DE19601052A1 - Standardisierte, primäre Osteoblastenzellkulturen aus osteoporotischen Patienten und deren Verwendung zur Osteoporosediagnose und zur Testung potentieller Osteoporose-Therapeutika - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Osteoblastenzellkulturen aus diffentialdiagnostisch untersuchten Probanden mit Verdacht auf Osteoporose und deren Verwendung zur Osteoporosediagnostik sowie zur Testung potentieller Osteoporose-Therapeutika.

Osteoporose (Knochenschwund) ist eine schwere systemische Erkrankung des Skeletts, die sich durch mosaikartig auftretende verringerte Knochendichte (Masse) und mikroarchitektonische Veränderungen im Knochengewebe auszeichnet. Das Knochengewebe eines gesunden erwachsenen Menschen wird auch nach Beendigung seiner Entwicklung ständig weiter auf- und abgebaut. Die zwei entgegengesetzten Prozesse befinden sich normalerweise im Gleichgewicht. Überwiegt jedoch die Abbauphase (Knochenresorption) kommt es zunächst zum Knochenschwund - der Osteoporose -, einer verminderten Knochenfestigkeit. Die Erkrankung geht einher mit meist lebenslangen Schmerzen, gehäuften Frakturen, die begleitende Komplikationen bis hin zu tödlichen Verläufen nach sich ziehen können. Es wird geschätzt, daß weltweit über 200 Millionen, in der Bundesrepublik 7-8 Millionen, Menschen an dieser Krankheit leiden.

Die zur Zeit eingesetzten Therapeutika gegen Osteoporose, wie Östrogene, Progesterone, Calcitonin, Di/Bisphosphonate und Calcium wirken als Anti-Bone- Resorbers. Diese sind wenig wirksam, da sie den Knochenschwund nur verlangsamen oder verringern. Hiermit gelingt es nicht, die bereits verlorene Knochensubstanz zu ersetzen. Im Falle von bisher eingesetzten Bisphosphonaten kann es nach ca. 3 Jahren zur Bildung eines neuen Gleichgewichts zwischen Knochenauf- und Abbau kommen, wonach das Medikament unwirksam wird. Außerdem wurden bei einigen dieser Substanzen schwere Nebenwirkungen beobachtet, wie z. B. ein großes Risiko an Brustkrebs zu erkranken.

Die Wirkung folgender Faktoren auf das Knochenwachstum wird zur Zeit untersucht:
Parathyroidhormon (PTH) und seine Derivate, Vitamin D3, anabole Steroide, Fluoride, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren I und II, Prostaglandine und Wachstumshormon (GH). Die bisher veröffentlichten Ergebnisse der klinischen Studien sind bei weitem nicht zufriedenstellend, da bei den meisten Faktoren der Zuwachs an Knochendichte nur 1 bis 3% pro 1-3 Jahre beträgt (klinische Symptome der Osteoporose zeigen sich häufig erst nach dem Verlust von 50% der Knochenmasse) und die Frakturraten häufig nicht verringert werden.

Um also einem massiven Fortschreiten der Krankheit rechtzeitig entgegenwirken zu können, spielt die Früherkennung der Osteoporose sowie die Osteoporosediagnose überhaupt eine wichtige Rolle.

Die zur Zeit eingesetzten diagnostischen physikalischen Methoden wie single photon absorptiometry (SPA) single- und dual X-ray absorptiometry (SXA; DXA) und quantitative computed tomographie (QCT) sind teuer, sie stehen nur in größeren klinischen Zentren zur Verfügung und sind äußerst schwierig zu interpretieren. Die Ultraschalluntersuchungen sowie X-ray photodensitometry sind kostengünstige Methoden, jedoch mit ähnlichen Nachteilen behaftet.

Die zur Zeit eingesetzten klassischen biochemischen Methoden zur Osteoporose-Diagnostik basieren auf der Bestimmung des Hydroxyprolins im Urin, der Calciumexkretion, der Alkalischen Phosphatase und des Osteocalcins im Serum. Die Bestimmung dieser Parameter im Serum ist unspezifisch, da die gemessenen Werte hoch variabel sind.

Die neuen Methoden zur Schätzung der Knochenresorption, wie die Messung des Deoxypyridinolins im Urin, bzw. die Methoden zur Bestimmung der Knochenbildung, wie die Messung der knochenspezifischen Alkalischen Phosphatase und der Prokollagen-Peptide im Serum, sollten mehr Informationen geben.

Alle erwähnten Methoden haben jedoch den Nachteil, daß sie "signifikante" Ergebnisse erst dann aufweisen, wenn schon ein Teil der Knochenmasse verlorengegangen ist.

Sie erlauben vor allem keine Aussagen zu einem Osteoporosetrend (Früherkennung) und bei bereits vorhandener Erkrankung zum weiteren Verlauf oder zum Eintreten des Stillstandes der Erkrankung.

Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein kostengünstiges und für den Fachmann einfach handhabbares Verfahren zur Osteoporosediagnose zu entwickeln, daß diese Aussagen ermöglicht, sichere Ergebnisse zum Stand der Erkrankung bzw. zum Therapieerfolg durch zweifelsfrei interpretierbare und reproduzierbare Parameter liefert.

Die Aufgabe der Erfindung wird durch erstmalige Etablierung von standardisierten Osteoblastenzell­ kulturen aus osteoporotischen Patienten gemäß Anspruch 1 gelöst, die zur Osteoporosediagnose hervorragend eingesetzt werden können. Überraschenderweise sind diese Zellkulturen auch zur Testung potentieller Osteoporose-Therapeutika sehr gut geeignet. Die Knochenzellkulturen werden hergestellt, indem man aus transiliakalen Knochenbiopsien osteoporotischer Probanden die Osteoblasten-Vorläufer­ zellen durch sequenziellen enzymatischen Verdau gewinnt, diese kultiviert und als standardisierte Zellkulturen (gleiche Zellpopulation) etabliert.

Die osteologischen Knochenbiopsien werden aus klinisch charakterisierten Patienten vorzugsweise aus dem Beckenkamm oder auch aus anderen Knochen entnommen (Knochenstanzen). Die ca. 1-2 cm langen und 3-5 mm dicken Knochenbiopsien werden mechanisch von eventuell vorhandenem Fett- und Bindegewebe getrennt, in mehrere Stücke aufgeteilt, mehrmals enzymatisch (vorzugsweise mit Collagenase) behandelt und die isolierten Osteoblasten-Vorläuferzellen als Monolayer kultiviert. Parallel dazu können dreidimensionale Zellkulturen auf denaturierten Kollagen Typ 1-Schwämmchen angelegt werden. Daraus entstehen standardisierte Knochenzellkulturen. Die primären Knochenzellen, die aus nicht-osteoporotischen Patienten gleichen Geschlechts und etwa gleichen Alters gewonnen werden, dienen als Kontrolle.

Das Zellkulturmedium besteht aus α-MEM-Medium und HAM- F12-Medium (von Gibco) und enthält gegebenenfalls einen Serumzusatz. Das Verhältnis aus α-MEM-Medium und HAM- F12-Medium beträgt vorzugsweise 1 : 2, aber auch Verhältnisse zwischen 3 : 1 bis 1 : 3 führen zum gewünschten Ergebnis. Als Serumzusatz, der zwischen 1- 12% betragen kann, dient fetales Kälberserum, humanes Serum, bovines Serumalbumin oder Ultroser. Bevorzugt werden 2-7% Ultroser, besonders bevorzugt 2-5% Ultroser, eingesetzt.

Erfindungsgemäß ist es durch die Wahl der beschriebenen Zellkulturbedingungen gelungen, die standardisierten Osteoblastenzellkulturen osteoporotischer Patienten über Monate bis zu 2 Jahren lebensfähig zu halten.

Die aus erfindungsgemäßen primären Osteoblastenzellkulturen gewonnenen Zellextrakte wurden mittels hochauflösender 2D-Gelelektrophorese und Silver-Staining untersucht und mit den aus Osteoblastenzellkulturen nicht-osteoporotischer Patienten gewonnenen Zellextrakten verglichen.

Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Zellkulturen osteoporotischer Patienten im hochaufgelösten 2D-SDS-PAGE-Gel ein typisches, reproduzierbares Expressionsmuster von ca. 700 intrazellulären Proteinen gemäß der Spotverteilung in Abb. 1 zeigen.

Dieses Proteinexpressionsmuster ist mit dem Protein­ expressionsmuster aus Osteoblastenzellkulturen nicht­ osteoporotischer Patienten identisch (vgl. Abb. 2). Beim Vergleich der Intensitäten der einzelnen Spots in Abb. 1 und in Abb. 2 zeigten sich jedoch reproduzierbare und quantitativ meßbare Unterschiede in mindestens sechs Spots (vgl. Kennzeichnung durch Pfeile in Abb. 1 und Abb. 2). Dabei ist eine erniedrigte Expression von fünf Proteinen und eine erhöhte Expression von einem Protein in den erfindungsgemäßen Osteoblastenzellkultu­ ren gegenüber den Osteoblastenzellkulturen nicht­ osteoporotischer Patienten festzustellen. Über die Intensitäten der Spots ist damit eine ergänzende Aussage über das Vorliegen einer Osteoporose möglich.

Die erfindungsgemäß gewonnenen Proteinexpressionsmuster der Osteoblastenzellkulturen wurden auch mit denen von humanen Fibrosarkomen und humanen Osteosarkomen verglichen. Es zeigte sich, daß sich die Proteinexpressionsmuster der Fibrosarkome und Osteosarkome von dem Expressionsmuster der Osteoblasten unterscheiden. Dadurch wurde deutlich, daß es sich bei den erfindungsgemäßen Osteoblastenzellkulturen um Reinkulturen handelt, die nicht durch andere Zellarten verunreinigt sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Osteoporosediagnose basiert auf der Untersuchung der frühen Differenzierungsphase der Osteoblasten und/oder der Biosynthese und Reifung der extrazellulären Matrix und/oder auf der Untersuchung der späten Differenzierungsphase der Osteoblasten.

Zur Untersuchung der frühen Differenzierungsphase der Osteoblasten wird die Zellproliferationsrate in parallelen Kulturen nach 48-196 Stunden Inkubation, vorzugsweise nach 72 Stunden Inkubation, gemessen. Die Messung erfolgt mit üblichen Zellproliferationsassays, z. B. durch Einbau einer radioaktiv-markierten Substanz wie [³H]-Thymidin in die DNA. Auch der von der Fa. Boehringer Mannheim GmbH entwickelte Assay zum Einbau von Bromdesoxyuridin ist zur Bestimmung geeignet. Es zeigte sich, daß eine 4-6fach verringerte Zellproliferationskapazität auf einen osteoporotischen Patienten hinweist (s. Abb. 3).

Daneben ist die temporäre Expression der drei Onkogene c-fos, c-myc und c-jun spezifisch für die frühe Differenzierung von Osteoblasten. Die Onkogenexpression wird nach der gleichen Inkubationszeit mittels immunhistochemischer Färbung ihrer Proteinprodukte und Spektralphotometrie in den Monolayer-Zellkulturen quantitativ bestimmt.

Zur Untersuchung der frühen Differenzierungsphase der Osteoblasten kann zusätzlich die Quantifizierung der steady-state-level von jeweils spezifischer mRNA durch quantitative PCR und eventuell Northern blot-Analyse (falls die Zellzahl es erlaubt) durchgeführt werden.

Die Zellproliferationsrate und das Onkogen- Expressionsmuster in den osteoporotischen und nicht­ osteoporotischen Zellen werden verglichen und eine Aussage zum Vorliegen von Osteoporose kann getroffen werden.

Zusätzlich werden Biosynthese und Reifung der extrazellulären Matrix, die durch osteoporotische und nicht-osteoporotsche Zellen produziert wird, untersucht und verglichen. Hierbei werden nach 3 bis 14 Tagen Inkubationszeit, vorzugsweise nach 3 und 7 Tagen, mindestens die intrazelluläre alkalische Phosphatase, Kollagen Typ I und Typ IV, Chondroitinsulfat und Hyaluronsäure mittels immunhistochemischer Färbung ihrer Proteinprodukte und Spektralphotometrie quantitativ bestimmt. Es zeigte sich, daß Osteoblasten aus osteoporotischen Patienten 4-5mal mehr alkalische Phosphatase exprimieren als Osteoblasten gesunder Patienten (s. Abb. 4). Membrangebundenes Chondroitinsulfat wird von Osteoblasten aus osteoporotischen Patienten ebenfalls stärker exprimiert.

Die erfindungsgemäße Bestimmung der Expression der alkalischen Phosphatase in Osteoblastenzellkulturen osteoporotischer und nicht-osteoporotischer Patienten erlaubt es, nicht nur Aussagen zu einer bereits manifesten, sondern auch über eine beginnende Osteoporose zu treffen.

Die quantitative Bestimmung von Wachstumsfaktoren wie z. B. TGF β, insbesondere TGF β₂, und Cytokinen, wie z. B. IGF I und IGF II, mittels immunhistochemischer Färbung ihrer Proteinprodukte und Spektralphotometrie dient neben den genannten Parametern der weiteren Untersuchung der Bildung und Reifung der extrazellulären Matrix.

Die Bestimmung der BMP′s (bone morphogenetic proteins) in den osteoblastischen Zellen kann zusätzlich Informationen über den Stand der Erkrankung geben.

Die jeweils spezifische mRNA kann zur Untersuchung der Bildung und Reifung der extrazellulären Matrix ebenfalls zusätzlich durch quantitative PCR und Northern blot bestimmt werden.

Die in den Zellkulturüberstand sekretierte alkalische Phosphatase und Kollagen Typ I und IV können zusätzlich quantifiert werden. Dabei tritt ein verändertes Expressionsmuster einiger Faktoren auf dem Proteinniveau auf.

Zur Untersuchung der späten Differenzierungsphase der Osteoblasten (dem Mineralisationsprozeß) werden den parallelen Knochenzellkulturen mineralisierungsfördernde Reagenzien zugesetzt und die intrazelluläre Synthese von Osteocalcin quantitativ bestimmt. Diese Bestimmung erfolgt vorzugsweise mittels immunohistochemischer Färbung und Spektralphotometrie, alternativ kann die Bestimmung mittels eines Luminiszenz-Immunoassays von der B.R.A.H.M.S/Berlin durchgeführt werden.

Durch spezifische Färbung wird neu synthetisierte Mineralmatrix und die Bildung der Mineralisierungsknoten nachgewiesen.

Der Nachweis Osteocalcin-spezifischer-mRNA kann zusätzlich durchgeführt werden und erfolgt mittels quantitativer PCR.

Überraschenderweise zeigte sich, daß die erfindungsgemäßen Zellkulturen auch hervorragend zur Testung potentieller Osteoporose-Therapeutika geeignet sind und damit ein in vitro-Testsystem zur Verfügung steht, mit dem die direkte Wirkung von potentiellen Therapeutika auf menschliche Osteoblasten- Vorläuferzellen untersucht werden kann.

Es zeigte sich, daß auch die mitogene Wirkung potentieller Osteoporose-Therapeutika durch Messung der Zellproliferationsrate mit den beschriebenen üblichen Methoden bestimmbar ist.

Die Wirkung potentieller Osteoporose-Therapeutika auf die Differenzierung der "osteoporotischen" Osteoblasten-Vorläuferzellen kann ebenfalls durch die Messung der für die Osteoporose-Diagnose oben beschriebenen Parameter bestimmt werden.

Ebenso kann der Einfluß potentieller Osteoporose- Therapeutika auf die Regulation der Matrixsynthese über den Nachweis spezifischer mRNA durch quantitative PCR bestimmt werden. Diese Bestimmung erfolgt derart, daß die gesamte RNA aus den Zellen isoliert wird, aus mRNA mittels oligo und/oder random primers und reverser Transkriptase eine cDNA Bank hergestellt wird und die bestimmte Menge jeweils spezifischer cDNA mittels spezifischer Primer-Paare amplifiziert wird. Zur Quantifizierung wird parallel das β-ACTIN Fragment als HOUSE-KEEPING Gen mittels PCR amplifiziert.

Dieser Test ergänzt in hervorragender Weise die z.Z. eingesetzten Tiermodelle zur Untersuchung von Osteoporose-Therapeutika, die nur eingeschränkt dem Krankheitsbild beim Menschen entsprechen können.

Die erfindungsgemäßen, standardisierten primären Osteoblastenzellkulturen osteoporotischer Patienten können durch das beschriebene Verfahren reproduzierbar gewonnen und bis zu zwei Jahren lebensfähig gehalten werden. Sie stellen Reinkulturen dar, die mittels hochauflösender 2D-SDS-Gelelektrophorese eindeutig identifizierbar und von den Osteoblastenzellkulturen nicht-osteoporotischer Patienten unterscheidbar sind.

Nachfolgend soll die Erfindung durch Abbildungen und Ausführungsbeispiele näher erläutert werden, ohne sie darauf einzuschränken.

Abbildungen

Abb. 1: Hochaufgelöstes 2D-SDS-PAGE-Gel standardisier­ ter, primärer Osteoblastenzellkulturen osteopo­ rotischer Patienten
Expressionsmuster der intrazellulären Proteine gemäß Spotverteilung
Pfeile: Intensitätsunterschiede von sechs Proteinen im Vergleich mit Abb. 2

Abb. 2: Hochaufgelöstes 2D-SDS-Page-Gel standardisier­ ter, primärer Osteoblastenzellkulturen nicht­ osteoporotischer Patienten
Expressionsmuster der intrazellulären Proteine gemäß Spotverteilung
Pfeile: Intensitätsunterschiede von sechs Proteinen im Vergleich mit Abb. 1

Abb. 3: Nachweis der verminderten Proliferationsrate von Osteoblastenvorläuferzellen osteoporo­ tischer Patienten (OP-Zellen) im Vergleich zur Proliferationsrate von Osteoblastenvorläufer­ zellen nicht-osteoporotischer Patienten (NOP- Zellen)
x1-x3: Behandlung mit FCS (fetalem Kälberserum) 48 h, 120 h, 192 h
x4-x6: Behandlung mit inaktiviertem humanen Kontrollserum, 48 h, 120 h, 192 h
(vgl. Beispiel 3)

Abb. 4: Nachweis der erhöhten Expression intrazellulä­ rer alkalischer Phosphatase in Osteoblastenvor­ läuferzellen von osteoporotischen Patienten (pOP- und OP-Zellen)
pOP: präklinische Osteoporose , n = 12
OP: Osteoporose, n = 14
NOP: nicht-osteoporotisch, n = 18
10% FCS, 192 h

Abb. 5: Unterschiedliche Dosiswirkungskurven (Stimu­ lierbarkeit) der Proliferation von NOP- und OP- Zellen durch Proteine (Wachstumsfaktoren 1, 2 und 3).
Es wird eine signifikante dosisabhängige mitogene Wirkung des Wachstumsfaktors 1 (TGF β₂) auf osteoblastische Zellen aus Osteoporose-Patienten deutlich.

Ausführungsbeispiele 1. Zellkultivierung

Das Zellkulturmodell basiert auf primären Zellkulturen, die aus Beckenkammbiopsien differenzialdiagnostisch bereits charakterisierter Osteoporose-Patienten gewonnen wurden. Die Beckenkammbiopsien stammten von jeweils 26 osteoporotischen und 18 nicht-osteoporotischen etwa 70jährigen Patientinnen.

Alle Knochenstanzen wurden wie folgt behandelt:

• - Nach vorangegangenem Spülen der Stanze mit PBS und Befreiung von eventuell vorhandenem Fett- und Bindegewebe wurde das Knochenstück fünfmal mit verdünnter Collagenase-Lösung (0,5 mg/ml) von Worthington (CLS 2) jeweils 30 min. bei 37°C behandelt.
  Zur Verdünnung der Collagenase-Lösung wurde im Verhältnis 1 : 2 α-MEM-Medium und HAM-F12-Medium von Gibco ohne Zusatz von Serum verwendet.
• - Jede dabei gewonnene Fraktion wurde in serumhaltigem Medium (Medium wie oben beschrieben) gewaschen und in 3% Ultroser enthaltendem Medium aufgenommen und kultiviert.

2. Zellkulturbedingungen

• - Über den gesamten Zeitraum des Versuches wurden die Zellen in Serum enthaltendem Medium bestehend aus gleichen Teilen α-MEM-Medium und HAM-F12-Medium von Gibco kultiviert, wobei zweimal wöchentlich das Medium gewechselt wurde.
• - Die Zellen der Fraktionen 1 und 2 wurden vermehrt und fortlaufend passagiert.

3. Bestimmung der Zellproliferationsrate

• - 3000 osteoblastische Zellen der Fraktionen 1 bis zur 2. Passage, die aus osteoporotischen Patienten gewonnen wurden (OP-Zellen), je Vertiefung einer 96 well Mikrotiterplatte wurden in Anwesenheit von 10% FCS und von 10% inaktiviertem humanen Kontrollserum in Zellkulturmedium (α-MEM- und HAM′S F12-Medium 1 : 12) für 48 h, 120 h und 192 h inkubiert. Parallel dazu wurden 3000 osteoblastische Zellen nicht­ osteoporotischer Patienten unter gleichen Bedingungen kultiviert. Die Anzahl intakter Zellen wurde mittels Trypan-Blau-Färbung und Auszählen in einer Zählkammer bestimmt.

4. Bestimmung der Zellproliferationsrate unter Einfluß der drei Wachstumsfaktoren 1, 2 und 3 mittels Bromdesoxyuridin-Einbau (BrdU-Einbau)

Wachstumsfaktor 1 = TGF β₂
2 = IGF-BP5
3 = IGF II

• - Für den Proliferationstest wurden die Zellen aus der Fraktion 1 und/oder 2 jeder Knochenstanze bis zur 2. Passage verwendet.
• - Zur Anwendung kamen 3 × 10³ Zellen der ersten und/oder zweiten Passage/well einer 96 well-Platte und 200 µl Medium.
• - Die Zellen wurden drei Tage unter bereits beschriebenen Bedingungen kultiviert und danach für einen Tag in 100 µl 1% BSA (von Boehringer Mannheim) enthaltenem Medium ohne Serum weiterkultiviert.
  Bedingung! Es handelte sich um subkonfluente Zellkulturen in der 96 well-Platte.
• - Danach wurden drei Wachstumsfaktoren 1, 2 und 3 in vier verschiedenen Endkonzentrationen (100, 10, 1 und 0,1 ng/ml 1%igem BSA in Medium) zu den Zellen gegeben.
• - Als Kontrollen dienten Zellen in 10%igem FKS haltigem Medium und in 3 und 5% Ultroser enthaltendem Medium.
• - Von allen Konzentrationen und Kontrollen wurden Tripletts angesetzt.
• - Als Blankkontrollen dienten sechs wells mit Zellen, denen während des Proliferationstestes kein Bromdesoxyuridin dazugegeben wurde.
• - Nach 54stündiger Inkubation mit den Wachstumsfaktoren begann der Proliferationstest (5- Bromo-2′-desoxy-uridine Labeling and Detection Kit III von Boehringer Mannheim) mit der Zugabe von 20 µl 1 : 90 in 1%igem BSA-Medium verdünnter Labeling- Solution und anschließender Inkubation für 18 Stunden.
• - Der Proliferationstest erfolgte nach Vorschrift des Herstellers.
• - Die Auswertung des Proliferationstestes erfolgte durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 405 nm im ELISA-Reader. Die Extinktion wurde nach 20 min Farbentwicklung alle 5 min. 12malig gemessen.
  Die erhaltenen Werte sind aus Tabelle 1 ersichtlich.
  In Abb. 5 wurden die gemessenen Extinktionen der drei Wachstumsfaktoren in Abhängigkeit von der Konzentration dargestellt.

5. Durchführung der hochauflösenden 2D-SDS- Gelelektrophorese (IEF-SDS-PAGE)

Die 2D-SDS-Gelektrophorese der NOP- und OP-Zellextrakte wurde wie in "Electrophoresis 1994, 15, 685-707, S. 686" beschrieben, durchgeführt.

Erste Dimension: isoelektrische Fokussierung (IEF)
(linke Seite des Gels: saure Proteine mit IP z. B. 4;
rechte Seite des Gels: Proteine mit einem IP von z. B. 8)

Zweite Dimension: SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen
(Proteine mit kleinem Molekulargewicht erscheinen im unteren Bereich, mit großem Molekulargewicht im oberen)

Die Auswertung der Intensitäten der Spots erfolgte mittels Scanning Densitometry und statistisch.

Tabelle 1

Wirkung von TGFβ₂, IGF II und IGF-BP5 auf humane Osteoblasten- Vorläuferzellen

Claims (21)

1. Standardisierte, primäre Osteoblastenzellkulturen, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch sequenziellen enzymatischen Verdau transiliakaler Knochenbiopsien osteoporotischer Patienten und anschließende Kultivierung der so isolierten Osteoblasten-Vorläuferzellen hergestellt sind und im hochaufgelösten zweidimensionalen SDS- PAGE-Gel ein typisches, reproduzierbares Expressionsmuster der intrazellulären Proteine gemäß der Spotverteilung in Abb. 1 zeigen.

2. Osteoblastenzellkulturen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem Zellkulturmedium, das aus α-MEM- Medium und HAM-F12-Medium besteht und gegebenenfalls einen Serumzusatz enthält, kultiviert sind.

3. Osteoblastenzellkulturen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem Zellkulturmedium, das 1-12% eines Serumzusatzes enthält und dessen Verhältnis von α-MEM-Medium zu HAM-F12-Medium zwischen 3 : 1 bis 1 : 3 beträgt, kultiviert sind.

4. Osteoblastenzellkulturen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Proteinexpressionsmuster gemäß Anspruch 1 mit dem Proteinexpressionsmuster aus Osteoblasten­ zellkulturen nicht-osteoporotischer Patienten identisch ist, jedoch die Intensitäten von mindestens sechs Spots unterschiedlich sind.

5. Verwendung von Osteoblastenzellkulturen nach Anspruch 1 zur Osteoporosediagnose, indem man in den etablierten, standardisierten Zellkulturen die frühe Differenzierungsphase der Osteoblasten und/oder die Biosynthese und Reifung der extrazellulären Matrix und/oder die späte Differenzierungsphase der Osteoblasten untersucht und diese Untersuchungsergebnisse mit denen aus primären Knochenzellen nicht-osteoporotischer Probanden gleichen Geschlechts und etwa gleichen Alters vergleicht.

6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Untersuchung der frühen Differenzierungsphase der Osteoblasten die Zellproliferationsrate mißt und die temporäre Expression der drei Onkogene c-myc, c-fos und c-jun bestimmt.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellproliferationsrate nach 48-196 Stunden Inkubation, vorzugsweise nach 72 Stunden, mit üblichen Methoden gemessen wird.

8. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Onkogenexpression nach 48-196 Stunden Inkubation, vorzugsweise nach 72 Stunden, mittels immunhistochemischer Färbung ihrer Proteinprodukte und Spektralphotometrie quantitativ bestimmt.

9. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Untersuchung der frühen Differenzierungsphase der Osteoblasten zusätzlich die jeweils spezifische mRNA durch quantitative PCR und gegebenenfalls Northern blot-Analyse bestimmt.

10. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Untersuchung der Bildung und Reifung der extrazellulären Matrix nach 3-14 Tagen Inkubation die intrazelluläre alkalische Phosphatase, Kollagen Typ I und IV, die Proteoglykane Chondroitinsulfat und Hyaluronsäure mittels immunohistochemischer Färbung ihrer Proteinprodukte und Spektralphotometrie quantitativ bestimmt.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Wachstumsfaktoren, insbesondere TGF β, und Cytokine, insbesondere IGF I und IGF II, zusätzlich bestimmt.

12. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Untersuchung der extrazellulären Matrix zusätzlich die sekretierte alkalische Phosphatase und sekretiertes Kollagen Typ I und IV bestimmt.

13. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Untersuchung der späten Differenzierungsphase der Osteoblasten (des Mineralisationsprozesses) den Zellkulturen mineralisierungsfördernde Reagenzien zusetzt und die intrazelluläre Synthese von Osteocalcin bestimmt.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Osteocalcin mittels immunhistochemischer Färbung und Spektralphotometrie oder mittels eines Lumineszenz- Immunoassays quantitativ bestimmt wird.

15. Verwendung nach den Ansprüchen 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß neu-synthetisierte Mineralmatrix und die Bildung der Mineralisierungsknoten durch spezifische Färbung nachgewiesen wird.

16. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Untersuchung des Mineralisationsprozesses zusätzlich die osteocalcin-spezifische mRNA durch quantitative PCR nachweist.

17. Verwendung von Osteoblastenzellkulturen nach Anspruch 1 zur Testung potentieller Osteoporose- Therapeutika, indem man die mitogene Wirkung der potentiellen Wirkstoffe und/oder ihre Wirkung auf die Differenzierung der Osteoblasten-Vorläuferzellen bestimmt.

18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die mitogene Wirkung potentieller Osteoporose-Therapeutika durch Messung der Zellproliferationsrate bestimmt wird.

19. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirkung potentieller Osteoporose-Therapeutika auf die Differenzierung der osteoporotischen Osteoblasten-Vorläuferzellen gemäß den Ansprüchen 10-16 bestimmt wird.

20. Verfahren zur Osteoporosediagnose, dadurch gekennzeichnet, daß man in standardisierten, primären Osteoblastenzellkulturen osteoporotischer Patienten gemäß Anspruch 1 die frühe Differenzierungsphase der Osteoblasten und/oder die Biosynthese und Reifung der extrazellulären Matrix und/oder die späte Differenzierungsphase der Osteoblasten untersucht und diese Untersuchungsergebnisse mit denen aus primären Knochenzellen nicht­ osteoporotischer Probanden gleichen Geschlechts und etwa gleichen Alters vergleicht.

21. Verfahren zur Testung potentieller Osteoporose- Therapeutika, dadurch gekennzeichnet, daß man die mitogene Wirkung der potentiellen Wirkstoffe und/oder ihre Wirkung auf die Differenzierung der Osteoblasten-Vorläuferzellen in standardisierten, primären Osteoblastenzellkulturen osteoporotischer Patienten gemäß Anspruch 1 bestimmt.