DE19737453A1 - Aviäre, vitelline, gegen pharmakologisch wirksame Substanzen gerichtete Antikörper - Google Patents

Aviäre, vitelline, gegen pharmakologisch wirksame Substanzen gerichtete Antikörper

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Mattias Dr Fischer
Andreas Dr Hlinak
Lothar Dr Fischer
Peter Dr Henklein
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Description

Die Erfindung betrifft aviäre, vitelline, gegen pharmakologisch wirksame Substanzen gerichtete Antikörper (Dotterantikörper). Die Antikörper - polyklonale Dotter-Antikörper (IgY)) - sind zum qualitativen und quantitativen Nachweis der genannten Antigene in tierischen Lebensmitteln (wie Fleisch, Wurstwaren oder Milch) und/oder in anderen vom Tier stammenden analytisch-diagnostisch verwertbaren Materialien (wie Harn, Kotwasser oder Serum) auf der Basis von Antigen-Antikörper-Reaktionen geeignet.
In den letzten zehn Jahren haben die Bemühungen stark zugenommen, Antikörper aus Vogeleiern, speziell aus Hühnereiern, zu gewinnen und sie zu biomedizinischen und analytischen Zwecken zu nutzen. Im Unterschied zu anderen Verfahren der Gewinnung von Antikörpern handelt es sich bei einer solcherart vorgenommenen Antikörperinduktion und -präparation um eine unblutige Methode, da die Blutentnahme für die Antikörpergewinnung entfallen kann (Schade, R. und Hlinak, A: Mh. Vet. Med. 48 (1993) 91-98). Bereits seit Ende des vorigen Jahrhunderts ist bekannt, daß im Dotter des Hühnereies beträchtliche Mengen spezifischer Antikörper akkumuliert werden können (Klemperer, F.: Arch. exptl. Pathol. Pharmakol. 31 (1893) 356-382).
Die bekannten Verfahren bestehen darin, Hühner mit einem Antigen zu immunisieren und aus den Eiern/dem Eidotter die Antikörper (IgY-Yolk antibodies) zu gewinnen: Immunologisch reaktive Präparate (Eidotter-Antikörper/Polson, A.: DE 29 51 412), Egg yolk antibodies (Polson, A.: GB 2057451, US 4357272), Fowl egg antibodies (Polson, A.: US 4550019), Specific chicken egg antibodies (Tsuda, K. et al.: EP 503293), Specific antibody containing substance from eggs (Tokoro, H.: US 5080895, EP 225254), Controlling viral disease in salmon/trout using specific antibody-bearing egg (Horiuchi, M.: JP 6-65101), Antibodies for prevention of caries (Rengoukai, K.: JP 4-273828, vgl. auch Ota, M.: JP 3-115213), Bovine mastitis preventive and treating antibody-containing material (Kodama, Y.: JP 3-56426).
Auch die passive Immunisierung von Säugern unter Verwendung von Antikörpern, die aus Geflügeleiern gewonnen wurden, ist beschrieben worden (Stolle, R. und Beck, L.R.: DE 35 04 221, US 4748018, EP 152270). Demnach werden dem Säuger immunisierende Mengen eines spezifischen Antikörpers verabreicht, der aus dem Eidotter einer Geflügelart gewonnen wurde, die mit dem die Krankheit des Säugers verursachenden Antigen immunisiert worden war.
Es ist bekannt, daß bestimmte Arzneimittel oder ihre Abbauprodukte als Markersubstanzen für Rückstandshöchstmengen gelten. Das trifft z. B. für Tetracycline (Tetracyclin, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin) zu als Summe aus Muttersubstanz und ihrem 4-Epimer (Verordnung EWG Nr. 2377190 des Rates, VO-EG Nr. 2703194 vom 07.11.1994). Die biologisch inaktiven 4-Epimeren stehen im Gleichgewicht mit den mikrobiologisch aktiven Tetracyclinen und können wieder in die aktiven Muttersubstanzen umgewandelt und damit verfügbar werden. Die Epimeren können bereits im Probenmaterial vorhanden sein oder bei der Aufarbeitung entstehen. Die Epimeren werden im Hemmstofftest nicht miterfaßt (Bergner-Lang, B. und Mikisch, E. 1994: Deutsche Lebensmittel-Rundschau 90 (2) 39-41; Honikel, K.O. und Hambloch, H.Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 1976: 160, 337-346).
Bei der Bestimmung von Sulfonamiden z. B. spielt der N4-Acetyl-Metabolit eine gewisse Rolle, auch wenn er in die Festlegung des Rückstandshöchstwertes nicht einbezogen wurde (Malisch, R., Bourgeois, B., Lippolt, R., 1992, Deutsche Lebensmittel-Rundschau 88 (7) 205-216).
Antikörper gegen unduldsame pharmakologisch wirksame Substanzen, die über Säugetiere induziert werden, stehen nur gegen eine geringe Anzahl relevanter antibiotischer Substanzen zur Verfügung und nur für diese wenigen Antibiotika auch analytisch-diagnostische Verfahren auf der Basis von Antigen-Antikörper- ReaktionenArzneimittel-Carrier-Konjugate, die als Antigene zur Erzeugung von Antikörpern eingesetzt werden, die gegen unduldsame pharmakologisch wirksame Substanzen gerichtet sind, wurden bisher nicht beschrieben.
Es sind Antikörper von Säugetieren gegen einen Teil der oben aufgeführten Antigene bekannt, auch Testsysteme zum Nachweis einiger Antibiotika, in denen Schaf- und/oder Kaninchenantikörper verwendet werden.
Aviäre, vitelline Antikörper gegen pharmakologisch wirksame Substanzen, im besonderen Antibiotika, sind bisher nicht beschrieben worden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, gegen pharmakologisch wirksame Substanzen gerichtete Antikörper zu induzieren und zu präparieren. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß Legehennen mit Derivaten von pharmakologisch wirksamen Substanzen, insbesondere von Antibiotika, mehrfach immunisiert und dadurch die spezifischen Antikörper im Eidotter angereichert wurden. Erfindungsgemäß kommen insbesondere Antikörper zur Anwendung, die gegen Antibiotika gerichtet sind und die in Tieren sowie in tierischen Lebensmitteln ausgeschlossen werden müssen (unduldsam), wenn diese für den menschlichen Verzehr bestimmt sind. Die Antikörper werden je nach Verwendungszweck als Dotterextrakte (Proteinfällung aus der wäßrigen Lösung) oder in hochgereinigter Form (affinitätschromatografische Verfahren) eingesetzt.
Antikörper gegen unduldsame pharmakologisch wirksame Substanzen, insbesondere gegen Antibiotika, die über Säugetiere induziert werden, stehen nur gegen eine geringe Anzahl relevanter antibiotischer Substanzen zur Verfügung und nur für diese wenigen Antibiotika damit auch analytisch-diagnostische Verfahren auf der Basis von Antigen- Antikörper-Reaktionen.
Die erfindungsgemäßen Antikörper gegen pharmakologisch wirksame Substanzen sind neu, sowohl als aviäre Antikörper als auch in ihrer Struktur. Sie unterscheiden sich von den bekannten Antikörpern durch Molekulargewicht, Sedimentationskonstante und isoelektrischen Punkt.
Durch eine Konjugation der Antigene an Proteinstrukturen, insbesondere BSA (Bovine Serum Albumin) und/oder KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), ist es möglich, auch gegen kleine Antigenmoleküle, wie Arzneimittel oder ihre Abbauprodukte, in Hühnern brauchbare Antikörper zu induzieren.
Die Immunisierung von Legehennen mit den oben genannten Antigenen erfolgt intra muskulär (i.m.) oder subkutan (s.c.) unter Verwendung von Adjuvatien; die Immunisierung wird monatlich wiederholt.
Die erfindungsgemäßen aviären vitellinen Antikörper gegen pharmakologisch wirksame Substanzen, z. B. Arzneimittel, wie Antibiotika, bieten den Vorteil, daß sie in großen Mengen vom Huhn produziert und im Eidotter akkumuliert werden. Die gegen die genannten Antigene gerichteten Antikörper sind Dotter-Antikörper (IgY). Diese polyklonalen Antikörper eignen sich zum quantitativen Nachweis der genannten Antigene im Radioimmunoassay, im Enzymimmunoassay und chromatografischen Verfahren sowie zum qualitativen Antigennachweis in der Immunohistochemie auf der Basis von Antigen- Antikörper-Reaktionen.
Die Strukturdifferenzen zwischen aviären und Säuger-IgG werden aus dem phylogenetischen Abstand von Vogel und Säuger erklärt. Sie werden vor allem im Unterschied der Molekulargewichte und der Sedimentationskonstanten - z. B. Huhn IgG 170 000 bzw. 174 000, humanes IgG 150 000 Dalton - sichtbar (Larson, A. und Sjöquist; Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 13 (1990), 4, 199-201).
Die Isolierung der erfindungsgemäßen aviären Antikörper (IgY) erfolgt nach bekannten Verfahren aus wäßrigen Dotterlösungen mit PBS (phosphatgepufferter Kochsalzlösung) oder Aqua dest. als Lösungsmittel und nachfolgender Zentrifugation, Ausfällung der Immunglobuline durch präzipitierende Agentien, wie Polyethylenglycol (PEG); Natrium-, Dextran- oder/und Ammoniumsulfat sowie durch chromatografische Reinigung, wie Gelfiltration oder Ionenaustausch (Schade, R und A. Hlinak, Mh. Vet. Med. 48 (1993) 95 ff.; Fischer et. al., Tierärztl. Praxis (1996), 411-418). Die erfindungsgemäßen aviären, vitellinen, gegen pharmakologisch wirksame Substanzen gerichteten Antikörper lassen sich durch die beschriebenen Verfahren aus den Eidottern der von immunisierten Hühnern gelegten Eier gewinnen.
Die Erfindung ermöglicht es überraschenderweise, mit Hilfe von Arzneimittel-Carrier- Konjugaten, die als Antigene eingesetzt werden, Antikörper gegen unduldsame pharmakologisch wirksame Substanzen, insbesondere gegen Antibiotika, zu induzieren und damit zu analytisch-diagnostische Verfahren auf der Basis von Antigen-Antikörper- Reaktionen zu gelangen. Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß durch eine Konjugation der Antigene an Proteinstrukturen (Carrier) zu Arzneimittel-Carrier-Kon­ jugaten, die als Antigene eingesetzt werden, es möglich ist, auch gegen kleine Antigenmoleküle Antikörper zu induzieren.
Die Erfindung bezieht sich neben den Verfahren zur Herstellung von Antikörpern durch Immunisierung von Legehennen mit pharmakologisch wirksamen Substanzen und nachfolgender Extraktion aus dem Eidotter auch auf die Verwendung aviärer, vitelliner, gegen die genannten Antigene gerichtete Antikörper zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Substanzen, die zur Immunisierung der Hühner verwendet werden, auf der Basis von Antigen-Antikörper-Reaktionen.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Allgemeine Verfahrensweise
Die Immunisierung von Legehennen erfolgt unter Verwendung eines Adjuvans, das zu gleichen Teilen mit dem Antigen - im besonderen einem Antibiotikum, wie Oxytetracyclin, Chloramphenicol oder Peniciline - gekoppelt an BSA oder KLH, vermischt wird. Aus den beiden Substanzen wird eine stabile Emulsion
  • a) im Falle von Freund's komplettem Adjuvans
  • b) unter Verwendung alternativer Adjuvantien hergestellt.
Die Ausgangssubstanzen werden in Mengen von 0,1 bis 0,5 mg pro Tier und Immunisierung eingesetzt. Verabreicht wird das Antigen-Adjuvans-Gemisch i.m. oder s.c. Die Immunisierung wird monatlich wiederholt.
1.1 Eidotter-Antikörperseparierung
Die Eidotter-Antikörperseparierung erfolgt nach dem BATCH-Verfahren bis zur Endreinigung und Extraktion der spezifischen Antikörper (Schade, R. und A. Hlinak; Mh. Vet. Med. 48 (1993); 95 ff).
1.2. IgY-Bestimmung
Die quantitative Bestimmung des Gesamt-Immunglobulingehaltes (IgY) der Dotterpräparation erfolgt mittels ELISA (Fischer und Hlinak, Alternativen zu Tierexperimenten (ALTEX) 13 (1996) 179-183). Die qualitative und quantitative Bestimmung der spezifischen Antikörper gegen die genannten Antigene wird nach Schade und Hlinak (1993) durchgeführt (ibid).
Die quantitative Bestimmung der spezifischen Antikörper erfolgt über Antikörper-Titer- Ermittlungen aus dem Dotterhomogenat mittels indirektem ELISA. Die Bestimmung des Gehaltes spezifischer Antikörper pro Mengeneinheit Dotter wird mit Hilfe der Affinitätschromatografie (aus dem gereinigten und separierten Antikörperextrakt nach Vakuumdialyse) durchgeführt.
1.3. Isolierung der reinen Antikörper
Die Isolierung der reinen Antikörper erfolgt mittels BATCH-Verfahren (Schade und Hlinak, 1993, s. Beispiel 1).
Beispiel 2 Arzneimittel-Carrier-Konjugate
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel-Carrier-Konjugate werden dadurch hergestellt, daß Arzneimittel mit funktionellen Gruppen versehen werden, die eine Bindung an Carrier gestatten.
Durch eine Konjugation der Antigene an Proteinstrukturen, insbesondere BSA (Bovine Serum Album in) und/oder KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), ist es möglich, auch gegen kleine Antigenmoleküle in Hühnern brauchbare Antikörper zu induzieren.

Claims (6)

1. Aviäre, vitelline, gegen pharmakologisch wirksame Substanzen gerichtete Antikörper.
2. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie gegen Antibiotika gerichtet sind.
3. Antikörper nach Anspruch 1 und 2, erhältlich durch Immunisierung von Hühnern mit Arzneimittel-Carrier-Konjugaten und Aufarbeiten der Eidotter der von den derart immunisierten Hühnern gelegten Eier.
4. Antikörper nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die als Antigene eingesetzten Arzneimittel-Carrier-Konjugate aus Kopplungsprodukten von pharmakologisch wirksamen Substanzen an Proteinstrukturen bestehen.
5. Antikörper nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmakologisch wirksamen Substanzen insbesondere Antibiotika und die Proteinstrukturen insbesondere BSA oder KLH darstellen.
6. Antikörper nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie zum qualitativen und quantitativen Nachweis von pharmakologisch wirksamen Substanzen in tierischen Lebensmitteln, wie Fleisch, Wurstwaren oder Milch und/oder in anderen vom Tier stammenden analytisch-diagnostisch verwertbaren Materialien, wie Harn, Kotwasser oder Serum, auf der Basis von Antigen-Antikörper-Reaktionen verwendet werden.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002092136A2 (de) * 2001-05-15 2002-11-21 Sroka, Joachim Immunkonjugate aus eidotter-antikörpern (igy), deren konfektionierung und anwendung in diagnostik und therapie
WO2003033537A1 (en) * 2001-10-17 2003-04-24 Council Of Scientific And Industrial Research Process for the production of egg yolk antibodies against organochlorine pesticides

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