NO322971B1

NO322971B1 - Fremgangsmate for diagnostisering av osteoporose og testing av potensielle terapeutiske midler mot osteoporose.

Info

Publication number: NO322971B1
Application number: NO19975673A
Authority: NO
Inventors: Olivera Josimovic-Alasevic; Karl-Gerd Fritsch; Jochen Ittner
Original assignee: Co Don Ag
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2006-12-18
Also published as: EP0832195B1; NO975673L; WO1996040873A1; US20020076730A1; US6713269B2; AU733637B2; AU5996196A; NO975673D0; DE59611292D1; ATE309330T1; JPH11506010A; EP0832195A1; CA2223101A1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for diagnostisering av osteoporose der tilstedeværelse av osteoporose bestemmes med ca. 95% sikkerhet, og en fremgangsmåte for utprøving av potensielle terapeutiske midler mot osteoporose der et effektivt terapeutisk middel mot osteoporose bestemmes for hvert enkelt individ.

Osteoporose (benatrofi) er en alvorlig systemisk sykdom i skjelettet, som karakteriseres av nedsatt bentetthet (masse) som fremstår med et mosaikklignende mønster, og mikro-strukturene forandringer i benvevet. Benvevet til en frisk voksen person er gjenstand for kontinuerlig oppbygging og nedbrytning også etter at personen er fullt utviklet. Normalt er disse to prosessene i balanse. I det tilfelle at degrade-ringsfasen tar overhånd (benresorpsjon) vil det første resultatet bli benatrofi (osteoporose), dvs. redusert ben-stabilitet. Sykdommen blir ledsaget for det meste av livslang smerte, oftere benbrudd, som kan bli etterfulgt av komplika-sjoner også med fatalt utfall. Beregninger viser at det globalt sett er ca. 200 millioner mennesker som lider av den ovenfor nevnte sykdom. Bare i tyskland er det 7 til 8 millioner.

Terapeutiske midler som for tiden er i bruk mot osteoporose, slik som østrogener, progesteroner, kalsitonin di/bisfosfater og kalsium, setter kun ned hastigheten eller reduserer benatrofien som et resultat av deres virkning som anti-benresorpsjonsmidler. Det er ikke mulig ved bruk av de ovenfor nevnte medikamenter å erstatte allerede nedbrutt bensubstans.

For tiden undersøkes effektene av de følgende faktorer på benvekst: Paratyreoidhormon (PTH) og derivater av dette, vitamin D3, anabole steroider, fluorider, insulinlignende vekstfaktor I og II, prostaglandiner og veksthormon (GH). Resultater fra kliniske studier publisert frem til nå er langt fra tilfreds-stillende fordi økningen i bentetthet med de fleste faktorer er bare 1-3 % per 1-3 år (kliniske symptomer av osteoporose oppstår først etter at 50% av benmassen er nedbrutt), og som oftest er ikke antall benbrudd redusert. Derfor spiller en tidlig oppdagelse <p>g diagnose av osteoporose en viktig rolle for å motvirke den massive progresjonen av denne sykdom.

De fysiske diagnostiske metodene som brukes i dag, slik som enkel foton absorpsjometri (SPA), enkel og dobbel røntgen absopsjometri (SXA; DXA) og kvantitativ computer-tomograf i (QCT) er kostbare; de er bare tilgjengelige ved store kliniske sentre og er ekstremt vanskelig å fortolke. Ultralydundersøkelser og røntgenfotodensitometri er billige metoder, men involverer de samme ulempene.

De klassiske biokjemiske metodene som i dag brukes ved diagnostisering av osteoporose baseres på bestemmelse av hydroksyprolin i urin, kalsiumekskresjon, alkalisk fosfatase og osteokalsin i serum. Bestemmelsen av disse parameterne i serum er ikke spesifikke fordi de målte verdiene er svært variable. Nye metoder for beregning av benresorpsjon, slik som målinger av deoksypyridinolin i urin, eller metoder for bestemmelse av bendannelse, slik som målinger av ben-spesifikk alkalisk fosfatase og prokollagenpeptider i serum bør gi mer informasjon.

Relevant teknikk er for eksempel beskrevet i Marie et al., 1991, J. Clin. Invest., Vol. 88, pp. 1167-1172, Wong et al., 1994, Osteoporosis Int., Vol. 4, pp. 21-31, Klassem et al., 1994, Calcified Tissue Int., Vol. 54, pp. 1-6, Marie et al., 1989, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol. 69, No. 2, pp. 272-279.

Imidlertid er ulempen ved alle de ovenfor nevnte metodene at de ikke frembringer indikasjoner før deler av ben-substansen allerede er nedbrutt.

Hensikten med den foreliggende oppfinnelse var derfor å skaffe til veie en billigere metode for diagnostisering av osteoporose som er lett å betjene for en fagperson og frembringer en individuell klassifisering med 95 % sikkerhet, i grupper av personer som lider av osteoporose, og som ikke lider av osteoporose, eller klassifisering med hensyn på terapeutisk suksess der fortolkningene er udiskutable og parametrene reproduserbare.

Formålet med oppfinnelsen oppnås ved at det etableres standardiserte osteoblastcellekulturer fra osteoporosepasienter, hvilke er levedyktig i flere måneder og er utmerkede til diagnostisering av osteoporose.

Det ble funnet at osteoblastceller fra osteoporosepasienter viser patologiske forandringer i deres proliferasjon og differensiering sammenlignet med osteoblastceller fra pasienter som ikke har osteoporose. Ved bruk av diskriminerende analyse, vil data som angår proliferasjonshastighet og ekpresjonsintensitet av osteoblast-spesifikke differensie-ringsmarkører peke ut osteoporose- og ikke-osteoporosepasienter med en nøyaktighet på mer enn 95 %, der de personene som lider av osteoporose og de som ikke lider av osteoporose viser svært betydelige forskjeller.

Overraskende viser det seg at disse cellekulturene også egner seg utmerket godt til testing av potensielle terapeutiske midler mot osteoporose, og muliggjør dermed en individuell bestemmelse av effektive terapeutiske midler for hver enkelt pasient.

Bencellekulturene blir fremstilt ved isolering av osteoblastforløperceller fra transiliakale benbiopsier fra forsøkspersoner som har osteoporose, ved sekvensiell enzymatisk spalting, dyrking og etablering av disse cellene som standardiserte cellekulturer (like cellepopulasjoner). Disse benbiopsier blir tatt fra klinisk karakteriserte pasienter, fortrinnsvis fra hoftekammen eller også fra andre ben. Ben-biopsiene er omtrent 1-2 cm lange og 1-5 mm tykke, og skilles mekanisk fra eventuelt tilstedeværende fett og bindevev, deles i flere deler, behandles enzymatisk (fortrinnsvis med kollage-nase) flere ganger, og de isolerte osteoblastforløpercellene blir dyrket som et monolag. Parallelt med dette kan det etableres tredimensjonale cellekulturer på denaturert kollagen type 1 underlag, der standardiserte bencellekulturer produ-seres. Primære benceller fra pasienter av samme kjønn og omtrent samme alder uten osteoporose fremskaffes og fungerer som kontroll.

Cellekulturmediet består fortrinnsvis av -MEM medium og HAM-F12 medium (Gibco) og kan valgfritt tilsettes serum. Forholdet mellom -MEM mediet og HAM-F12 mediet er fortrinnsvis 1:2; ellers vil forhold mellom 3:1 og 1:3 også frembringe det ønskede resultat. Føtalt kalveserum, humant serum, bovint serum albumin eller Ultroser fungerer som tilsetningsstoffer og kan variere fra 1-12 %. Det foretrekkes å bruke 2-7% Ultroser, helst 2-5 % Ultroser.

Ved å velge ut de ovenfor beskrevne cellekultur-betingelsene, har det lykkes å oppnå opprettholdelse av levedyktighet i de standardiserte cellekulturene fra osteoporosepasienter fra over to måneder og opp til to år. Opp-finnelsens diagnostiske metode utføres ved bruk av cellekulturer opp til andre passasje, fordi de best gjenspeiler situasjonen i menneskekroppen.

Celleekstraktene fra primære osteoblastcellekulturer ble undersøkt ved hjelp av høyoppløselig todimensjonal gelelektroforese og sølvfarging, og sammenlignet med celleekstrakter fra osteoblastcellekulturer fra pasienter som ikke lider av osteoporose.

Det ble funnet at cellekulturer fra osteoporosepasienter viser et typisk, reproduserbart ekspresjonsmønster av omkring 700 intracellulære proteiner i den høyoppløselige 2D SDS PAGE gelen i samsvar med distribusjon av flekker i fig. 1.

Dette proteinekspresjonsmønster er identisk med proteinekspresjonsmønsteret til osteoblastcellekulturene fra pasienter som ikke har osteoporose (se fig. 2). Når intensi-teten av de ulike flekkene i fig. 1 og 2 sammenlignes er det imdlertid reproduserbare og kvantitativt målbare tydelige forskjeller i minst 6 flekker (se markeringspilene i fig. 1 og fig. 2), der det ble observert redusert ekspresjon av fem proteiner og økt ekspresjon av et protein i osteoblastcellekulturene sammenlignet med osteoblastcellekulturer fra pasienter som ikke har osteoporose. Derfor kan det utarbeides komplementære redegjørelser angående tilstedeværelse av osteoporose ved å benytte flekkenes intensitet.

Osteoblastcellekulturenes proteinekspresj onsmønster ble også sammenlignet med proteinekspresjonsmønsteret fra humane fibrosarkomer og humane osteosarkomer. Det ser ut som om proteinekspresjonsmønstrene fra fibrosarkomer og osteosarkomer var forskjellige fra osteoblastekspresjonsmønstrene. Dette viser tydelig at osteoblastcellekulturene er rene cellekulturer, ikke forurenset av andre celletyper.

Osteoporosediagnostiseringsmetoden ifølge foreliggende oppfinnelse baseres på bestemmelse av egnede osteoblast-spesifikke differensieringsmarkører som muliggjør uttalelser angående tidlig differensieringsfase av osteoblastene, biosyntesen og modningen av den ekstracellulære matriks, og den sene osteoblastdifferensieringsfase.

Det ble funnet at for å oppnå et resultat med minst 95 % pålitelighet bestemmes celleproliferasjonshastighet og ekspresjon av minst seks osteoblast-spesifikke differen-sieringsmarkører kvantitativt, og i tillegg til celleproliferasjonshastighet minst én parameter fra osteoblastens tidlige differensieringsfase, minst én parameter fra sen differensieringsfase, og minst fire parametere fra matrikssyntesen.

Ved undersøkelse av tidlig differensieringsfase bestemmes fortrinnsvis ekspresjon av en av de tre onkogenene c-myc, c-fos eller c-jun, spesielt c-fos i tillegg til celle-prolif erasjonshastighet . Ved undersøkelse av dannelse og modning av ekstracellulær matriks bestemmes ekspresjon av intracellulær alkalisk fosfatase, kollagen type I og type IV og kondroitinsulfat eller hyaluronsyre, og ved undersøkelse av sen differensieringsfase bestemmes intracellulær syntese av osteokalsin.

Disse parameternes ekspresjonsintensiteter ble sammenlignet med intensitetene fra primære osteoblastcellekulturer fra forsøkspersoner av samme kjønn og omtrent samme alder som ikke har osteoporose, og ble gjenstand for statis-tiske beregninger f.eks. en diskriminerende analyse. Selvfølgelig kan også flere differensieringsmarkører, slik som vekstfaktorer (f.eks. TGF- ), cytokiner (f.eks. IGF I, IGF II), alkalisk fosfatase utskilt i cellesupernatanten, så vel som utskilt kollagen type I og IV, bestemmes i den hensikt å øke påliteligheten av resultatene.

Ved undersøkelse av osteoblastenes tidlige differensieringsfase måles celleproliferasjonshastigheten i parallelle kulturer etter 48 -196 timers inkubering, fortrinnsvis etter 72 timers inkubering. Målingene utføres ved bruk av vanlige celleproliferasjonsanalyser, f.eks. ved å inkorporere en radioaktivt merket substans som <3>H-tymidin i DNA. I tillegg er analysen for inkorporering av bromdeoksyuridin, utviklet av Boehringer Mannheim GmbH, godt egnet for en slik bestemmelse. Det ser ut som en 4-6 gangers reduksjon i celleproliferasjons-kapasiteten indikerer en osteoporosepasient (se fig. 3).

I tillegg er ekspresjonen av de tre onkogenene c-fos, c-myc og c-jun spesifikke for osteoblastenes tidlige differensieringsfase. Fortrinnsvis bestemmes ekspresjonen av c-fos. Ekspresjon av onkogener bestemmes kvantitativt etter samme inkuberingsperiode som ved bestemmelse av proliferasjonshastighet, ved bruk av immunhistokjemisk farging av deres proteinprodukter i enlags cellekulturer og spektrofotometri.

I tillegg kan en kvantifisering av likevektsnivået til hhv. spesifikk mRNA ved kvantitativ PCR, og eventuelt en Northern blot analyse (hvis mulig avhengig av celleantallet) utføres for å undersøke osteoblastenes tidlige differensier-ingsf ase .

Celleproliferasjonshastigheten og onkogenekspresjons-intensitetene i osteoporose- og ikke-osteoporoseceller blir sammenlignet og en uttalelse om tilstedeværelse av osteoporose blir utformet, eller så blir disse parametrene sammen med parametere fra sen differensieringsfase og matrikssyntese evaluert statistisk.

Når biosyntesen og modningen av ekstracellulær matriks produsert av osteoporose- og ikke-osteoporoseceller undersøkes, vil i det minste intracellulær alkalisk fosfatase,

kollagen type I og type IV, kondroitinsulfat eller hyaluronsyre bestemmes kvantitativt etter en inkuberingsperiode på fra 3 til 14 dager, fortrinnsvis 3 til 7 dager, ved bruk av immunhistokjemisk farging av deres proteinprodukter og spektrofotometri . Det synes som om osteoblaster fra osteoporosepasienter uttrykker 4 til 5 ganger mer alkalisk fosfatase enn osteoblaster fra friske pasienter (se fig. 4). Likeledes blir mem-branbundet kondroitinsulfat uttrykt sterkere av osteoblaster fra osteoporosepasienter.

Bestemmelsen ifølge oppfinnelsen av ekspresjon av alkalisk fosfatase i osteoblastcellekulturer fra pasienter som lider av osteoporose og pasienter som ikke lider av osteoporose, muliggjør uttalelser vedrørende ikke bare allerede manifestert, men også begynnende osteoporose.

En begynnende osteoporose er kjennetegnet ved en svak økning i endogen ekspresjon av alkalisk fosfatase, mens i en manifest osteoporose er den endogene ekspresjon av alkalisk fosfatase kraftig øket.

I tillegg til de ovenfor nevnte parametrene kan også kvantitativ bestemmelse av vekstfaktorer som TGF- , spesielt TGF- 2, og cytokiner som IGF I og IGF II, ved bruk av immunhistokjemisk farging av deres proteinprodukter og spektrofotometri, benyttes ved ytterligere undersøkelser av oppbygging og modning av ekstracellulær matriks.

Bestemmelse av BMP (benmorfogenetiske proteiner) i osteoblastceller kan fremskaffe tilleggsinformasjon i for-bindelse med sykdommen.

Ved undersøkelse av oppbygging og modning av ekstracellulær matriks kan også tilleggsvis spesifikk mRNA bestemmes ved kvantitativ PCR og Northern blot.

Eventuelt kan alkalisk fosfatase utskilt i celle-kultursupernatanten, så vel som kollagen type I og IV, kvanti-fiseres som tilleggsparametere.

For å undersøke osteoblastenes sene differensieringsfase (mineraliseringsprosessen), blir reagenser som fremmer mineraliseringen tilsatt de parallelle bencellekulturene, og den intracellulære syntesen av osteokalsin bestemmes kvantitativt. Denne bestemmelsen blir fortrinnsvis utført ved hjelp av immunhistokjemisk farging og spektrofotometri.

Påvisning av osteokalsin spesifikk mRNA kan utføres i tillegg, og utføres ved bruk av PCR.

Som en tilleggsanalyse kan nysyntetisert mineral-matriks og dannelse av mineraliserte knuter påvises gjennom den sene differensieringsfasen ved sølvnitratfarging ifølge van Kossa.

Når de 7 nevnte parametere (celleproliferasjon, et onkogen, alkalisk fosfatase, kollagen type I og IV, kondroi-tinsulf at eller hyaluronsyre, osteokalsin) som et minimum er bestemt, utføres vurderingen ved sammenligning med de samme parametere fra ikke-osteoporoseceller og eventuelt, ved hjelp av statiske metoder der diskriminerende analyse har vist seg å være spesielt nyttig.

Det så ut til at proliferasjonshastigheten til celler isolert fra osteoporosepasienter var signifikant lavere sammenlignet med proliferasjonshastigheten til friske pasienter. I det tilfelle at c-fos onkogene og TGF- 2 ekspresjonen i celler gjenvunnet fra osteoporosepasienter er signifikant lavere, og kondroitinsulfat og osteokalsinekspresjon er høyere sammenlignet med ekspresjonshastigheten til de respektive differensieringsmarkørene i celler fra ikke-osteoporosepasienter, da er sykdommen osteoporose tilstede. Syntese-hastigheten til alkalisk fosfatase i osteoblaster isolert fra osteoporosepasienter er signifikant høyere enn ekspresjon av alkalisk fosfatase i osteoblaster isolert fra pasienter som ikke har osteoporose.

Oppfinnelsen angår dermed en fremgangsmåte for diagnostisering av osteoporose, kjennetegnet ved at, for å oppnå minst 95 % pålitelig resultat, standardiserte, primære osteoblastcellekulturer blir fremstilt in vitro i et første trinn ved sekvensiell enzymatisk fordøying av transilikale benbiopsier fra osteoporosepasienter og dyrking av isolerte osteoblastforløperceller, etterfulgt av kvantitativ bestemmelse av celleproliferasjonshastighet og uttrykking av minst seks osteoblastspesifikke differensieringsmarkører, og i tillegg til celleproliferasjonshastigheten blir minst én parameter i den tidlige differensieringsfasen til osteoblastene, som er valgt fra uttrykkingen av ett av de tre onkogenene c-myc, c-fos eller c-jun, bestemt, den intracellulære syntesen av osteokalsin blir bestemt som parameter av den sene differensieringsfasen, og der minst uttrykkingen av intracellulær alkalisk fosfatase, kollagen type I, kollagen type IV og kondroitinsulfat eller hyaluronsyre blir bestemt som parameter av matrikssyntesen, og disse parametrene blir sammenlignet med tilsvarende parametere fra primære osteoblastcellekulturer fra testpersoner som ikke lider av osteoporose, der testpersonene er av samme kjønn og omtrent samme alder og som eventuelt blir

evaluert statistisk.

Denne nye metoden tillater dermed en opp til 95 % pålitelig bestemmelse angående tilstedeværelsen av osteoporose på bakgrunn av cellekulturer i samsvar med foreliggende oppfinnelse, ved utelukkende å bestemme de ovenfor nevnte 7 parametere som måles ved bruk av, for en fagperson, kjente metoder. Det ser overraskende ut til at cellekulturene fra oppfinnelsen også er utmerket egnet for å teste potensielle terapeutiske midler mot osteoporose og dermed er et in vitro testsystem som tillater undersøkelse av den direkte effekt av potensielle midler på individuelle humane osteoblastforløper-celler fra friske forsøkspersoner og pasi.enter tilgjengelig.

Oppfinnelsen angår derfor også en fremgangsmåte for testing av potensielle terapeutiske midler mot osteoporose, kjennetegnet ved at den mitogene effekten av de potensielt aktive stoffene og/eller deres effekt på differensieringen av osteoblastforløperceller in vitro i standardiserte, primære osteoblastcellekulturer fra osteoporosepasienter blir bestemt ved hjelp av en kvantitativ bestemmelse av celleproliferasjonshastigheten og uttrykking av minst seks osteoblastspesifikke markører, der standardiserte, primære osteoblastcellekulturer i et første trinn blir fremstilt ved sekvensiell enzymatisk fordøying av transilikale benbiopsier fra osteoporosepasienter og isolerte osteoblastforløperceller blir fremskaffet og dyrket, og i tillegg til celleproliferasjonshastigheten blir minst én parameter fra den tidlige differensieringsfasen til osteoblastene, som er valgt fra uttrykkingen av ett av de tre onkogenene c-myc, c-fos eller c-jun, bestemt, den intracellulære syntesen til osteokalsin blir bestemt som parameter av den sene differensieringsfasen, og minst uttrykkingen av intracellulær alkalisk fosfatase, kollagen type I, kollagen type IV og kondroitinsulfat eller hyaluronsyre blir bestemt som parameter av matrikssyntesen, og disse parametrene blir sammenlignet med tilsvarende parametere fra primære osteoblastcellekulturer fra testpersoner som ikke lider av osteoporose, der testpersonene er av samme kjønn, omtrent samme alder og eventuelt utsatt for statistisk evaluering. Det viser seg at den mitogene effekten til potensielle terapeutiske midler mot osteoporose også kan bestemmes ved å måle celle proliferasjonshastigheten ved hjelp av de vanlige metodene som beskrevet (se fig. 5).

Virkningen av potensielle terapeutiske midler mot osteoporose på differensieringen av "osteoporotiske" osteo-blastf orløperceller kan også bestemmes ved å måle de ovenfor beskrevne minimumsparametrene for diagnostisering av osteoporose. Også i dette tilfelle oppnås et pålitelig resultat ved bare å bestemme de ovenfor nevnte parametrene ved hjelp av immunhistokjemisk farging og spektrofotometri.

Virkningen av potensielle terapeutiske midler mot osteoporose på reguleringen av matrikssyntesen kan tilleggsvis bestemmes ved hjelp av deteksjon av spesifikk mRNA ved bruk av kvantitativ PCR. Bestemmelsen utføres på en slik måte at det totale RNA isoleres fra cellene, et cDNA bibliotek blir laget fra mRNA ved anvendelse av oligo og/eller tilfeldige primere og revers transkriptase, og den beregnede mengde av henholds-vis spesifikk enkelttrådet cDNA blir forsterket ved bruk av spesifikke primerpar. Ved kvantifisering blir -aktinfrag-mentet forsterket parallelt som husholdningsgen ved anvendelse av PCR.

Denne undersøkelsen er et utmerket supplement til dyremodellene som for tiden benyttes ved testing av terapeutiske midler mot osteoporose, og som bare i begrenset grad samsvarer med de humane symptomer, og på ingen måte tillater individuell bestemmelse av spesielt egnede terapeutiske midler. Når det tas bensubstsansprøver av pasienter som lider av andre skjelettsykdommer, er det mulig å undersøke virkningen av potensielle terapeutiske midler mot disse sykdommene i tillegg, ved anvendelse av derfra etablerte cellekulturer i henhold til oppfinnelsen.

Standardiserte primære osteoblastcellekulturer etab-lert fra osteoporosepasienter, kan fremstilles på en reprodu-serbar måte ved anvendelse av den ovenfor beskrevne metode og holdes levende i opptil to år. Disse representerer rene kulturer som kan identifiseres enhetlig ved hjelp av høyoppløse-lig 2D SDS gelelektroforese og kan atskilles fra osteoblast-cellekulturer fra pasienter som ikke har osteoporose.

Anvendelsen av disse primære osteoblasteellekulturene ved diagnostisering av osteoporose og ved testing av potensielle terapeutiske midler mot osteoporose er beskrevet.

Med henvisning til figurene og utførelsesformene, som ikke er ment å være begrensende,, vil oppfinnelsen bli illu-strert i større detalj under.

Figurer:

Fig. 1: Høyoppløsning 2D SDS PAGE gel med standardiserte primære osteoblastcellekulturer fra osteoporose pasienter.

Ekspresjonsmønsteret fra intracellulære proteiner i overensstemmelse med distribusjonen av flekker.' Piler: Intensitetsforskjeller av seks proteiner sammenlignet med fig. 2

Fig. 2 : Høy-oppløsning 2D SDS PAGE gel med standardiserte primære osteoblastcellekulturer fra pasienter som ikke har osteoporose

Ekspresjonsmønsteret fra intracellulære proteiner i samsvar med distribusjonen av flekker Piler: Intensitetsforskjeller av seks proteiner sammenlignet med fig. 1.

Fig. 3: Påvisning av redusert proliferasjonshastighet i osteoblastforløperceller fra osteoporosepasienter {OP celler) sammenlignet med proliferasjonshastigheten til osteoblastforløperceller fra ikke- osteoporosepasienter (NOP celler)

xl-x3: Behandling med FCS (føtalt kalveserum) 48

t, 120 t, 192 t.

x4-x6: Behandling med inaktivert humant kontrollserum, 48 t, 120 t, 192 t (se utførelseform 3}

Fig. 4: Påvisning av økt ekspresjon av intracellulær alkalisk fosfatase i osteoblastforløperceller fra osteoporosepasienter (POP og OP celler)

POP: preklinisk osteoporose, n = 12

OP: osteoporose, n = 14

NOP: ikke-osteoporose, n = 18

10% FCS, 192 t

Fig. 5: Ulike doseresponskurver (stimulerende evne) av NOP og OP celleproliferasjon ved stimulering med proteiner

(vekstfaktorene 1, 2 og 3)

En doseavhengig mitogen effekt av vekstfaktor 1 (TGF- 2) på osteoblastceller fra osteoporosepasienter vises tydelig.

Fig. 6: Diskriminerende analyse (25 prøver) av osteoblastceller fra pasienter som lider av osteoporose (OP) og de som ikke lider av osteoporose (NOP).

Utførelsesformer

1. Celledyrking

Celledyrkingsmodellen baseres på primærcellekulturer isolert fra hoftekambiopsier fra pasienter med mistenkt osteoporose karakterisert ved hjelp av differensiell diagnose. Hoftekamsbiopsinene ble tatt fra kvinnelig pasienter i alderen fra 50 til 70 år, 26 med osteoporose og 18 uten osteoporose.

Alle de utstansede benprøvene ble behandlet på følgende måte: Etter vasking av de utstansede bitene med PBS og fjerning av mulig tilstedeværende fett og bindevev, ble hver av benbitene behandlet fem ganger med fortynnet kollagenase-løsning (0,5 mg/ml) ved Worthinton (CLS 2) ved 37°C i 30 minutter. -MEM medium og HAM-F12 medium fra Gibco i forholdet 1 : 2 uten tilsetning av serum ble brukt til å fortynne ko11agenase1øsningen.

Hver av de etablerte fraksjonene ble vasket i et medium inneholdende serum (medium som beskrevet ovenfor),

overført til et medium inneholdende 3 % Ultroser og dyrket.

2. Cellekulturbetingelser

Gjennom hele den eksperimentelle perioden ble cellene dyrket i et medium med serum bestående av like mengder -MEM medium og HAM-F12 medium fra Gibco, og mediet ble skiftet to ganger i uken.

Cellene fra fraksjon 1 og 3 ble dyrket og passert kontinuerlig.

3. Bestemmelse av celleproliferasjonshastighet

3.000 osteoblastceller fra fraksjonene 1 til 2 fram til andre passasje, isolert fra osteoporosepasienter (OP celler), ble inkubert per brønn i en 96-brønns mikrobrønnplate i nærvær av 10% FCS og 10% inaktivert humant kontrollserum. I et cellekulturmedium ( -MEM og HAM-S F12 medium 1:12) i 48 t, 120 t og 192 t. Parallelt med dette ble 3.000 osteoblastceller fra pasienter som ikke lider av osteoporose inkubert under de samme betingelsene. Antallet intakte celler ble bestemt ved hjelp av trypanblåfarging og telling i et tellekammer.

4. Bestemmelse av celleproliferasjonshastigheten under påvirkning av de tre vekstfaktorene 1, 2 og 3 ved anvendelse av bromdeoksyuridin inkorporering ( BrdU inkorporering)

Vekstfaktor 1 = TGF-

2 = IGF I

3 = IGF II

Celler fra fraksjon 1 og/eller 2 fra hver utstanset benbit opp til andre passasje ble brukt i proliferasjonstesten.

Det ble anvendt 3 x 10<1> celler fra første og/eller andre passasje per brønn av en 96-brønnplate og 200 1 medium.

Cellene ble dyrket i tre dager ved de tidligere beskrevne betingelsene og deretter dyrket videre i en dag i mediet uten serum inntil subkonfluens ble oppnådd. Deretter ble de tre vekstfaktorene 1, 2 og 3 tilsatt til cellene ved fire forskjellige sluttkonsentrasjoner (100, 10, 1 og 0,1 ng/ml medium).

Celler i et medium inneholdende 10 % FCS og et medium inneholdende 5 % Ultroser fungerer som kontroller.

Tripletter ble satt opp for alle konsentrasjoner og kontroller.

Seks brønner med celler uten tilsetning av bromo-deoksiuridin under proliferasjonstesten fungerte som blind-prøver.

Etter 54 timers inkubering med vekstfaktorene, ble proliferasjonstesten (5-Brom-2<1->deoksyuridin Labeling and Detection Kit III fra Boehringer Mannheim) startet ved å tilsette 20 1 merkingsløsning fortynnet 1 : 90 i 1 % BSA medium etterfulgt av 18 timers inkubering.

Proliferasjonstesten ble utført i henhold til produsentens retningslinjer.

Evalueringen av proliferasjonstesten ble utført ved å måle optisk tetthet (OD) ved 405 nm i en ELISA avleser. Etter 60 minutters fargeutvikling ble absorbansen målt 12 ganger med intervaller på 5 minutter.

De oppnådde verdiene fremgår fra tabell 1.

I fig. 5 illustreres den målte absorbansen fra hver av de tre vekstfaktorene som en funksjon av konsentrasjonen.

5. Gjennomføring av høyoppløselig 2D SDS gelelektroforese ( IEF

SDS PAGE)

2D SDS gelelektroforese av NOP og OP celleekstrakter ble utført som beskrevet i "Electrophoresis" 1994, 15, 685-707, p. 686.

Første dimensjon: isoelektrisk fokusering (IEF) (venstre side av gelen: sure proteiner med IP, f.eks. 4;

høyre side av gelen: proteiner med IP,

f.eks. 8)

Andre dimensjon: SDS PAGE under reduserende betingelser

(proteiner med mindre molekylvekt opp-trer i de lavere områdene og de med høy molekylvekt i de øvre områdene) Evalueringen av flekkintensiteten ble gjennomført ved anvendelse av skanning densitiometri og statistikk.

6 . Undersøkelsesprosedyrer og materialer

Bestemmelse av intracellulær og utskilt alkalisk fosfatase ( AP)

Celledyrkingsbetingelser:

3.000 osteoblastceller fra fraksjonene 1 og 2 opp til andre passasje, isolert fra osteoporosepasienter (OP celler), per brønn ble preinkubert i en 96-brønns mikrobrønnplate i nærvær av 20 % FCS og 10 % inaktivert humant kontrollserum i et cellekulturmedium ( -MEM og HAM-S F12 medium) i 24 timer. Parallelt med dette ble 3.000 osteoblastceller fra pasienter som ikke har osteoporose dyrket under de samme betingelsene.

AP analyse:

Cellene ble dyrket i tre dager under de beskrevne betingelsene og deretter ble AP analysen utført. Cellene ble vasket to ganger med fosfatbuffer fra Dulbecco, og deretter lysert hver gang ved bruk av 100 1 av en løsning bestående av 0,1 M glysin, pH 10,3, 1 mM ZnCl2, 1 mM MgCl2 og 0,1 % Triton X-100. Til hver av brønnene i en mikrobrønnplate ble det tilsatt 50 1 av en 2,5 mM løsning av dinatrium 4-nitrofenyl fosfat heksahydrat (AP reagens) og fargeutviklingen ble målt ved 405 nm innenfor en time med intervaller på 15 minutter i en TITERTEK ELISA avleser. Enzymatisk aktivitet korreleres til fargeintensiteten og uttrykkes som nM p-nitrofenylfosfat som substrat per celleantall bestemt. Parallelt med dette ble det som standard pipettert en fortynningsrekke av 1 mM 4-nitro-fenol-løsning. Celler i et medium inneholdende 10 % FCS fungerte som kontroller.

PCR:

Amplifisering av mRNA som koder for osteoblast spesifikke differensieringsmarkører ved anvendelse av revers transkriptase- polymerasekjedereaksjon ( RT- PCR) Amplifiseringen av spesifikke mRNA sekvenser ved bruk av RT-PCR utføres ved a) isolering av totalt RNA; b) syntese av enkelttrådet cDNA ved å transkribere mRNA til cDNA ved hjelp av Superscript II revers transkriptase og oligo-dT eller tilfeldig primer; c) amplifisering av cDNA fragmenter som koder spesielt for osteoblast differensieringsmarkører ved bruk av PCR; d) påvisning av spesifiserte amplifiserte PCR produkter på agarosegeler.

Isolering av totalt RNA

Totalt RNA fra 1-2 millioner osteoblaster og osteoblastlignende celler ble isolert (Trizol Kit, Gibco Life Technologies).

Syntese av enkelttrådet cDNA ved transkribsjon av mRNA til cDNA ved bruk av Superscript II revers transkriptase og oligo-dT eller tilfeldig primer

Opp til et halvt mikrogram av det totale RNA eller 5-50 ng mRNA per prøve ble transkribert ved hjelp av Superskript II revers transkriptase og 500 ng oligo-dT eller 500 pg tilfeldig primer (Superscript II Reverse Transcriptase Kit, Gibco, Life Technologies) ved 42°C i 50 minutter.

Det dannede cDNA blir brukt som templat for amplifiseringen i PCR.

Amplifisering av cDNA fragmenter som koder spesielt for osteo-blastdifferensieringsmarkører ved anvendelse av PCR

En tiendedel av den enkelt-trådete cDNA (se ovenfor) ble amplifisert i 2 mM Tris-HCl; pH 8,4; 5 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 10 mM sense amplifiseringsprimer, 10 mM antisense amplifiseringsprimer under de følgende PCR-betingelsene (fortrinnsvis):

Denaturering: 10 min.

8 PCR sykluser ble kjørt som følger:

Denaturering ved 94°C, 45 s.;

Annealing: 58°C, 1 min. 45 s. ekstensjon ved

72°C, 3 min.;

Dette ble etterfulgt av 25 PCR sykluser:

Denaturer ing ved 94°C, <%>45 sek. ;

Annealing: 55°C, 45 sek.; ekstensjon ved 72°C,

3 min.;

Ekstensjon: 72°C, 10 min.

Gelelektroforese av PCR produkter

En tiendedel til en tyvendedel av PCR produktet ble separert på 0,7 % til 1,2 % agarosegel i en halv time ved 60 V konstant spenning, og de amplifiserte PCR produktenes molekylvekter ble sammenlignet med en DNA markør.

Sense og antisense primer sekvenser

Primerparsekvensene spesifikke for cDNA som koder for osteoblastdifferensieringsmarkører ble valgt ut av Co. Don GmbH ved hjelp av MacMolly Tetra Software (Prof. B. Wittig).

Northern Blotting

Deteksjon av osteoblastdifferensieringmarkør- spesifikt mRNA: Deteksjonen av spesifikke mRNA sekvenser ved hybridisering gjennomføres ved å separere det totale RNA på en agarosegel matriks, overføre og deretter fiksere det på et filter og hybridisere med en spesifikk DNA probe.

Isolering av totalt RNA

Det totale RNA fra 10-20 millioner osteoblaster og osteoblastlignende celler ble isolert (Trizol Kit by Gibco).

RNA gel elektroforese

Fra 5 til 10 g av det isolerte RNA ble separert på en 1,2 % formaldehyd agarosegel i en time ved en konstant spenning på 100 V.

Overføring

Etter elektroforesen ble gelene plassert på en amfoter Nytranmembran (Schleicher & Schuell) i en time, blottet over natten. Nukleinsyrene ble deretter kryssbundet ved bruk av UV stråler.

Merking av DNA probe

Et cDNA fragment på 40 baser spesifikt for osteoblast diffemsieringsmarkører som skulle undersøkes, ble hver gang amplifisert ved hjelp av polymerase kjedereaksjon (PCR) og deretter inkubert med biotinreagens Bio-ULS (Dianova GmbH) i en time ved 87°C.

Hybridisering

Etter kryssbinding med UV ble nitrocellulosemembranen pre-hybridisert med 0,1 mg/ml sildesperma DNA i 75 mM natrium-nitrat buffer, 750 mM NaCl, 5 % polyvinylpyrrolidon, 0,1 % BSA, 5 mM EDTA, 0,5 % SDS ved 42 °C i 15 minutter og deretter inkubert i 16 timer ved 42 °C i en løsning av 50 % formamid, 1 % bovint serum albumin, 1 mM EDTA, 0,5 mM natriumfosfat, 5 % natriumdodecylsulfat og spesifikk biotin merket DNA probe (ca. 100 ng).

Deteksjon av mRNA

Etter hybridiseringen ble membranen vasket, blokkert med 1,5 % tørrmelkløsning og inkubert i en løsning av strepta-vidin/alkalisk fosfatase (Schleicher & Schuell) i fra 15 minutter til 3 timer. Deretter ble membranen vasket med 0,5 % Tween-20 PBS løsning i 5 minutter og fargeutviklingen ble effektuert ved å inkubere membranen i 0,1 M Tris-HCl; 0,1 M NaCl; 5 mg MgCl2, NBT (32 mg/ml) i 70 % dimetylformamid, BCIP (16 mg/ml i 1-16 timer.

Primer/ DNA probesekvenser

Primerparenes sekvenser og/eller DNA hybridiserings-probene, som representerer cDNA som spesielt koder for osteo-blastdif f erensieringsmarkørene, ble selektert ved bruk av MacMolly Tetra Software (Prof. B. Witting).

Utføring av immunhistokjemisk farging

Prinsipp: Deteksjon av cellulære antigener i et konfluent cellelag ved anvendelse av spesifikke antistoffer gjennom et sekundært antistoff (enzym- eller biotinkonjugat) og på-følgende deteksjon av substratspalting. Celler ble så sådd ut ved en konsentrasjon på fra 1 x IO<3> til 5 x IO<4> celler per brønn og inkubert i en inkubator ved 37 °C inntil et konfluent céllelag var dannet.

Mediet ble sugd av og vasket tre ganger ved PBS. Cellefiksering: Tilsett 100 1 iskald metanol per brønn,

inkuber ved 4 °C i fra 10 til 20 minutter,

vask 3 ganger med PBS

Metning av frie bindingssteder i brønnen:

Tilsett 100 1 av en 2 % skummet melk i PBS-løsning per brønn, rist vedromtemperatur (RT) i 1 time eller ved 4 °C natten over; slå ut eller sug av platen.

Tilsett 50 1 av respektive spesifikke antistoff og rist ved romtemperatur i 1 time eller ved 4 °C over natten; vask 3 ganger med PBS.

Tilsett 50 1 av det sekundære antistoff (peroksidase konjugert; spesifikke geit-anti-kanin eller geit-anti-mus antistoffer fra Sigma ble brukt) og rist ved romtemperatur i 1 time eller ved 4 °C over natten; vask 5 ganger med PBS.

Tilsetning av substrat: 100 1 (oppløselig, ABTS) substratløsning.

(ABTS = 2,2<1->azinobis(3-etylbenztiazolin-6-sulfonisk syre) tabletter løses i 0,05 M fosfat-citratbuffer, pH 5,0 (25,7 ml dinatrium hydrogenfosfat + 24,3 ml sitronsyre) og 25 1 30 % hydrogenperoksid, destillert vann til 100 ml; inkuber i mørket i 60 minutter.

Tilsett 100 1 substrat til brønn A12 (bakgrunn); mål optisk tetthet (OD) ved 405 nm i ELISA avleser.

7. Statistisk evaluering ved bruk av diskriminerende analyse

Ved bruk av diskriminerende analyse blir en osteoblast cellekultur plassert i gruppen av pasienter som lider av osteoporose eller i gruppen av friske individer som et resultat av cellulær proliferasjonshastighet og ekspresjonsintensi-teten av cellulære differensieringsmarkører.

Hensikten er å bestemme koeffisienten med det beste samsvar av de diskriminerende funksjonsverdier.

Betraktes de 7 undersøkte variablene i henhold til oppfinnelsen, bringer den dikriminerende analysen av osteoblastceller fra pasienter som lider av osteoporose og de som ikke gjør det til veie følgende data:

Det fremgår fra dataene at NOP og OP blir utmerket klassifisert.

Egenverdien, som representerer forholdet mellom summen av kvadratene mellom gruppene og summen av kvadratene innenfor gruppene er særdeles høy. Høye egenverdier indikerer gode diskriminerende funksjoner. Resultatene fra den diskriminerende analysen vises i fig. 6.

Claims

1. Fremgangsmåte for diagnostisering av osteoporose, karakterisert ved at, for å oppnå minst 95 % pålitelig resultat, standardiserte, primære osteoblastcellekulturer blir fremstilt in vitro i et første trinn ved sekvensiell enzymatisk fordøying av transilikale benbiopsier fra osteoporosepasienter og dyrking av isolerte osteoblastfor-løperceller, etterfulgt av kvantitativ bestemmelse av celle-prolif erasjonshastighet og uttrykking av minst seks osteoblastspesifikke differensieringsmarkører, og i tillegg til celleproliferasjonshastigheten blir minst én parameter i den tidlige differensieringsfasen til osteoblastene, som er valgt fra uttrykkingen av ett av de tre onkogenene c-myc, c-fos eller c-jun, bestemt, den intracellulære syntesen av osteokalsin blir bestemt som parameter av den sene differensieringsfasen, og der minst uttrykkingen av intracellulær alkalisk fosfatase, kollagen type I, kollagen type IV og kondroitinsulfat eller hyaluronsyre blir bestemt som parameter av matrikssyntesen, og disse parametrene blir sammenlignet med tilsvarende parametere fra primære osteoblastcellekulturer fra testpersoner som ikke lider av osteoporose, der testpersonene er av samme kjønn og omtrent samme alder og som eventuelt blir evaluert statistisk.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at, ved undersøkelse av den tidlige differensieringsfasen til osteoblastene, uttrykkingen av c-fos blir bestemt i tillegg til celleproliferasjonshastighet .

3. Fremgangsmåte for testing av potensielle terapeutiske midler mot osteoporose, karakterisert ved at den mitogene effekten av de potensielt aktive stoffene og/eller deres effekt på differensieringen av osteoblastforløperceller in vitro i standardiserte, primære osteoblastcellekulturer fra osteoporosepasienter blir bestemt ved hjelp av en kvantitativ bestemmelse av celleproliferasjonshastigheten og uttrykking av minst seks osteoblastspesifikke markører,- der standardiserte, primære osteoblastcellekulturer i et første trinn blir fremstilt ved sekvensiell enzymatisk fordøying av transilikale benbiopsier fra osteoporosepasienter og isolerte osteoblastforløperceller blir fremskaffet og dyrket, og i tillegg til celleproliferasjonshastigheten blir minst én parameter fra den tidlige differensieringsfasen til osteoblastene, som er valgt fra uttrykkingen av ett av de tre onkogenene c-myc, c-fos eller c-jun, bestemt, den intracellulære syntesen til osteokalsin blir bestemt som parameter av den sene differensieringsfasen, og minst uttrykkingen av intracellulær alkalisk fosfatase, kollagen type I, kollagen type IV og kondroitinsulfat eller hyaluronsyre blir bestemt som parameter av matrikssyntesen, og disse parametrene blir sammenlignet med tilsvarende parametere fra primære osteoblastcellekulturer fra testpersoner som ikke lider av osteoporose, der testpersonene er av samme kjønn, omtrent samme alder og eventuelt utsatt for statistisk evaluering.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at, ved undersøkelse av den tidlige differensieringsfasen til osteoblastene, uttrykkingen av c-fos blir bestemt i tillegg til celleproliferasjonshastigheten.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 3, karakterisert ved at de pasientspesifikke osteoblastcellekulturene blir dyrket i et cellekulturmedium som består av -MEM-medium og HAM-F12-medium og som eventuelt inneholder tilsatt serum.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at de pasientspesifikke osteoblastcellekulturene blir dyrket i et cellekulturmedium som inneholder fra 1 til 12 % tilsatt serum, og der forholdet mellom -MEM-medium og HAM-F12-medium er mellom 3:1 og 1:3.