DE19545892A1

DE19545892A1 - Verwendung von (E)-5-(2-Bromovinyl-)-2'-deoxyuridine (BVDU) zur Resistenzbildung bei der Zytostatikabehandlung und Arzneimittel, enthaltend BVDU

Info

Publication number: DE19545892A1
Application number: DE19545892A
Authority: DE
Inventors: Rudolf Prof Dr Fahrig; Angela Dr Steinkamp-Zucht
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: RESPROTECT GMBH, 01307 DRESDEN, DE
Priority date: 1995-12-08
Filing date: 1995-12-08
Publication date: 1997-06-12

Description

Das Auftreten von "Arzneimittel-Resistenz" ist der Hauptgrund für Fehlschläge in der Krebs-Chemothera pie. Tumoren, welche anfangs empfindlich auf Zytosta tika reagieren, erholen sich sehr häufig nach einer gewissen Behandlungszeit und sind dann resistent ge genüber der Wirkung verschiedenartiger antineoplasti scher Arzneimittel. Obwohl das Problem der "Arznei mittel-Resistenz" schon seit 1948, dem Beginn der Krebstherapie mit Zytostatika, bekannt ist, wurde bis heute kein Weg gefunden, die Resistenzbildung zu ver hindern. Charakteristisch für alle bisher untersuch ten hochresistenten Tumoren und Zellinien ist die Amplifikation (Vervielfachung) einer kleinen Gruppe von Genen. Als Folge dieser DNA- oder Genamplifika tion kann eine erhöhte Expression dieser Gene nach gewiesen werden, welche zur Resistenz gegenüber dem Arzneimittel führt. Als Folge dieser DNA-Amplifika tion kann eine erhöhte Expression verschiedener Gene nachgewiesen werden. Schutzproteine, die zur Aus schleusung von Giftstoffen aus der Zelle dienen, kön nen so vermehrt gebildet werden (P-Glycoprotein). Dieser Effekt wird auch als "multi-drug-resistance" (NDR) bezeichnet.

Zusätzlich zur NDR korreliert der Amplifikationsgrad gewisser Gene, vor allem gewisser Onkogene, mit dem Grad der Malignität. So sind die Überlebenschancen bei einer Amplifikation von ERVV2, RASKI, INT3, HST1, NYC und KSRAN beim Magenkrebs (Hirohasi, S., and Sugimura, T. Genetic alterations in human gastric cancer. Cancer cells (Cold Spring Habor), 3: 49-52, 1991) und ERBB2 und MYC beim Ovarkarzinom (Sasano, H., Garrett, C.T., Wilkinson, D.S., Silverberg, S., Comerford, J., and Hyde, J. Protooncogene amplifica tion and tumor ploidy in human ovarian neoplasm. Hum.Pathol., 21: 382-391,1990) sehr schlecht. Beim Brustkrebs korreliert die Amplifikation von MYC (Borg, A., Baldetorp, B., Fernö, N., Olsson, H., and Sigurdsson, H. C-myc amplification is an independent prognostic factor in postmenopausal breast cancer. Int. J. Cancer, 51: 687-691,1992) und Co-Amplifikation von INT2 und HST1 (Borg, A., Sigurdsson, H., Clark, G . . N., et al., Association of INT2/HST1 coamplifica tion in primary breast cancer with hormone-dependent phenotype and poor prognosis. Br.J.Cancer, 63: 136- 142, 1991) mit dem Krankheitsverlauf. Die Amplifika tion von ERBB2 (Descotes, F., Pavy, J.-J., and Ades si, G.L. Human breast cancer: Correlation study between HER-2 /neu amplification and prognostic factors in an unselected population. Anticancer Res., 13: 119-124,1993) und EGFR (Klÿn, J.G.N., Berns, P.M.J.J., Schmitz, P.I.M., und Foekens, J.A. The clinical significance of epidermal growth factor receptor (EGF-R) in human breast cancer: a review on 5232 patients. Endocr.Rev., 13: 3-17,1992) ist mit einem schlechten Krankheitsverlauf verbunden. Beim Ösophaguskarzinom korreliert die Co-Amplifikation von HST1 und INT2 mit dem Grad der Metastasierung (Tsuda, T., Tahara, E., Kajiyama, G., Sakamoto, H., Terada, N., and Sugimura, T. High incidence of coamplifica tion of hst-1 and int-2 genes in human esophageal carcinomas. Cancer Res. 49: 5505-5508,1989).

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß durch chronische Behandlung mit kanzerogenen Zytostatika induzierte Genamplifikation nicht nur zur Resistenz gegenüber dieser Behandlung führt, sondern auch zur Überexpression gewisser Onkogene, welche den Grad der Malignität kontrollieren.

Es sind eine Reihe von Substanzen beschrieben worden, die der erworbenen Arzneimittelresistenz entgegenwir ken. Hierzu gehören die von Kennedy (Kennedy, A.R., Prevention of Carcinogenesis by Protease Inhibitors, Cancer Res., 54: 1999-2005,1994) beschriebenen Arbei ten über die anti-kanzerogenen Wirkungen von Prote ase-Inhibitoren. Diese können kanzerogeninduzierte Genamplifikation auf nahezu normale Level herunter drücken. Kennedy beobachtete, daß strahleninduzierte Genamplifikation in gleicher Weise unterdrückt wird, wie es ihrer Fähigkeit entspricht, strahleninduzierte Transformation zu unterdrücken, so daß auf einen Zu sammenhang zwischen beiden Prozessen geschlossen wird. Darüber hinaus wirken Protease-Inhibitoren als Antagonisten von (co-rekombinogenen) Tumor-Promotoren bei Auslösung von Transformation in vitro. Protease- Inhibitoren werden auch als wirkungsvolle Anti-Promo toren in In-vivo-Untersuchungen beschrieben (Troll, W., Klassen, A., and Janoff, A. Tumorigenesis in mouse skin: inhibition by synthetic inhibitors of proteases. Science (Washington DC) 169: 1211-1213, 1970).

Aus der Literaturstelle Noscow, I.A., and Cowan, K.H. Nultidrug resistance. J.Natl.Cancer Inst. 80: 14-20, 1988, ist bekannt, daß Verapamil der NDR entgegen wirkt. Dieser "calcium channel blocker" erhöht die Zytotoxizität durch Erhöhung der intrazellulären Ak kumulation von Arzneimitteln. Wahrscheinlich ge schieht dies durch eine Wirkung auf das P-Glykopro tein oder andere Transportproteine. Die Toxizität dieser und ähnlicher Substanzen, wie z. B. Quinidin, steht ihrem klinischen Einsatz im Wege.

Ausgehend hiervon, ist es die Aufgabe der vorliegen den Erfindung, eine wirksame Substanz zur Verhinde rung bzw. Reduzierung der Resistenzbildung gegenüber der Zytostatikabehandlung anzugeben und ein entspre chendes Arzneimittel vorzuschlagen.

Die Aufgabe in bezug auf die Substanz wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 1 gelöst, in bezug auf das Arzneimittel durch die Merkmale des Anspruches 3.

Erfindungsgemäß wird somit vorgeschlagen, die Resi stenzbildung durch gleichzeitige Gabe von (E)-5-(2-Bromovinyl-)-2′-deoxyuridine (BVDU) und/oder deren Metaboliten und einem Zytostatikum zu verhin dern bzw. zu reduzieren. Es hat sich überraschender weise gezeigt, daß BVDU und/oder seine Metaboliten die Entstehung von kanzerogeninduzierten Genamplifi kationen verhindert oder zumindest abschwächt. Da durch wird die Möglichkeit eröffnet, durch gleichzei tige Gabe von BVDU und/oder seine Metaboliten mit einem Zytostatikum die Entstehung von Resistenzen gegenüber diesem Arzneimittel zu verhindern und auch den Grad der Malignität zu beeinflussen.

Es hat sich gezeigt, daß sowohl BVDU als auch seine Metaboliten verwendet werden können. Bei den Metabo liten ist hierbei besonders (E)-5-(2-Bromovinyl-)ura cyl (BVU) bevorzugt.

Die Erfindung betrifft weiterhin Arzneimittel zur Verhinderung der Resistenzenbildung gegenüber Zyto statikabehandlung, die BVDU und/oder seine Metaboli ten enthalten. BVDU bzw. seine Metaboliten sind dabei in der Formulierung des Arzneimittels in einer Menge enthalten, aus der eine Konzentration von 0,02 µg/ml bis 10 µg/ml im Blut resultiert. In Versuchen konnte gezeigt werden, daß der optimale Bereich bei 0,05 µg/ml bis 5 µg/ml liegt.

Die Zytostatika können dabei in den üblichen bisher bekannten Mengen in der Formulierung enthalten sein. Beispiele für Zytostatika sind Cyclophosphamid und andere Alkylantien, Antimetabolite wie Methotrexat, Alkaloide wie Vinblastin, Antibiotika wie Bleomycin, Cisplatin sowie andere Stoffe.

Die Träger-, Zusatz- und Hilfsstoffe entsprechen de nen, wie sie bisher aus dem Stand der Technik bekannt sind. Das Arzneimittel selbst kann dabei in fester oder flüssiger Form oder auch als Spray vorliegen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Modellver suchen näher erläutert.

A. Modellsubstanzen

Für die Untersuchung von Amplifikationsphänomenen dient eine Hamsterzellinie, die ein Virus (Simian Vi rus 40) im Genom integriert enthält. Bekannt ist für diese Zellinie, daß eine Zugabe genotoxischer Sub stanzen, aber auch verschiedener "nichtgenotoxischer" Kanzerogene und Tumor-Promotoren zur Amplifikation von SV40-DNA im Hamstergenom führt. Die Methode be ruht darauf, daß als Sonde dienende markierte SV40- DNA mit Hamsterzell-DNA, die SV40-DNA in amplifizier ter Kopienzahl enthält, hybridisiert wird. Die Menge gebundener Sonde gibt Aufschluß über den Amplifika tionsgrad der integrierten Virus-DNA.

Zur Bestimmung des Amplifikationsgrades wird gleich zeitig mit der SV40-DNA die Albumin-Gen-DNA gemessen. Das Albumin-Gen wird nämlich im Gegensatz zur SV40- DNA in der Zelle nicht amplifiziert. Der Wert des relativen SV40-DNA-Gehalts ergibt sich demnach aus dem Quotienten des Signals der mit SV40-DNA hybri disierten DNA-Sonde zu dem Signal der mit Albumin-Gen hybridisierten DNA-Sonde aus denselben SV40-transfor mierten embryonalen CO631-Hamsterzellen.

Als Modellsubstanzen dienten:

1. Mutagene und rekombinogene genotoxische Kanzero gene (Positiv-Kontrolle)
Triethylenmelamin (TEM)
4-Nitrochinolin 1-Oxid (4-NQO)
2. Nicht-Kanzerogene (Negativ-Kontrolle), welche weder Mutationen noch Rekombinationen induzieren
Aceton
Dimethylformamid
3. Co-rekombinogene Tumor-Promotoren
Mezerein
12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetat (TPA)
Chrysarobin
Coumarin
4. Rekombinogene nicht-genotoxische Kanzerogene mit unbekanntem Wirkmechanismus
Thioacetamid
Acetamid
5. Testosteron nach Metabolisierung durch Rattenle bermikrosomen (S9-Mix) sowie ohne S9-Mix
Testosteron wirkt
mit S9-Mix anti-rekombinogen und
ohne S9-Mix co-rekombinogen.

Die Wirkung der obengenannten Modellsubstanzen allein oder in Kombination mit einem Kanzerogen wurde im Genamplifikations-System untersucht.

Die Ergebnisse mit den Modellsubstanzen sind in den Fig. 1 bis 3 zusammengefaßt.

Die Nicht-Kanzerogene Aceton und Dimethylformamid zeigen keine Wirkung.

Alle anderen Substanzen, die nicht-genotoxischen Kan zerogene mit unbekanntem Wirkmechanismus, Thioaceta mid und Acetamid, die genotoxischen Kanzerogene TEM und 4-NQO sowie die Tumor-Promotoren Mezerein, 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetat (TPA), Chrysaro bin und Coumarin, für sich allein gegeben, erhöhen die SV40-Genamplifikation.

Teststeron erniedrigt mit S9-Mix die amplifizierende Wirkung von Methotrexate (MTX), ohne S9-Mix erhöht es die amplifizierende Wirkung von Amino-6-mercaptopurin (ANP).

Diese Ergebnisse zeigen eine Übereinstimmung zwischen der Auslösung von Rekombination und SV40-Genamplifi kation.

B. Hemmung kanzerogeninduzierter Genamplifikation durch (E)-5-(2-Bromovinyl-)-2′-deoxyuridin. (BVDU)

Die Ergebnisse sind in den Fig. 4 bis 7 zusammen gefaßt.

BVDU hatte im Versuch mit Hefen (Fig. 4) eine anti rekombinogene und co-mutagene Wirkung gezeigt. Diese Wirkung war in Gegenwart von Lebermikrosomen (S9-Mix) in niedrigeren Konzentrationen sichtbarer als in Ab wesenheit von S9-Mix und auch sehr viel ausgeprägter. Eine Metabolisierung von BVDU verstärkt also den antirekombinogenen Effekt.

BDVU zeigt in klinisch relevanten Dosen eine Hemmung AMP-induzierter Genamplifikation. Der Effekt setzt bei etwa 0,05 µg/ml ein und führt dosisabhängig bei 5 µg/ml zu einer vollständigen Hemmung der AMP-indu zierten Genamplifikation (Fig. 5).

Der unabhängige Wiederholungsversuch bestätigt das Ergebnis (Fig. 6). Darüber hinaus scheint BVDU al lein den spontanen Amplifikationsgrad leicht zu er niedrigen.

Zugabe von S9-Mix zeigt ebenfalls eine Erniedrigung ANP-induzierter Genamplifikation. Dieser erfolgt al lerdings in einem niedrigeren Dosisbereich als in den Versuchen ohne S9-Mix. Eine mögliche Metabolisierung von BVDU scheint den amplifikationshemmenden Effekt also noch zu verstärken (Fig. 7). Dies würde die Relevanz der Ergebnisse noch verstärken.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß BVDU kanzero geninduzierte Genamplifikation hemmt. Dies eröffnet die Möglichkeit, durch gleichzeitige Gabe von BVDU mit einem Zytostatikum die Entstehung von Resistenzen gegenüber diesem Arzneimittel zu verhindern und die Malignität zu erniedrigen.

C. Verhinderung der Bildung von "Multi-Drug-Resi stance" (MDR) in menschlichen und tierischen Tumorzellen gegenüber Zytostatikabehandlung durch gleichzeitige Gabe von BVDU

Die menschliche Tumorzellinie K562-WT (Fig. 8) und die Tumorzellinie F46-WT der Maus (Fig. 9) (WT = Wildtyp = empfindlich gegenüber Zytostatikabehandlung = keine Amplifikation des MDR-Gens) wurde über mehre re Wochen mit stufenweise steigenden Konzentrationen von Adriamycin behandelt. Im Laufe der Behandlung erwarben die Zellen eine Resistenz gegenüber dieser Behandlung. Wirken gegenüber nichtresistenten Zellen 20 ng/ml Adriamycin bei einer Behandlungszeit von 4 Tagen stark toxisch, so sind die Zellen nach Lang zeitbehandlung mit stufenweise steigenden Konzentra tionen gegenüber 20 ng/ml Adriamycin völlig unem pfindlich geworden (Fig. 8 und 9). Die Resistenz bildung beruht auf der Amplifikation des NDR-Gens. Nachgewiesen wird dies mit Hilfe der Northern-Tech nik, eines Verfahrens zum Nachweis von RNA-Molekülen, also der Transkription eines Gens, unter Einsatz des MDR-Gens als Sonde (Fig. 10). Resistente Zellen zei gen eine Bande, nichtresistente Zellen (Zustand am Beginn der Behandlung) zeigen keine Bande.

In Parallelversuchen wird Adriamycin mit entweder 0,5 oder 1 µg/ml BVDU zusammen gegeben (BDVU wirkt in menschlichen Tumorzellen erst ab etwa 10 µg/ml to xisch, in Zellen der Maus ab etwa 8 µg/ml (Fig. 8 und 9). BVDU verhindert die Resistenzbildung gegen über Adriamycin. Die Tumorzellen bleiben empfindlich gegenüber der Zytostatikabehandlung und sterben ab. Die Wirkung des BVDU ist so stark, daß die Behandlung durch Ruhepausen (Wachstum ohne Substanzen) unterbro chen werden muß, sich der Versuch also über 6 bis 8 Wochen erstreckt.

BVDU + Adiamycin-Behandlung führt zu einer wesentlich schwächeren Amplifikation des MDR-Gens als Adriamy cin-Behandlung allein (Fig. 10). Der Effekt der BVDU-Behandlung ist in Wirklichkeit noch sehr viel größer, als die Abschwächung der Bande ausdrückt. Am Ende der Behandlung bleiben nämlich nur Zellen übrig, die wenigstens eine gewisse Resistenz gegenüber der Adriamycin-Behandlung erworben haben. Die infolge der BVDU-Behandlung nichtresistent gebliebenen Zellen sind bereits vorher abgestorben. Der eigentlich rele vante und mit Hilfe der Northern-Technik nicht faß bare Effekt besteht deshalb im Absterben der nicht resistenten Zellen, welche in den Inaktivierungskur ven (Fig. 8 und 9) gemessen wird.

Da die Resistenzbildung gegenüber Zytostatikabehand lung in menschlichen Tumoren ebenfalls auf der Ampli fikation des MDR-Gens beruht, ist durch die Kombina tion von BVDU mit einem beliebigen Zytostatikum die Möglichkeit geboten, die Therapie in niedrigen Dosen und über längere Zeiträume als bisher durchzuführen. Im übrigen ist die Verhinderung der Resistenzbildung auch für andere Anwendungen von großer Bedeutung.

Claims

1. Verwendung von (E)-5-(2-Bromovinyl-)-2′-deoxy uridine (BVDU) und/oder seiner Metaboliten in Kombination mit mindestens einem Zytostatikum zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhin derung bzw. Reduzierung der Resistenzenbildung bei der Zytostatikabehandlung.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Metabolit (E)-5-(2-Bromovinyl-)-uracyl (BVU) verwendet wird.

3. Arzneimittel, enthaltend (E)-5-(2-Bromovinyl-)- 2′-deoxyuridine (BVDU) und/oder seine Metaboli ten in einer Menge, aus der eine Konzentration von 0,02 µg/ml bis 10 µg/ml im Blut resultiert, mindestens ein Zytostatikum und übliche Träger- und Hilfsstoffe.

4. Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Metabolit (E)-5-(2-Bromovinyl-)uracyl (BVU) ist.

5. Arzneimittel nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß BVDU und/oder seine Metaboliten in einer Menge enthalten sind, aus der eine Konzentration von 0,05 µg/ml bis 5 µg/ml im Blut resultiert.

6. Arzneimittel nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zytostatika aus gewählt sind aus Alkaloiden, Alkylantien, Anti metaboliten, Antibiotika oder Cisplatin.