DE19629173A1 - Verseifung von Säurederivaten mit Lithiumhydroxid und Metallverbindung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umsetzung eines Phosphorsäure-, Phosphonsäure- oder Carbonsäurederivates mit Wasser in Gegenwart von Lithiumhydroxid und einer Metallverbindung und insbesondere ein Verfahren zur Verseifung von Carbonsäure-, Phosphonsäure- oder Phosphorsäurederivaten und die Abspaltung von Aminosäure-, Peptid- oder Nukleinsäurederivaten von einem polymeren Träger.

In der Literatur werden bereits verschiedene Verfahren zur Verseifung der genannten Verbindungen beschrieben. Hierbei wird z. B. unter stark sauren oder basischen Bedingungen, mit Enzymen (D. Seebach, Angew. Chem. 1990, 102, 1363), oder mit Ionenaustauscherharzen (W. Pereira, V. Close, W. Patton, B. Halpfern, J. Org. Chem. 1969, 34, 2032) gearbeitet (siehe auch J. March "Advanced Organic Chemistry" Third Edition S. 334 ff. Verlag J. Wiley & Son).

Aus "Aminosäuren, Peptide, Proteine" Verlag Chemie Weinheim 1982, S. 47 ff. ist weiterhin ein Verfahren zur alkalischen Hydrolyse von Peptiden und Proteinen mit Ba(OH)₂ unter hohem Druck bekannt. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die partielle bis vollständige Racemisierung der Aminosäuren.

Aus J. Org. Chem. 38 (1973), 1223-1225 ist die Spaltung von Carbonsäuremethylestern mit DBU bei 165°C über 48 h bekannt. Solche Bedingungen sind für die meisten Esterspaltungen zu drastisch, dies gilt insbesondere für optisch aktive Ester, die in α-Stellung zur Estergruppe ein Chiralitätszentrum besitzen.

Aus EP-A 0 523 461 ist ein Verfahren zur Verseifung von Peptidestern mit Lithiumhydroxid beschrieben. Dieses Verfahren, das bei Raumtemperatur durchgeführt wird, verläuft zwar nahezu racemisierungsfrei, hat aber die Nachteile, daß lange Reaktionszeiten in Kauf genommen werden müssen und daß Nebenprodukte entstehen und in geringer Konzentration gearbeitet werden muß. Ebenfalls in EP-A 0 523 461 ist ein Verfahren zur Verseifung von Säurederivaten mit einer Amidinbase in Gegenwart eines Metallsalzes beschrieben. Dieses Verfahren, das ebenso nahezu racemisierungsfrei verläuft, hat die Nachteile, daß mit einer Amidinbase eine relativ teure Base eingesetzt werden muß, die zudem aufwendig in der Handhabung ist, da sie vor der Verwendung gegebenenfalls mehrmals aufgereinigt werden muß.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher ein System zur Verseifung von Säurederivaten und zur Spaltung von polymergebundenen Moleküle zur Verfügung zu stellen, das so milde Reaktionsbedingungen hat, daß insbesondere optisch aktive und Biomoleküle wie Peptide, Aminosäuren oder Nukleinsäuren eingesetzt werden können und das gleichzeitig die vorgezeigten Nachteile nicht aufweist.

Diese Aufgabe wird gelöst durch den kombinierten Einsatz von Lithiumhydroxid und einer Metallverbindung bei der Verseifung oder Abspaltung polymergebundener Moleküle, wie sie z. B. bei der Merrifield-Synthese vorliegen.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß gegenüber LiOH alleine eine Umsetzung unter Zusatz eines Metallsalzes deutlich schneller abläuft, weniger Nebenprodukte liefert und die Raum/Zeit-Ausbeute deutlich verbessert wird.

So können z. B. empfindliche Peptidester ohne Racemisierung am α-C-Atom der C-terminal positionierten Aminosäure verseift werden. Dabei bleiben eventuell geschützte Seitenkettenfunktionalitäten, die keine Esterfunktion enthalten, unberührt. So war es z. B. möglich ein Heptapeptidester mit Lithiumhydroxid/LiBr in THF/H₂O in kurzen Reaktionszeiten quantitativ und ohne Racemisierung zu verseifen.

Mit Hilfe neuerer Techniken werden heutzutage Peptide und Polynucleotide an Polymer-Trägern synthetisiert (Merrifield-Synthese). Die Verknüpfung mit dem Polymerträger ist dabei meist eine Esterbindung. Die Abspaltung vom Trägermaterial erfordert oft drastische Reaktionsbedingungen und führt in der Regel zum Verlust sämtlicher Schutzgruppen eventuell geschützter Funktionalitäten im Peptid oder Polynucleotid. So werden als gängige Abspaltungsreagentien Trifluoressigsäure/HBr/TMS-trifluormethansulfonat, HF/Anisol, NaOH/Dioxan/H₂O₂ eingesetzt. Gegenüber diesen drastischen Bedingungen eignet sich die Reagentienkombination Lithiumhydroxid/Metallverbindungen, insbesondere Lithiumsalz, ausgezeichnet zur Spaltung der Bindung eines Peptides oder Polynukleotides vom Polymer- Träger. Dabei können bei der Abspaltung zersetzungs- und racemisierungsfrei die entsprechenden freien Säure des Peptides oder Polynukleotides erhalten werden. Die nicht basenlabilen Schutzgruppen eventueller weiterer funktioneller Gruppen im Molekül bleiben dabei unberührt. Dabei eignet sich diese Methode insbesondere zur Freisetzung empfindlicher Moleküle sowie für die Darstellung geschützter Peptidsegmente am Polymer-Träger, die für eine weitere Segmentkupplung zu längeren Peptidketten benötigt werden. Von besonderem Vorteil ist weiterhin, daß auf die empfindlichen, zum Teil gefährlichen Reagentien wie HF, TlOEt o. ä. verzichtet werden kann.

Die Metallverbindung, besonders geeignet sind Lithium- und ferner Magnesium- oder Cäsiumsalze, wird üblicherweise in 0,1-20 molarer Menge eingesetzt. Besonders günstig sind 2-10 molare Mengen der Metallverbindung, jeweils bezogen auf das Säurederivat.

Als Metallverbindungen werden bei den obigen Verfahren Halogenide, insbesondere Bromid oder auch Chlorid, Perchlorat, Acetat, Sulfat oder Carbonat bevorzugt.

Zur Verseifung der Säurederivate, bevorzugt ein Ester wie ein Aminosäureester oder ein Peptidester wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren üblicherweise wie folgt gearbeitet:

Das Säurederivat wird in einem Lösungsmittel, bevorzugt werden Ether wie THF oder Dioxan eingesetzt, gelöst oder suspendiert. Nach Zusatz von Wasser (10-100fach molarer Menge) wird eine 1,0-20 molare Menge, bevorzugt 1,0-2,0 molare Menge an Lithiumhydroxid gegenüber der zu verseifenden Verbindung und eine Metallverbindung, bevorzugt werden Salze des Lithiums, Magnesiums oder Cäsiums in 0,1-20 molarer Menge, insbesondere in 2-10 molarer Menge, zugesetzt und die Reaktionsmischung bei Temperaturen zwischen -30°C und +120°C umgesetzt. Bei racemisierungsempfindlichen Derivaten wird bevorzugt zwischen -20°C und 30°C bei kurzen Reaktionszeiten umgesetzt.

Liegt das Lithiumhydroxid in einem Puffersystem vor bzw. ist eine Hilfsbase zugegen, dann kann die Lithiumverbindung auch schon in 0,1molarer Menge eingesetzt werden. Die entstehende freie Säure wird dann durch die Hilfsbase und das Puffersystem neutralisiert, so daß der alkalische Charakter der Reaktionslösung zur Verseifung erhalten bleibt.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, sind aber nicht auf diese beschränkt.

• 1) Darstellung von Ac-D-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Pal-Ser(^tBu)- Tyr(^tBu)-D-Cit-Leu-OH durch Verseifung des entsprechenden Methylesters
• a) 70.4 g LiBr (810 mmol) werden unter Eiskühlung in 3.9 l THF gelöst, die Lösung zunächst mit 40 ml Wasser und anschließend mit 200 g (162 mmol) feingepulvertem Ac-D- Nal-D-p-Cl-Phe-D-Pal-Ser(^tBu)-Tyr(^tBu)-D-Cit-Leu-OMe versetzt. Man rührt bis zur vollständigen Lösung bei Raumtemperatur, kühlt auf ca. -10°C ab, tropft die Lösung von 3.89 g (162 mmol) LiOH in 120 ml Wasser während ca. 10 min zu und spült den Tropftrichter mit 80 ml Wasser nach. Nach Rühren über nacht bei ca. -10°C wird die Vollständigkeit der Reaktion per HPLC überprüft. Falls noch mehr als 1 Fl.-% Edukt vorhanden sind, gibt man nochmals eine dem Eduktanteil äquivalente Menge LiOH zu rührt so lange bis der Eduktanteil < 1 Fl.-% ist. Die Reaktionsmischung wird mit ca. 162 ml 1n HCl auf einen pH von ca. 5 angesäuert, das THF am Rotationsverdampfer weitgehend entfernt und der Rückstand in ca. 6 l Wasser suspendiert. Man saugt das Produkt ab, wäscht mehrmals gründlich mit Wasser nach und trocknet i. Vak. Ausbeute: 194-196 g (98-99%) farbloses Pulver HPLC: 98-99% Fl.
  Aminosäureanalyse: entsprichtDrehwerte: [α] = -3,8 bis -5,1°, [α] = -29.7 bis -31.4° (c=0.5, DMF)
  ¹H-NMR (500 MHz, DMSO): δ = 0.8 u. 0.86 (jeweils d, zusammen 6H, Isopropyl-H), 1.06 (s, 9H, tert-Butyl-H v. Ser), 1,2 (s, 9H, tert-Butyl-H v. Tyr), 1.15-1.7 (m, 7H, β/γ-H v. D-Cit u. Leu), 1.68 (s, 3H, Acetyl-CH₃), 2.75-3.1 u. 3.32-3.41 (jeweils m, zusammen 12H, β-H v. D-Nal, D-p-Cl-Phe, D-Pal, Ser, Tyr u. δ-H v. D-Cit), 4.23-4.34, 4.52-4.58 u. 4.65-4.7 (jeweils m, zusammen 7H, (α-H), 5.35 (s, 2H, NHCONH₂), 5.85 (t, 1H, NHCONH₂), 6.79 u. 7.11 (jeweils d, zusammen 4H, aromat. H v. Tyr), 7.22-7.85 (mehrere m u. d., zusammen 13H, aromat.-H v. D-p-Cl-Phe, D-Nal u. H an C-4′/C-5′v. D- Pal), 12.5 (s, 1H, COOH)
  C₆₄H₈₃ClN₁₀O₁₂ (1219.83)
• b) Vergleichsbeispiel (nur mit LiOH)
  5 g (4,05 mmol) Ac-D-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Pal-Ser(^tBu)- Tyr(^tBu)-D-Cit-Leu-OMe werden in 180 ml THF/50 ml Methanol suspendiert, nach Abkühlung auf 0°C mit 192 mg (8.1 mmol) LiOH gelöst in 8 ml Wasser versetzt und anschließend 4 Tage bei dieser Temperatur gerührt. Danach ist laut HPLC kein Edukt mehr vorhanden. Die Reaktionsmischung wird mit 1 n HCl auf einen pH von ca. 5 angesäuert, das Lösungsmittel i. Vak. weitgehend entfernt, der Rückstand mit Wasser versetzt, abgesaugt und getrocknet. Ausbeute an Ac-D-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Pal- Ser(^tBu)-Tyr(^tB)-D-C-t-Leu-OH:4.3 g (87%), farbloses Pulver.
  HPLC: ca. 97% Fl.
  Gaschromatographischer Racemattest: keine signifikante Racemisierung bei einer der sieben Aminosäuren feststellbar
  ¹H-NMR (500 MHz, DMSO): entspricht den Angaben bei a)

Claims (10)

1. Verfahren zur Verseifung von Carbonsäure-, Phosphonsäure- oder Phosphorsäurederivaten in wäßrigem Medium mittels Lithiumhydroxid dadurch gekennzeichnet, daß die Verseifung unter Zusatz einer Metallverbindung erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Carbonsäurederivat ein Aminosäureester oder ein Peptidester ist.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Metallverbindung eine Lithium-, Magnesium- oder Cäsiumverbindung eingesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallverbindung in 0,1-20molarer Menge eingesetzt wird.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es bei einer Temperatur im Bereich -30°C bis +120°C durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallverbindung ein Bromid, Chlorid, Perchlorat, Acetat, Sulfat oder Carbonat ist.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kompensation der entstehenden freien Säure eine Hilfsbase mitverwendet oder ein Puffersystem eingesetzt wird.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Verseifung mit mindestens 0,1molarer Menge Lithiumhydroxid als Base ausgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Lithiumhydroxid in 1,0- bis 20molarer Menge, bevorzugt 1,0-2,0molarer Menge eingesetzt wird.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat ein/e über einen Ester an ein Polymer gebundene/s Peptid, Aminosäure oder Nukleinsäure ist.