DE19650991A1 - Neue Proteine Y, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Neue Proteine Y, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

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Ruediger Dr Schade
Andreas Dr Hlinak
Wolf Dr Buerger
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci

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Description

Die Erfindung betrifft neue Proteine Y, Verfahren zur Herstellung einer Protein A/G adäquaten Chromatographiematrix und die Verwendung der Proteine Y, wobei die Protein A/G adäquate Chromatographiematrix es ermöglicht, Dotterantikörper (IgY) affinitäts­ chromatogaphisch zu reinigen.
Im letzten Jahrzehnt haben die Bemühungen stark zugenommen, Antikörper (Ak) aus Vogeleiern zu gewinnen und medizinischen Zwecken nutzbar zu machen. Im Unterschied zu anderen Verfahren handelt es sich bei einer solcherart vorgenommenen Antikörper Anreicherung und -Gewinnung um eine unblutige Methode, da die Blutentnahme für die Ak- Gewinnung entfallen kann (Schade, R. und A. Hlinak: Mh. Vet.-Med. 48 (1993) 91-98, Gustav Fischer Verlag Jena). Bereits seit Ende des vorigen Jahrhunderts ist bekannt, daß im Dotter des Hühnereis beträchtliche Mengen an Antikörpern (Ak) akkumuliert werden können (Klemperer F.: Arch. exptl. Pathol. Pharmakol. 31(1893) 356-382).
Die bekannten Verfahren bestehen darin, Hühner mit einem Antigen zu immunisieren und aus den Eiern/dem Eidotter die Antikörper (IgY - Yolk antibodies) zu gewinnen (US = USA- Patent, GB = Großbritannien-Patent, DD = DDR-Anmeldung, DE = Deutsche Offenlegungsschrift/Patentschrift, EP = European Patent, JP = Japanisches Patent, WO = PCT (Patent Cooperation Treaty)-Anmeldung):
Immunologisch reaktive Präparate (Eidotter-Antikörper/Polson, A.: DE 29 51 412), Egg Yolk Antibodies (Polson, A.: GB 2057451, US 4357272), Fowl Egg Antibodies (Polson, A.: US 4550019), Specific Chicken Egg Antibodies (Tsuda, K. et al.: EP 503293), Specific antibody containing substance from eggs (Tokoro, H.: US 5080895, EP 225254), Controlling viral disease in salmon 1 trout using specific antibody-bearing egg (Horiuchi, M.: JP 6-65101), Antibodiy for prevention of caries, Rengoukai, K.: JP 4-273828, vgl. auch Ota, M.: JP 3-115213), Bovine mastitis preventive and treating antibody-containing material, Kodama, Y.: JP 3-56426), gegen virale Diarrhoe (Rotavirus) gerichtete Ak, (Yamamoto, T.: JP 2-53737, Hatta, H.: JP 1-265034), gegen Acne (Hatta, H.: JP 1-313439) oder Influenza- Virus-Antigene gerichtete Ak (Tsubokura, M.: JP 62-201575).
Die Reinigung von Dotterantikörpern stellt nach wie vor ein in erster Linie psychologisches Problem dar. Es existiert eine Vielzahl verschiedener Extraktionsmethoden (klassische Präzipitationsmethoden bis chromatographische Reinigungen), so daß die Auswahl einer für einen potentiellen Anwender geeigneten Methode problematisch wird.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Proteine Y und Verfahren zu ihrer Herstellung zur Verfügung zu stellen. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß die Produktion eines Protein A/G adäquaten Proteins (Protein Y) für Affinitätschromatogaphie kombiniert wird mit einer Matrix, die eine schnellere Reinigung bei höheren Drücken erlaubt. Solch eine Matrix stellt z. B. POROS (Boehringer Mannheim) dar. Die neuen IgY-bindenden Proteine - Proteine Y - bakterieller Herkunft werden durch Kultivierung von Streptoccocus suis mit nachfolgender affinitätschromatischer Reinigung des Kulturüberstandes an Sepharose, gekoppelt mit IgY, gewonnen. Dieses Kopplungsprodukt aus Sepharose und IgY - IgY/Sepharose - ist neu. Die auf diesem Wege erhaltenen Proteine werden ihrerseits zur affinitätschromatographischen Reinigung aviärer Antikörper eingesetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß eine neue mit einer bekannten Technik verknüpft werden. Dadurch gelingt es überraschenderweise, IgY mittels Protein A oder G- Proteine bakterieller Herkunft, die Immunglobuline von Säugern am Fc-Teil binden - zu reinigen. Das war bisher nicht möglich - was als Makel der bekannten Methode empfunden wurde. Die erfindungsgemäße Lösung dagegen erlaubt eine adäquate Reinigung auch für IgY. Damit wird ein erheblicher Impetus für die Akzeptanz der IgY-Technologie und gleichzeitig ein weiteres Applikationsfeld für die Poros-Chromatographie geliefert.
Ein wesentlicher Schritt besteht in der Präparation des IgY-bindenden Proteins aus Streptococcus suis. In weiteren Schritten wird das Präzipitat des Bakterienüberstandes dialysiert und dann affinitätschromatographisch bearbeitet.
Die erfindungsgemäße Methode unterscheidet sich von der ursprünglichen Beschreibung (B. Serhir et al. 1995, J.Bacteriol. 177, 3830-3836) durch Modifizierungen in der Bakterienanzucht sowie durch den generellen Unterschied - und dadurch als eigenartiges Verfahren - daß das bakterielle Proteingemisch (Präzipitat) nicht mittels Säugerimmunglobulin (Schwein), sondern durch ein aviäres Ig (IgY) getrennt wird. Aufgrund struktureller Unterschiede im Fc-Teil zwischen aviären und mammären Ig unterscheidet sich das Endprodukt (Protein Y) von den bekannten Ig-bindenden Protein deutlich.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Ausführungsbeispiel
Wesentlicher Schritt ist die Präparation des IgY-bindenden Proteins aus Streptococcus suis. Der Stamm wird nach üblichen Verfahren auf Agaroseplatten ausgestrichen, vereinzelt und in Tryptone Soya Broth in CO2-Atmosphäre angezüchtet. Bei einer optischen Dichte von 0,25 (620 nm) werden die Bakterien abgetrennt und der Überstand mit gesättigter Aminoniumsulfatlösung gefällt. Das Präzipitat wird gegen TBS (Tris buffered saline) dialysiert. In einem weiteren Schritt wird das Präzipitat affinitätschromatographisch bearbeitet. Hierzu wird IgY an ECH-Sepharose (Pharmacia) gekoppelt (ECH: Epoxy Coupled 6-Amino-Hexanoic acid). Das bakterielle Proteingemisch wird auf die IgY/ECH-Sepharose gegeben. Der gebundene Anteil wird durch pH-Wechsel (Citrat-Puffer als Elutionspuffer) abgelöst und unmittelbar auf einen neutralen pH gebracht. Diese Funktion entspricht dem IgY-bindenden Protein (Protein Y).
Sowohl die Ausgangslösung (Präzipitat) als auch das Protein Y binden IgY. Der Durchlauf tut dies vernachlässigbar. Das Protein hat ein Molekulargewicht zwischen 85 und 90 kDa.

Claims (9)

1. Neue Proteine Y.
2. Proteine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Protein A/G adäquate Proteine darstellen.
3. Proteine nach Anspruch 1 und 2, erhältlich durch Trennung eines bakteriellen Proteingemisches mit Hilfe eines aviären Immunglobulins (IgY).
4. Proteine nach Anspruch 1 bis 3, erhältlich durch die Kultivierung von Streptoccocus suis mit nachfolgender affinitätschromatischer Reinigung des Kulturüberstandes an Sepharose, gekoppelt mit IgY (IgY/Sepharose).
5. IgY/Sepharose nach Anspruch 4, erhältlich durch Kopplung von IgY an Sepharose.
6. IgY/ECH-Separose nach Anspruch 4, 5 und 8, erhältlich durch Kopplung von IgY an ECH- Sepharose.
7. Verfahren zur Herstellung neuer Proteine Y nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein bakterielles Proteingemisch mit Hilfe eines aviären Iminunglobulins (IgY) getrennt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Streptoccocus suis kultiviert, das Präzipitat des Überstandes dialysiert und affinitätschromatographisch an IgY/ECH- Sepharose gebunden und der gebundene Anteil durch pH-Wechsel abgelöst wird.
9. Verwendung der Proteine nach Anspruch 1 bis 4 zur affinitätschromatographischen Reinigung aviärer Antikörper.
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