Maisprodukte wie "corn steep liquor" (ein bekanntes Nährmittelme.dium für Mikroorganismen, das man erhält, indem man Maiskerne mit einer warmen 0,2%igen Schwefeldioxidlösung 48 Stunden bei der Gewinnung von Maisstärke, Maisöl und Gluten aus Mais behandelt, wobei diese

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Lösung Mineralsalze und auch aus dem Mais extrahierte organische Mineralien enthält und häufig vor der Verwendung als Viehfutter oder Wachstumsmedien für Mikroorganismen konzentriert wird), "corn distiller's dry soluble" (ein Maisprodukt, das als Nebenprodukt bei der Herstellung von Bourbon Whiskey, bei der Entwässerung der gelösten Reste und feinen übriggebliebenen Teilchen gewonnen wird, die erhalten werden, wenn die festen Maiskörner abgesiebt worden sind von dem Rückstand der alkoholischen Gärung und Destillation), Weizenkleie, Weizenmittelmehl; Sojabohnenmehl, Gelatine, Fleisch, Knochen, Fischabfälle, Blut, Mononatriumphosphat, Monoammoniumphosphat, Natriumeitrat, Magnesiumsulfat, Calciumchlorid, Kaliumchlorid, Melasse verstärkt mit einem hohen Gehalt an Protein-Nährstoffen u. dgl. . Maisstärke und Sojabohnenmehl oder andere eiweißhaltige Sojabohnenderivate sind zwar besonders bevorzugte Bestandteile von derartigen Kulturmedien, es ist jedoch möglich, zahlreiche andere eiweißstoffhaltige Verbindungen, z. B. Maismehl, "corn distiller's dry solubles", Rapssamenmehl, Erdnüsse u. dgl. ebenfalls mit guter Wirkung zu verwenden. Ein besonders wirksames flüssiges, submerses Medium enthält 0,5 bis 6,0% "com distiller's dry solubles", 2 bis 10% Maisstärke, 0,5 bis 2,0% Monoammoniumphosphat und 0,05 bis 3,0% Calciumchlorid, 0,5 bis 3,0% Kaliumchlorid und0,5 bis 2,0% Natriumeitrat, .

Ein noch bevorzugteres Medium enthält 1,0 bis 3,0% "corn •distiller's dry solubles", 5 bis 7% Maisstärke, 0,7 bis 1,0% Monoammoniurnphosphat und 0,1 bis 0,2% Calciumchlorid, 1,0 bis 2,0% Kaliumchlorid und 0,7 bis 1,2% Natriumeitrat.

- : ,■■'■■ - . ■-■■.. ; ;-".■■■ : Salze wie Mononatrium-, -kalium oder -ammoniumphosphat u. dgl. werden in der Regel in derartige Kulturmedien in Mengen von 0,001 bis 5% , vorzugsweise 0,1 bis 2%, bezogen auf das Gewicht des gesamten Mediums, einverleibt· Diese Salze sind besonders zweckmäßig, um ein schnelles Ansteigen des pH-Wertes während des Wachstums der Organismen zu verhindern. In ähnlicher Weise verhindert auch die Zugabe von Kohlenhydraten einen übermäßigen Anstieg des pH-Wertes während der Enzymerzeugung. Kohlenhydrate werden typischerweise in Form von Melassen, Stärke, durch Säure oder durch Enzyme modifizierter Stärke, Dextrose, Saccharose oder Mischungen davon angewandt.

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Für den pH-Bereich des Kulturmediums bei der Enzym-Herstellung ist ein beachtlicher Spielraum vorhanden. Es wurde jedoch gefunden, dass Enzymzubereitungen mit einem relativ hohen Niveau an Solutase- und Hydrolase-Aktivität erhalten werden, wenn das pH. in* dem Bereich von 4,5 bis 8,5, vorzugsweise von 5,5 bis 7,5, liegt.

Um optimale Enzymmisbeuten zu erhalten, ist es erforderlich, die wachsenden Kulturen bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 35°C, vorzugsweise im Bereich von 30 bis 35⁰C, zu halten. Wie jedoch bereits ausgeführt wurde, sind Abwandlungen für Temperaturen ausserhalb dieses Bereiches zulässig aber die Ausbeute und die Aktivität der so hergestellten Enzyme kann dadurch nachteilig beeinflußt werden.

Eine maximale Enzymerzeugung wird innerhalb von 48 bis 96 Stunden erhalten, wobei die Zeit aber selbstverständlich auch von derartigen Faktoren abhängt, wie der ausgewählte besondere Organismus, die gesamte Konzentration der festen Nährstoffe, das pH, die Temperatur, die Belüftung, das Rühren und dergleichen. Es ist jedoch unter den angegebenen bevorzugten Bedingungen möglich, den Wachstümszyklus zu reduzieren auf 18 Stunden oder auf noch weniger. Andererseits ist es im allgemeinen nicht nachteilig, wenn die Organismen unter den hier angegebenen Bedingungen für längere Zeiträume als für 96 Stunden aufbewahrt werden. Es ist jedoch nahezu immer wirtschaftlich vorteilhaft, die Enzymzubereitungen sobald als möglich nach Abschluß des Produktionszyklus¹ aufzuarbeiten. Für die Bestimmung des Abschlusses des Produktionszyklus¹ ist jedes der bekannten und der auf diesem Gebiet benützten Verfahren geeignet. i Gegenbenenfalls kann die Solutase- oder Hydrolase-Aktivität der rohen Kultur in regelmäßigen Zeitabständen mit Hilfe der vor· stehend beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Die Aufarbeitung des Enzyms soll zweckmäßigerweise dann erfolgen, wenn die besondere Aktivität für diese Kultur im wesentlichen ihre Spitze oder etwa ihre Spitze erreicht hat.

Im allgemeinen sind für das Wachstum der hier in beträcht kommenden Organismen in einer Oberflächenkultur im wesentlichen die gleichen Temperatur* und pH-Bedingungen erforderlich, wie diese für flüssige submerse Kulturen angegeben wurden.

Das für die Herstellung einer Oberflächenkultur verwendete

Medium wird aber in der Regel etwas von demjenigen für eine flüssige submerse Kultur abweichen. Ein bevorzugtes

Medium enthält äj»B· entfettete Sojabohnenflocken, Maisstärke ,*

und Wasser.

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Für die Konzentration der Enzymzubereitungen aus der rohen Kultur nach Abschluß des Wachstumszyklus' stehen zahlreiche Verfahren zur Verfugung, die sich leicht anwenden lassen- Die Enzymzubereitung kann mit Wasser extrahiert werden oder die gesamte Kultur kann getrocknet und zerkleinert werden. Bei den typischen Aufarbeitungen verfahren schließt die Konzentration die Entfernung des Wassers aus den gesamten Kulturen oder den filtrierten rohen Kulturen durch Sprühtrocknen, Vakuumkonzentration," Lyophilisierung oder Trocknen auf einem inerten Träger wie Lactose, anorganische Salze, Diatomeenerde, Mischungen davon und dergleichen ein. Alternativ können die in betracht kommenden Enzymzubereitungen mit Alkohol und Aramoniumsulfat ausgefällt werden. Die zuletzt angeführte Arbeitsweise führt im allgemeinen zu Produkten mit einem relativ hohen Grad an Aktivität und Reinheit, der noch weiter gesteigert werden kann, indem diese Ausfällung unter Kühlen vorgenommen wird. Da die Enzymzubereitungen nach der Erfindung in großem Ausmaß für die Herstellung von Nahrungsmitteln oder Futtermitteln verwendet werden, ist eine derartige erhöhte Reinigung häufig nicht nur wünschenswert sondern auch erforderlich. Die Trennung der Enzymzubereitung von der rohen Kultur ist aber nicht absulut nötwendig, da die Zubereitungen sich in wirksamer Weise auch in dieser Form verwenden lassen. Die Trennung und der Grad der Reinigung hängt in einem großen umfang von dem beabsichtigten End- .■.;■., verbrauch von derartigen Enzymzubereitungen ab.

Solutase- und Hydrolase-Mischungen werden in der Regel hergestellt, indem man die entsprechenden Enzymzubereitungen ρ mit einem inerten oder im wesentlichen inerten Träger kombiniert. Unter "Träger" wird dabei jeder Stoff oder jede Mischung von Stoffen verstanden, die verwendet werden kann, um die Enzymzubereitung aufzulösen, zu verdünnen, zu verteilen, zu verbreiten oder auszubreiten, ohne im wesentlichen ihre Wirksamkeit für das Löslichmachen und / oder die Hydrolyse des Eiweißstoffes herabzusetzen. Die Menge der Enzymzubereitung oder der Enzymzubereitungen, die mit einem Träger in irgendeiner Mischung kombiniert wird, hängt von der gewünschten Solutase- und/oder Hydrolase-Aktivität ab. Im allgemeinen enthalten derartige Mischungen Solutase und/oder Hydrolase in dem Bereich von 1 bis 99%, vorzugsweise 5 bis 25%, bezogen auf das Gewicht der Gesamtmischung. Der Aufbau von jeder besonderen Mischung nach der Erfindung * hängt in erster Linie davon ab, ob die Mischung beschränkt ist auf Solutase- oder Hvdrolase-Aktivitat oder eine Kombination

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von beiden enthalten soll. In zweiter Linie bestimmen die Aktivitätsniveaus der Enzymzubereitungen an sich und die gewünschte Aktivität der Mischung das Verhältnis zwischen der Enzymzubereitung oder den Enzymzubereitungen und dem Träger.

In der Regel hat eine Solutase-Mischung eine Aktivität im Bereich von 1,0 bis 1000 S.E. pro Gramm. Bevorzugt sind jedoch Solutase·Produkte mit einer Aktivität im Bereich von 250 bis 650 S.E. pro Gramm. In ähnlicher Weise haben die Hydrolase-Mischungen im allgemeinen Aktivitäten Im Bereich von 0,1 bis 500 H.E. pro Graem und bevorzugte Hydrolase-Produkte Aktivitäten von 10 bis 100 H.E. pro Gramm. Mischungen oder Produkte, die sowohl eine Solutase- als auch eine Hydrolase-Aktivität besitzen, haben in der Regel (J Eigenschaften hinsichtlich desLösiichmachens und der Hydrolyse innerhalb der Bereiche, die zuvor für die Produkte angegeben wurden, die nur eine von diesen Aktivitäten besitzen.

Eine typische Mischung nach dieser .Erfindung erhält man, wenn man Solutase und Hydrolase mit Alkohol aus den FiItraten der entsprechenden Kulturen ausfällt, wobei die Kulturen in der vorstehend beschriebenen Weise erzeugt wurden. Diese Ausfällungen werden dann in Lactose einverleibt, so dass sie 20% des gesamten Gewichtes einer derartigen Mischung ausmachen, wobei die Solutase und die Hydrolase in einem Verhältnis von etwa 1 zu 1 vorhanden sind. In ähnlicher Weise kann man die Solutase- und Hydrolafe-Enzymzubereitungen in getrennte Lactose-Träger geben und diese dann für eine Verwendung bei dem Verfahren nach der Erfindung kombinieren. Alternativ können f die einzelnen Solutase* und Hydrolate-Mischungen getrennt bei. dem Verfahren de* Erfindung verwendet werden. Es sind selbstverständlich zahlreiche Abwandlungen in Aufbau und in der Her-•teilung der Enzyvaischungen nach dieser Erfindung möglich, die für den Fachmann auf diesem Gebiet nicht besonders erläutert werden nüssen. I * ,

Wie bereit» ausgeführt wurde, wird bei dem Verfahren nach der Erfindung ein isolierter Eiweißstoff mit einer Solutase und / oder Hydrolase in Berührung gebracht. Die Menge an Solutase und / oder Hydrolase, die bei ditse« Verfahren verwendet werden soll, toll derartig teln, dafe fie wirkt·*'. ist, ι» den Eiweißstoff löilich «t «eichen usid / oder ihn zu hydrolysleren. _t '

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Im allgemeinen und vorzugsweise wird das Verfahren dieser Erfindung in einen wässrigen Medium durchgeführt. Die Menge des verwendeten Wassers hängt dabei selbstverständlich von dem zu behandelnden Substrat, das heißt von dem isolierten Eiweißstoff, ab. In den meisten Fällen wird eine minimale Menge an Wasser verwendet. In der Regel schwankt dieses auf einer Gewichtsbasis von 5 bis 30 Teilen Wasser auf einen Teil isolierten Eiweißstoff« Ein bevorzugtes Wasser zu Eiweißetoffverhältnis liegt im Bereich von 10 bis 20 Teilen Wasser auf einen Teil Eiweißstoff.

Bei den Verfahren der Erfindung hängt die wirksame Menge an Solutase und / oder Hydrolase nicht nur von der Aktivität der Enzymzubereitungen sondern auch von dem besonderen Eiweißstoffj der behandelt werden soll, und den angewandten Verfahrensbedingungen ab. Es wurde gefunden, dass etwa 0,1 bis 100, vorzugsweise 1,0 bis 25, S.E. ausreichend sind, um 1 Gram Eiweißstoff vollständig löslich zu machen. Zur vollständigen Hydrolyse werden für jedes Gramm isolierter oder löslichgemachter Eiweißstoff etwa 0,01 bis 100, vorzugsweise 0,1 bis 50 M.E. verwendet. In Abhängigkeit von den verschiedenen Bedingungen ist es jedoch möglich, auch weniger als 0,1 S.E. und /oder 0,01 H.E. pro Gramm Eiweißstoff zu benützen. Ebenso kann es in manchen Fällen erforderlich sein» «ehr als 100 S.E. und / oder 50 H. E. zu verwenden· Die Bestinnung der exakten Mengen an S.E. und / oder H.E.j die unter den gegebenen Bedingungen erforderlich sind, liegt selbstverständlich im Rahmen des Wissens eines Fachaanns auf diesem Gebiet.

Ia all geMinen wird das Verfahren nach der Erfindung in eine« pH Bereich von etwa 4,8 bis 10,8, vorzugsweise etwa 6,0 bis 7,8, durchgeführt. In Abhängigkeit von dem zu behandelnden Protein und den anderen Bestandteilen können zahlreiche Stoffe zur Einstellung und Aufrechterhaltung eines bestimmten pH einverleibt werden. Typische Stoffe dieser Art schließen ein: Anaoniunsulfat, Ammoniumhydroxid, Natriumhydroxid, Natriumcarbonat, Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Adipinsäure u. dgl. . Es ist vorteilhaft, das wässrige Medlua, da· den Eiweißstoff enthält, während der Berührung mit Solutase und / oder Hydrolase bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 60⁰C, vorzugsweise etwa 30 bis ,etwa 40⁰C zu halten. In der Regel schreitet das Verfahren für das Löslichmachen und / oder die Hydrolysierung bei höheren Temperaturen und unter leichtem Rühren schneller voran« Trotzdem schwankt die erforderliche Zelt für das LÖslichmachen und / oder die Hydrolyse in Abhängigkeit von dem

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besonderen Eiweißstoff, der Konzentration an Solutase und / oder Hydrolase, ihrer Aktivität und den anderen Verfahrensbedingungen. In der Regel ist für ein befriedigendes Löslichmachen oder Solubilisieren des Eiweißstoffes in Abhängigkeit von dem gewünschten Grad eine Zeit von mindestens 5 Minuten und in der Regel von 1 bis 5 Stunden oder länger erforderlich. Die Hydrolysierung nach der Erfindung erfordert in der Regel etwa 6 Stunden und im allgemeinen bis zu 16 Stunden oder länger. Unter bevorzugten Bedingungen wird eine vollständige Löslichmachung und Hydrolysierung innerhalb von 10 bis 12 Stunden erreicht..

Wie bereits festgestellt wurde, eignet sich das Verfahren der Erfindung besonders zum Löslichmachen und / oder Hydrolysieren von isolierten Eiweißstoff aus Sojabohnen. Dadurch ermöglicht es die Erfindung, Sojabohnen jetzt für die Herstellung von verschiedenen Lebensmitteln, Lebensmittelzusätzen, Ergänzungsprodukten für Lebensmittel zu verwenden. Insbesondere ist es jetzt möglich, isolierte Eiweißstoffe oder Proteine aus Sojabohnen löslich zu machen und zu hydrolysieren und sie zu Lebensmittelprodukten zu verarbeiten, wie Getränken (kohlensäurehaltig oder frei von Kohlensäure), Säuglingsnahrung, schlagsahneartigen Materialien, Glasuren, Deckschichten u. dgl. . Ausserdem können derartige Eiweißstoffe jetzt so modifiziert werden, dass sie für die Herstellung von Klebstoffen, Bindemitteln und zahlreichen anderen industriellen Produkten geeignet oder besser geeignet sind.

Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Herstellung von nährstoffhaltigen Getränken, die Sojabohnen-Eiweißstoffe enthalten. Vor dieser Erfindung waren derartige Getränke nicht einheitlich und hatten kein befriedigendes ästhetisches Aussehen, da die darin enthaltenen Eiweißstoffe, dazu neigten, sich aus der Suspension abzusetzen. Nach der Erfindung ist es ]edoch jetzt möglich, das aus Sojabohnen isolierte Protein (bzw. Eiweißstoff), so zu behandeln, dass es leicht löslich Und / oder hydrolysiert wird, wonach dann die erforderlichen Zusatzstoffe für Getränke zugegeben werden können. So wird ζ. B. das isolierte Sojabohnenprotein mit einer Solutase und Hydrolase so behandelt, dass es vollständig löslichgemacht und hydrolysiert wird. Danach wird das hydrolysierte Protein mit Wasser, Geschmackstoffen und Lebensmittelfarbstoffen versehen, um es auf den Geschmack des Verbrauchers abzustimmen. Dieses

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Produkt kann dann als solches oder nach Zugabe von Kohlensäure als erfrischendes, alkoholfreies Getränk, das auch noch ein Nahrungsmittel ist, verwendet werden. In ähnlicher Weise können Sojabohnenproteine mit SoIutase löslichgemacht werden und zu einer geeigneten Konsistenz für Deckschichten von Lebensmitteln geschlagen werden. Selbstverständlich kann man vor dem Schlagen die erforderlichen Farbstoffe und Geschmackstoffe zusetzen, so dass man dann gleich ein proteinhaltiges Material erhält, das unmittelbar für verschiedene Zwecke verwendbar ist. Es zeigt sich somit, dass die Erfindung eine Vielzahl von Anwendungen, insbesondere in der Lebensmittelindustrie hat.

In den nachfolgenden Beispielen werden einige Ausführungsformen der Erfindung für ihr besseres Verständnis noch näher erläutert, ohne dass jedoch diese Beispiele eine Beschränkung der Erfindung darstellen.

BEISPIEL 1

100 ml aliquote Teile von einem wässrigen Medium, das 2% "corn distiller's dry solubles", 6% Maisstärke, 0,67» Monoaamoniumphosphat, 0,2% Calciumchlorid, 2% Kaliumchlorid und 1% Natriumeitrat enthält, werden in 1 1 Weithals- · Erlenmeyer-Kolben gegeben, die mit 3 Milchfilter-Rahmen verschlossen werden.

Nach der Sterilisierung des Mediums bei 1,05 kg/cm^ für 30 Minuten werden die Kolben gekühlt und geimpft auf eine endgültige 2%ige Konzentration mit einer wässrigen Suspension, die aus einer Bacillus subtilis Kultur hergestellt wurde, die auf Kartoffel-Dextrose-Agar 48 bis 72 Stunden gewachsen war. Die Kolben werden dann auf einer Schüttelvorrichtung bei 260 rpm mit einer Exzentrizität von 5 - 2,5/10 cm bei 35 bis 37°C bei einer 5Ö%igen relativen Feuchtigkeit bebrütet. Das Ausgangs-pH ist 7,0. .

Nach 48 Stunden werden die Kulturen von der Schüttelvorrichtung für die Aufarbeitung entfernt. Man erhält ein Konzentrat der Enzymzubereitung, in dem man unter beständigem Mischen 3 Volumina an Äthanol bei 4< >C zu dem rohen FiItrat der vorstehend beschriebenen gesamten Kultur zugibt. Dadurch wird die Enzymzubereitung daraus ausgefällt. Diese Sobtase wird dann durch Filtrieren abgetrennt und im Vakttum bei 30 bis 35°C getrocknet, wodurch sie lagerfähig wird.

Ein 5 Gramm Anteil der Solutase wird mit 20 dram« Lactose gemischt. Die erhaltene Mischung hat eine Aktivität von 300 S.E. pro Gramm. "■'■""""■·-

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BADORlGiNAi. BEISPIEL 2

Etwa 200 Gewichtsteile Weizenkleie und etwa 100 Teile Weizen-Mittelmehl werden mit 400 Teilen Wasser gemischt. Diese Mischung wird dann durch Erwärmen sterilisiert und anschließend gekühlt. Danach wird eine stark sporenhaltige Kultur von Aspergillus oryzae (A.T.CC, No. 14,605) in einer Menge, die 0,1 Gew.-% der vorstehenden Mischung äquivalent ist, sorgfältig darin dispergiert. Die Temperatur wird auf 35°C erhöht und auf diesem Niveau für 16 Stun-^ den gehalten, um ein rasches Wachstum des Pilzes zu fördern. Danach wird sie 48 Stunden bei 28°C gehalten. Die erhaltene Kultur wird in einem Strom von Warmluft getrocknet und dann mit Wasser extrahiert. Auf 1 Volumen des Extraktes werden 4 Volumina Äthylalkohol zugegeben. Die erhaltene Ausfällung wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Alkohol gewaschen und in einem Strom von Warmluft bei 60⁰C getrocknet. Diese Zubereitung des Pilzenzyras wird dann mit ausreichend Lactose kombiniert, so dass eine Mischung mit einer Aktivität von 10 H.E* pto Gramm enteteht.

BEISPIEL 3

In je 10 Kolben werden 3 Gramm isoliertes Sojabohnenprotein in 100 ml Leitungswasser suspendiert· Das pH dieser Suspension wird durch Zugabe von verdünnter Natriumhydroxidlösung auf 7,8 eingestellt, Xn 5 der Kolben werden 1,75 mg der gefällten Solutase-Enzymzubereitung von Beispiel 1 zugegeben. Alle Kolben werden dann mit 275 rpra bei 4Q*C für verschiedene Zeiten, die in der folgenden Tabelle I angegeben sind, bewegt. Dann wird der Kolbeninhalt entfernt und unter vermindertem Druck durch eine Schicht von "Whatman No.42¹¹ Filtrierpapier filtriert. Die Menge des unlöslichen Proteins auf dem Filtrierpapier wird al· Trockengewicht bestimmt und die Menge an löslichgemacht ent Protein in dem Flit rat wird aus der Ge-Wichtsdifferenz berechnet. Dieses proteinhaltig· Filtrat * wird dann auf ein pH von 4,5 mit Milchsäure eingestellt, um das isoelektrisch* Protein, da· darin enthalten ist, ' . wieder auszufällen. Diese Ausfällung de· isoelektrischen Proteins wird durch Zentrifugieren abgeschieden, getrocknet und gewogen. In der Tabelle I wird eine Übersicht über diese Versuche und die erhaltenen Ergebnisse gegeben.

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TABELLE I	Probe	Zeit (Min.)	Gesamtes isoliertes Protein (löslichgemacht)g	Isoelektrisches Protein (zurückge wonnen) g
1. Wa s s erkont rο11e	5	0,41	0,33
2. Wasserkontrolle	10	—--_	0,26
3. Wasserkontrolle	15	0,44	0,23
4. Wasserkontrolle	20	0,37	0,26
5. Wasserkontrolle	30	0,35	0,22
6. mit Enzym	5	1,79	0,76
7. mit Enzym	10	2,07	1,09-
8. mit Enzym	15	2,32	1,36
9. mit Enzym	20	2,57	1,71
10. mit Enzym	30	2,61	1,83

Die Tabelle I zeigt deutlich, dass das isolierte Protein schnell löslich gemacht wird, wenn es mit Solutase behandelt wird.

BEISPIEL 4

In 5 Kolben werden je 3 Gramm isoliertes Sojabohnenprotein in 100 ml Leitungswasser.suspendiert. Diese Suspension wird dann auf ein pH von 6,2 mit verdünnter Milchsäure eingestellt. In 3 dieser Kolben werden Solutase von Baispiel 1 und Hydrolase von Beispiel 2 gleichzeitig in den in Tabelle II angeführten Mengen zugegeben. Die Angabe über den Prozentsatz der Konzentration für jede Enzymzubereitung, bezieht »ich auf das Gewicht des isolierten Proteins, das in 4*m Wasser suspendiert ist. Alle Kolben warden dann alt 275 rpa bei 40°C entweder für 16 oder 24 Stunden bewegt'. Dann wird

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der Kolbeninhalt entfernt und unter vermindertem Druck über die Schicht eines "Whatman No. <+2^M Filtrierpapiers filtriert. Die Menge des unlöslichen Proteins, das auf dem Filtrierpapier zurückbleibt j wird aus dem Trockengewicht bestirnt und die Menge des löslichgemachten Proteins in de· FiItrat wird durch Gewichtsdifferenz errechnet. Zu diesen Filtrat wird eine gleiche Menge von kalter 107₀-iger TrichloreesigaÄure (TCl) zugegeben, um das eventuell darin enthaltene isoelektrieche Protein wieder auszufällen. Nur bei den nicht mit Enzym behandelten Proben ist eine Ausfällung zu beobachten. Diese Ausfällung wird durch Zentrifugieren abgeschieden und alle Filtrate werden dann auf Protein-Stickstoff nach der Kjeldahl Methode analysiert, um den Prozentgehalt an löslichgemachteni Protein, das hydrolysiert worden ist, zu bestimmen. In Tabelle Tl sind die entsprechenden Ergebnisse zusammengestellt.

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TABELLE II Enzyrnzubereitung Zeit

(Gew.-% bezogen auf (h) isoliertes Sojabohnenprotein)

Isoliertes Protein
(löslichgemacht) (g)

Isoelektrisches Protein

(ausgefällt aus Filtrat) (g)

Prozent löslichgemachtes Protein, das hvdrolysiert war

	Solutase	Hydrolase	16.0	1,35
	keine	keine	16.0	2,13
O	0,058	0,333	16.0 24.0	2,40 1,48
09850	0,580 keine	0,333 keine	24.0	2,43
/1807	0,580	0,333

0,092 0,00

o_roo

0,084
0,00

83,0

95,5

100,0

«1,0 95,0

Diese Versuche demonstrieren deutlich, dass das isolierte Protein leicht löslichgemacht und hydrolysiert werden kann, wenn es mit Solutase und Hydrola-se behandelt wird.

Die gleiehe Arbeitsweise wird wiederholt mit der Ausnahme, dass die Hydroläse in die Proteinsuspension erst eine Stunde nach der Zugabe der Solutase eingeführt wird. Trotzdem wird das isolierte Protein in ähnlicher Weise löslichgemacht und hydrolysiert. ■

BEISPIEL 5 .

In einem Erlenmeyer-Kolben werden in 200 ml Wasser 6 Gramm isoliertes Sojabohnenprotein suspendiert. Zu dieser Suspension werden 0,1 Gramm der Solutase-Mischung (300 S.E./Gramm) von Beispiel 1 und 0,1 Gramm der Hydrolase-Mischung (10 H.E./ Gramm) von Beispiel 2 zugegeben. Diese Suspension wird dann bei 40° 16 Stunden bei einem pH von 6,2 aufbewahrt und mit 275 rpm bewegt. Danach wird sie durch ein "Whatman No. 42" Filtrierpapier filtriert. Zu 50 Gramm des erhaltenen Filtrates werden 10 Gramm Saccharose und 0,1 Gramm Lebensmittelfarbe zugegeben. Nach dem Mischen entsteht ein sehr näh haftes und gutschmeckendes Getränk. Eine andere 50 Gramm Probe des Filtrates wird in gleicher Weise mit Saccharose und Lebensmittelfarbe kombiniert. Zusätzlich wird diese Mischung aber mit Kohlendioxid behandelt, so dass ein gut schmeckendes, nahrhaftes und kohlensäurehaltiges Getränk entsteht.

Ein löslichgemachtes und hydrolysiertes Protein, wie es vorstehend für die Herstellung von nahrhaften und alkoholfreien Getränken erläutert wurde, kann in ähnlicher Weise für die Verstärkung folgender Produkte verwendet werden:

1. saure Zitrussäfte

2. Getreideprodukte für Frühstücksgerichte

3. Säuglingsnährmittel

4. Suppen

5. Biergetränke

6. Diätlebensmittel

7. Brot j Makkaroni und Nudeln-.'

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bad omoimeofHu' am

BEISPIEL 6

In einem Erlenmeyer-Kolben werden in 200 ml Wasser ^O Gramm isoliertes Sojaprotein suspendiert. Zu dieser Suspension werder; 10,0 mg der Solutase Enzymzubereitung von Beispiel 1 gegeben. Diese Suspension wird dann bei 40⁰C für 30 Minuten bei einem pH von 7,8 aufbewahrt und mit 275 rpm bewegt. Dann wird sie durch ein "Whatman No. 42" Filtrierpapier filtriert. Zu 50 Gramm des erhaltenen Filtrates werden 10 Gramm Saccharose und 0,1 Gramm Lebensmittelfarbe zugegeben. Diese Mischung wird dann geschlagen, wobei ein sehr nahrhaftes und gut schmeckendes Deckschichtenmaterial für Lebensmittelprodukte entsteht.

BEISPIEL 7 ,

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wird Solutase unter Verwendung von Bacillus mycoidus als Microorganism hergestellt. Es wird eine Mischung mit einer Aktivität von 250 S.E. pro Gramm hergestellt, in der 10 Gramm der Enzymzubere?turn- mit 30 Gramm Lactose kombiniert werden.·-

BEISPIEL 8

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 2 wird Hydrolase unter Verwendung von Aspegillus niger als Mikroorganism hergestellt. Die so erhaltene Enzymzubereitung wird mit Lactose im Verhältnis von 1 zu 5 kombiniert, wobei eine Mischung mit einer Aktivität von 20 H.E. pro Gramm entsteht .

BEISPIEL 9

10 Gramm eines isolierten Proteinkonzentrates aus Fisch wird in 100 ml Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension werden 0,1 Gramm der Solutase Enzymzubereitung von Beispiel 1 zugegeben. Diese Suspension wird dann bei 40⁰C unter leichter Bewegung 30 Minuten aufbewahrt. Dieses führt zu einer Lösung von löslichgemachtem Fischprotein. Zu 20 ml dieser Lösung des löslichgemachten Proteins werden 0,05 Gramm der Hydrolase Enzymzubereitung von Beispiel 2 zugegeben. Diese Mischung wird 20 Stunden bei 40°C unter Bewegen aufbewahrt. Beim Ende dieses Zeitraums zeigt die Prüfung, dass das Fischprotein hydrolysiert worden ist.

In ähnlicher Weise wird eine andere 10 Gramm Probe von isoliertem Fischprotein löslichgemacht und hydrolysiert, indem man sie mit 300 mg der SolutaseiBitchung von Beispfel 7 und 250 rag der Hydrolases!schling von Beispiel 8 behandelt.

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Claims

(a) eine En»y«zübereitung, die sich von einem Bakterienorganisaus ableitet und in. der Lage ist, einen isolierten Eiweißstoff in Wasser in dem Ausmaß dispergierbar ru machen, dass ein kolloidales System entsteht, und

(b) eine Enzymzuber*itung, die sich von einem Pilzorganismus ableitet und in der Lage ist, einen löslichgemachten Eiweißstoff im dem Ausmaß zu verändern, dass er aus seiner wässrigen Lösung nicht ausfällt.
2. Enzymmischung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Bakterienorganismus ein Bacillus ist.
3. Enzymmischung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass dieser Bacillus ein Bacillus subtil is ist.
4. Enzymzubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,, das der Pilzorganismus ein Aspergillus ist.
5. Enzymzubereitung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Aspergillus ein Aspergillus ηiger oder ein Aspergillus oryzae ist.
6. Enzymmischung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung eine Solutase-Aktivität von mindestens 1 S.E. pro Gramm hat.
7. Enzyromischung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung eine Hydrolase-Aktivität von mindestens 1 H.E. pro Gramm hat. *
8. Enzymzubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung eine Solutase-Aktivität von mindestens

1 bis 1000 S.E. pro Gramm hat.
9. Enzymmischung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung eine Solutase-Aktivität von 250 bis 650 S.E. pro Gramm hat.
10. Enzymzubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung eine Hydrolase-Aktivität von 0,1 bis. 500 H.E. pro Gramm hat.

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BAD
11. Enzymmischung nach Anspruch 10_P 'dadurch gefe dass die Mischung eine Kydr©läse»Aktivität von 100 H.E. pro Graun hat.
12. Enzymmischung nach Anspruch 1, dadurch.gekennzeichnet dass die Mischung eine Solutase-AktivitMt von 1 bis S.E. pro Gramm und eine Hydrolase-Aktivitat von 0,1 bis 500 H.E. pro Gramm hat.
13. Enzymmischung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, - dass die Mischung eine Solutase-Aktivität von 250 bis 650 S.E. pro Gramm und eine Hydrolase-Aktivltät von 10 bis 100 H.E. pro Gramm hat.
14. Enzymraischung nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung einen Träger enthält und dass die Enzymzubereitungen 1 bis 99 Gew.-X der Gesamtmischung ausmachen.
15. Enzymzubereitung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzymzubereitungen 5 bis 25 Gew.T der Gesamt--

^raXschung ausmachen.

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BADORIQINAt.