KR100330602B1 - 세포증식억제처치에있어서내성형성에대한5'-치환뉴클레오시드의이용및이들뉴클레오시드류를함유하는약제 - Google Patents

세포증식억제처치에있어서내성형성에대한5'-치환뉴클레오시드의이용및이들뉴클레오시드류를함유하는약제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포증식억제 처리과정에서 내성 형성을 방해하거나 감소시키는 약제 생산을 위하여 적어도 1종 이상의 세포증식억제제와 함께 사용되는 5'-치환 뉴클레오시드의 이용 및 BVDU 및/또는 그의 대사물질을 함유하는 약제에 관한 것이다.

Description

세포증식 억제 처치(treatment)에 있어서 내성 형성에 대한 5'-치환 뉴클레오시드의 이용 및 이들 뉴클레오시드를 함유하는 약제{USE OF 5' SUBSTTUTED NUCLEOSIDES TO PROVIDE RESISTANCE IN CYTOSTATIC TREATMENT AND MEDICAMENTS CONTAINING SAID NUCLEOSIDES}
약제내성의 형성을 방해하는 일련의 물질이 알려져 있다. 이들중 일부는 단백질 분해효소 저해제의 항-발암효과에 관한 케네디의 논문에 개시되어 있다(Kennedy, A.R., Prevention of Carcinogenesis by Protease Inhibitors, Cancer Res., 54:1999-2005, 1994). 이러한 물질들은 발암물질에 의하여 유도된 유전자 증폭을 거의 정상수준으로 억제시킬 수 있다. 케네디는 방사선에 의해 유도되는 유전자의 증폭도 같은 방식으로 억제되고, 방사선에 의하여 유도되는 형질전환을 억제하는 능력과 일치하므로, 이들 두 과정간의 관계가 추정될 수 있음을 발견하였다. 또한 단백질분해효소-저해제는 생체의 형질전환의 개시과정에서 공동재조합성(co-recombinogenic) 종양 유도체의 길항제로 작용한다. 생체내 실험에서도 단백질분해효소 저해제는 또한 효과적인 항-프로모터임이 알려져 있다(Troll, W., Klassen, A., and Janoff, A. Tumorigenesis in mouse skin: inhibition by synthetic inhibitors of proteases. Science (Washington DC) 169:1211-1213, 1970).
베라파밀(verapamil)이 MDR 저해제인 것이 알려져 있다(Moscow, I.A., and Cowan, K.H. Multidrug resistance. J.Natl.Cancer Inst. 80:14-20, 1988). 이"칼슘 채널 방해물질(calcium channel blocker)"은 약제의 세포내 축적을 증가시킴으로써 세포독성을 증대시킨다. 이러한 현상은 P-당단백질 또는 다른 전달 단백질의 효과에 기인하는 것으로 보인다. 이들 및 이와 유사한 물질(예, 퀴니딘; quinidine)은 독성 때문에 임상적으로 사용될 수 없다.
암의 화학요법이 실패하는 주된 이유는 "약제 내성"의 발생이다. 초기에 세포증식 억제제에 민감하게 반응하는 종양은 어느 정도의 처리시간이 경과하면 빈번히 회복되어 다양한 종류의 항종양 약제의 효과에 대한 내성을 갖게 된다. 1948년 세포증식 억제제에 의한 암 치료법이 시작되면서부터, "약제 내성" 문제가 알려져 왔지만, 현재까지 내성 형성 방지법은 개발되지 않고 있다. 현재까지 조사된 높은 내성을 갖는 종양 및 세포주는 모두 작은 그룹에 속하는 유전자들이 증폭(증식)되어 있는 특징을 보인다. 이러한 DNA 또는 유전자의 증폭의 결과로서, 이들 유전자의 발현이 증가되어 약제에 대한 내성을 유도하는 것이다. DNA 증폭의 결과로서, 다양한 유전자의 증가된 발현이 입증될 수 있다. 따라서 세포로부터 셔틀 독소로 작용하는 보호단백질(P-당단백질)이 증가된 양으로 형성될 수 있다. 이러한 효과는 "복합-약제 내성(multi-drug resistance; MDR)"으로 또한 알려져 있다. MDR 외에도, 특정 유전자, 특히 특정 종양유전자의 증폭도는 악성의 정도와 관련이 있다. 따라서 위암에서 ERVV2, RASK1, INT3, HST, MYC 및 KSRAM이 증폭된 경우(Hirohasi,S., and Sugimura, T. Genetic alterations in human gastric cancer. Cancer cells (Cold Spring Harbor), 3:49-52, 1991)와, 난소 종양에서 ERBB2 및 MYC가 증폭된 경우(Sasano, H., Garrett, C.T., Wilkinson, D.S., Silverberg, S., Comerford, J., and Hyde, J. Protooncogene amplification and tumor ploidy in human ovarian neoplasm. Hum.Pathol., 21:382-391, 1990) 생존가능성이 극히 희박하다. 유방암에서 MYC의 증폭(Borg, A., Baldetorp, B., Ferno M., Olsson, H., and Sigurdsson, H. C-myc amplification is an independent prognostic factor in postmenopausal breast cancer. Int. J. Cancer, 51:687-691, 1992)과 INT2 및 HST1의 동시증폭(Borg, A., Sigurdsson, H., Clark, G..M., et al., Association of INT2/HST1 coamplification in primary breast cancer with hormone-dependent phenotype and poor prognosis. Br.J.Cancer, 63:136142, 1991)은 병의 진행과 관련이 있다. ERBB2(Descotes, F., Pavy, J.-J., and Adessi, G.L. Human breast cancer: Correlation study between HER-2/neu amplification and prognostic factors in an unselected population. Anticancer Res., 13:119-124, 1993)과 EGFR(Klijn, J.G.M., Berns, P.M.J.J., Schmitz, P.I.M., and Foekens, J.A. The clinical significance of epidermal growth factor receptor (EGF-R) in human breast cancer: a review on 5232 patients. Endocr.Rev., 13:3-17, 1992)의 증폭은 증상의 경과에 대한 예측을 어렵게 한다. 식도암에서 HST1 및 INT2의 동시 증폭은 종양세포의 전이의 정도와 관련있다(Experiment, T., Tahara, E., Kajiyama, G., Sakamoto, H., Terada, M., and Sugimura, T. High incidence ofcoamplification of hst-1 and int-2 genes in human esophageal carcinomas. Cancer Res. 49:5505-5508, 1989). 요약하면, 발암성 세포증식 억제제의 지속적인 처치에 의하여 유도된 유전자 증폭은 그 처치에 대한 내성을 유발할 뿐 아니라, 악성의 정도를 조절하는 특정 종양유전자의 과도한 발현을 초래한다.
도 1 내지 도 3은 각종 유전자증폭 유발물질이 중국 햄스터 세포에서 DNA 증폭에 미치는 효과를 보여주는 도표이며,
도 4는 TEM에 대한 BVDU 및 S9-Mix의 효과를 보여주는 도표이며,
도 5 및 도 6은 AMP에 대한 BVDU의 효과를 보여주는 도표이며,
도 7은 AMP에 대한 BVDU 및 S9-Mix의 효과를 보여주는 도표이며,
도 8 및 도 9는 인간 종양세포 K562-WT 및 마우스 종양세포 F46-WT에서 아드리아마이신에 대한 BVDU의 효과를 보여주는 도표이며,
도 10은 아드리아마이신에 대한 BVDU의 효과를 보여주는 노던 블롯 분석결과 사진이며,
도 11 및 도 12는 TEM에 대한 5'-치환 뉴클레오시드의 효과를 보여주는 도표이며,
도 13 및 도 14는 아드리아마이신에 대한 5'-치환 뉴클레오시드의 효과를 보여주는 도표이며,
도 15는 아드리아마이신에 대한 5'-치환 뉴클레오시드의 효과를 보여주는 노던 블롯 분석결과 사진임.
이러한 관점에서 본 발명은 세포증식 억제제 처치에 대한 내성 형성을 저해하거나 감소시키기에 효과적인 물질 및 그에 상응한 약제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그 물질에 관한 목적은 제1항의 특징들에 의해 그리고 약제에 대하여는 제9항의 특징들에 의해 달성된다.
따라서 본 발명은 내성 형성을 저해하거나 감소시키기 위해, 세포증식 억제제와 동시에 5'-치환 뉴클레오시드의 투여를 제시한다. 놀랍게도 5'-치환 뉴클레오시드가 발암물질에 의하여 유도되는 유전자 증폭을 방지하거나 최소한 약화시키는 효과가 있음이 분명해졌다. 이 사실은 이들 뉴클레오시드와 세포증식 억제제의 동시투여에 의하여 약제에 대한 내성 발생을 방지하고 악성 정도에 영향을 줄수 있다는 가능성을 제공한다.
5'-뉴클레오시드의 예로: 5-(2-브로모비닐)-2'-데옥시우리딘(BVDU), (E)-5-(2-브로모비닐)-우라실(BVU), (E)-5-(2-브로모비닐)-1-β-D-아리비노푸라노실우라실, (E)-5-(2-브로모비닐)-2'-데옥시-4'-티오우리딘, 5-요오도-2'-데옥시시티딘, 5-요오도-2'-데옥시우리딘 및 2'-데옥시-5-트리플루오로메틸우리딘이 있으며 특히 BVDU와 BVU가 바람직하다.
또한 본 발명은 세포증식 억제 처치에 대한 내성 형성을 저해하기 위한 약제에 관한 것으로, 이 약제는 5'-뉴클레오시드를 함유한다. 5'-뉴클레오시드는 혈액내에서 농도가 0.02㎍/㎖∼10㎍/㎖로 되게 하는 양으로 약제의 조성물에 함유된다. 실험에 의하면 0.05㎍/㎖∼5㎍/㎖가 최적 범위인 것으로 밝혀졌다.
세포증식 억제제는 이전에 규정된 분량이 조성물에 포함될 수 있다(Oshiro, Y., Piper, C.E., Balwierz, P.S., and Garriot, M.L. (1992) Genotoxic properties of (E)-5(2-bromovinyl)-21-deoxyuridine (BVDU). Fundamental and Applied Toxicology, 18, 491-498). 세포증식 억제제의 예로는 시클로포스포아미드와 기타 알킬화제, 메토트렉세이트같은 항-대사물질, 빈블라스틴같은 알칼로이드, 블레오마이신같은 항생제, 시스플라틴(cisplatin) 및 기타 물질이 있다. 세포증식 억제제의 다른 예는 "Red List 1995"(Editio Cantor Verlag fur Medizin and Naturwissenschaften, Aulendorf/Wurtt. 1995)에서 찾아볼 수 있다.
담체, 첨가제 및 보조물질은 선행기술에 알려져 있는 것들과 같다. 상기 약제는 고체상 또는 액체상으로 존재할 수도 있고 스프레이 형태로 존재할 수도 있다.
이하 본 발명을 실시예를 참고로 하여 상세히 설명한다.
본 발명에서는 소정의 약제를 사용하는 것을 "투여", "처리" 또는 "처치"라는 용어로 표현한다.
(실시예 1)
모델 물질
게놈내에 통합되어 있는 바이러스(simian 바이러스 40: SV40)를 함유하는 햄스터 세포주에서의 유전자 증폭현상이 조사되었다. 이 세포주에 유전독성(genotoxic) 물질뿐 아니라 다양한 비-유전독성 발암물질과 종양 유도물질이 투여되면 햄스터의 게놈내에서 SV40-DNA가 증폭된다는 사실이 알려져 있다. 이 방법은 표지된 SV40-DNA 프로브가, 증폭된 수로 SV40-DNA를 함유하고 있는 햄스터 세포- DNA와 혼성화된다는 사실에 근거한다. 결합된 프로브의 양에 의하여 통합되어 있는 바이러스-DNA의 증폭정도를 판단할 수 있다.
증폭도를 결정하기 위해서는 SV40-DNA와 동시에 난백(albumen)-유전자-DNA를 측정하여야 한다. SV40-DNA와는 달리, 난백-유전자는 햄스터 세포에서 증폭되지않는다. 따라서 SV40으로 형질전환된 CO631 햄스터 배아세포 유래의 난백유전자와 혼성화된 DNA 프로브의 시그날과, SV40-DNA와 혼성화된 DNA 프로브의 시그날의 비율로부터 SV40-DNA의 상대적 값이 도출된다.
모델 물질은 아래와 같다.
(1) 돌연변이물질과 재조합성 유전독성 발암물질(정-대조군: positive-control)
·트리에틸렌멜라민(TEM) 4-니트로키놀린
·1-옥시드(4-NQO)
(2) 돌연변이와 재조합을 유발하지 아니하는 비-발암물질(부-대조군: negative-control)
·아세톤
·디메틸포름아미드
(3) 공동재조합성 종양-유도물질
·메제레인(mezerein)
·12-O-테트라데카노일-포르볼-13-아세테이트(TPA)
·크리사로빈(chrysarobin)
·코우마린(coumarin)
(4) 기작이 알려져 있지 않은 재조합성 비-유전독성 발암물질
·티오아세트아미드
·아세트아미드
(5) 테스토스테론
각각의 모델 물질에 대하여 S9-Mix가 첨가되는 경우와 첨가되지 않는 경우의 유전자 증폭효과를 실험하였다.
상기 모델 물질의 단독 효과, 또는 발암물질과의 결합에 의한 효과가 유전자 증폭 시스템(중국 햄스터)에서 실험되었으며 그 결과가 도 1∼도 3에 도시되어 있다.
비발암물질인 아세톤과 디메틸포름아미드는 아무런 효과를 보이지 않는다.
그 외에 기작이 알려져 있지 않은 비-유전독성 발암물질인 티오아세트아미드와 아세트아미드, 유전독성 발암물질인 TEM과 4-NQO 및 종양 유도물질인 메제레인, 12-0-테트라데카노일-포르볼-13-아세테이트(TPA), 키르사로빈과 코우마린(coumarin) 등은 독자적으로 SV40 유전자를 증폭시킨다.
이러한 결과는 재조합의 개시와 SV40 유전자의 증폭이 일치됨을 보여주는 것이다.
(실시예 2)
(E)-5-(2-브로모비닐)-2'-데옥시우리딘(BVDU)에 의한 발암물질-유도 유전자 증폭의 저해
도 4에 도시된 바와 같이, 효모를 이용한 실험에서, BVDU는 항-재조합성 및 공동-돌연변이성 효과를 보였다. 이러한 효과는 S9-Mix가 존재하지 않는 경우보다 저농도에서 간(liver) 미크로솜(S9-Mix)의 존재시에 더욱 가시화되고 더욱 명료해졌다. 따라서 BVDU의 대사는 항-재조합성 효과를 강화시킨다.
BVDU의 임상적 투여량에서 AMP-유도성 유전자 증폭의 저해를 보인다. 이러한 저해효과는 투여량에 의존적인 바 약 0.05㎍/㎖ 정도에서 효과가 시작되면 5㎍/㎖에서 완전 저해된다(도 5 참고).
도 6에 도시된 대로, 이러한 결과는 독립적인 반복실험에 의하여 재확인된다. BVDU 단독으로는 자연발생정도의 증폭을 조금 밖에 감소시키지 못하는 것으로 나타난다.
S9-Mix의 첨가는 마찬가지로 AMP-유도성 유전자 증폭을 감소시킨다. 그러나 그 효과는 S9-Mix가 존재하지 않는 실험에서 보다 낮은 투여량 범위에서 나타난다. 따라서 BVDU의 가능한 대사에 의하여 증폭저해효과가 더욱 강화되는 것으로 보인다(도 7).
S9-Mix의 처리는 메토트렉세이트(MTX)의 증폭효과를 감소시키고, S9-Mix를 처리하지 않으면 아미노-6-메르캅토퓨린(AMP)의 증폭효과가 증대된다(도 6, 7).
요약하면, BVDU가 발암물질에 의하여 유도되는 유전자 증폭을 방해한다는 것이다. 이러한 사실은 세포증식 억제제와 함께 BVDU를 투여하면 억제제에 대한 내성발생을 저해하고 악성화를 낮출 수 있다는 가능성을 보여준다.
(실시예 3)
BVDU가 동시투여되는 세포증식 억제제 처치에 대한 인간 및 동물 종양세포의 "복합-약제 내성(MDR)" 형성 저해
아드리아마이신 농도를 단계적으로 증가시키면서 몇주에 걸쳐 인간 종양 세포주 K562-WT(도 8)과 마우스 종양 세포주 F46-WT(도 9)에 처리하였다. 여기서 WT는 야생종을 의미하며, 세포증식 억제제 처리에 민감하고 MDR-유전자의 증폭이 없는 세포주를 의미한다(이하 같음). 처리과정동안 세포는 상기 처리에 대한 내성을 획득하였다. 비-내성 세포에서는, 20ng/㎖의 아드리아마이신의 4일간 처리는 강한 독성을 보임에 반하여, 장기간 단계적으로 농도를 증가시킨 처리군의 세포는 20ng/㎖의 아드리아마이신에 전혀 영향을 받지 않았다(도 8, 9). MDR 유전자를 프로브로 사용하는 RNA 분자 즉, 유전자 전사, 검색법인 노던법(Northern Technique)에 의하면, 이 저항력의 형성은 MDR 유전자의 증폭에 기인한 것임을 알 수 있다(도 10). 내성세포는 밴드를 보이지만 비-내성 세포(처리 초기의 세포)는 밴드가 나타나지 않는다.
대조실험에서, 0.5 또는 1.0㎍/㎖의 BVDU와 아드리아마이신을 동시에 처방하였다(BVDU는 인간 종양세포에서는 약 10㎍/㎖, 마우스 세포에서는 약 8㎍/㎖에서부터 독성이 나타낸다; 도 8, 9). BVDU는 아드리아마이신에 대한 내성 형성을 방해하기 때문에 BVDU가 함께 처리된 종양세포는 세포증식 억제제에 대한 민감성이 유지되고 따라서 사멸된다. BVDU의 효과는 매우 강력하여 중간에 휴지기(약제처리없는 생장기간)가 있어야 하기 때문에 실험기간이 6∼8주 정도로 길어진다.
BVDU+아드리아마이신 처리는 아드리아마이신 단독처리에 비하여 MDR 유전자의 증폭을 현저하게 약화시킨다(도 10). BVDU 처리의 효과는 노던법에 의하여 나타나는 밴드의 감소로 추측되는 것보다 실제로 훨씬 강력하다. 즉, 처리의 말기에는 아드리아마이신 처리에 대하여 최소한 어느 정도의 내성을 획득한 세포만 남고, BVDU 처리결과로 비-내성 상태가 유지되는 세포는 이미 이전에 사멸된다. 비-내성 세포의 사멸이라는 실제 효과는 노던법으로 검출되지 않으며, 이는 도 8과 도9의 비활성 커브를 측정하여 알 수 있다.
마찬가지로, 인간 종양의 세포증식 억제제에 대한 내성 형성은 MDR 유전자의 증폭에 기인하는 것으로 판단되기 때문에, 적절한 세포증식 억제제와 BVDU의 조합은 종래에 비하여 낮은 용량과 장기간에 걸쳐 치료법을 수행할 수 있는 가능성을 제시한다. 또한 내성 형성의 방해는 여타의 다른 약제의 적용에도 매우 중요하다.
(실시예 4)
항-재조합성 5'-치환 뉴클레오시드의 동시투여에 의한 종양세포의 세포증식 억제제 처리에 대한 "복합-약제 내성(MDR)"의 형성 저해
도 11과 12에서 볼 수 있는 바와 같이 항-재조합성 효과는 BVDU 뿐 아니라 모든 5'-치환 뉴클레오시드의 특성이다.
도 11은Saccharomyces cerevisiaeMP1에서 (E)-5-(2-브로모비닐)-21-데옥시우리딘, (E)-5-(2-브로모비닐)-1-β-D-아라비노푸라노실-우라실 및 (E)-5-(2-브로모비닐)-21-데옥시-41-티오우리딘의 항-재조합성 효과를 보여준다.
도 12는S. cerevisiaeMP1에서 5-요오도-2'-데옥시시티딘, 5-요오도-2'-데옥시우리딘 및 2'-데옥시-5-트리플루오로메틸우리딘의 항-재조합성 효과를 나타낸다.
마우스의 종양 세포주 F46-WT에 대하여 아드리아마이신의 농도를 단계적으로 증가시키면서 몇주에 걸쳐 처리하였다. 처리과정에서 세포들은 이 처리에 대한 내성을 갖게 되었다. 20ng/㎖의 아드리아마이신의 4일간의 처리는 비-내성 세포들에는 극심한 독성 효과를 보였으나, 농도가 증가되는 단계적인 긴 기간동안의 처리뒤의 세포는 20ng/㎖의 아드리아마이신에 전혀 영향받지 않게 되었다(도 13, 14). 내성의 형성은 MDR 유전자의 증폭에 기인한다. MDR 유전자를 프로브로 사용하는 RNA 분자 즉, 유전자 전사, 검색법인 노던법에 의하여, 이 사실이 확인되었다(도 15). 내성세포는 밴드를 보이지만 비내성 세포(처리 초기 세포)에는 밴드가 나타나지 않는다. 비교를 위해 β-액틴 mRNA의 수준을 마찬가지로 분석하였다. β-액틴은 RNA의 량에 대한 내부 대조군으로 사용하였다.
대조실험에서 각각의 5'-치환 뉴클레오시드 1㎍/㎖와 함께 아드리아마이신을 투약하였다. 5'-치환 뉴클레오시드 6종 모두 아드리아마이신에 대한 내성 형성을 저해한다. 종양세포는 세포증식 억제제에 대한 민감성을 유지하게 되므로, 사멸한다. 5'-치환 뉴클레오시드의 효과는 매우 강력하여 중간에 휴지기(약제처리없는 생장기간)가 있어야 하기 때문에 실험기간이 6∼8주 정도 길어진다.
RNA의 노던 블롯 분석이 도 15에 도시되어 있다:
마우스의 종양 세포주 F46-WT에서의 MDR 유전자의 발현을 실험하였다. 대조를 위하여 β-액틴 mRNA의 수준을 마찬가지로 분석하였다. β-액틴은 RNA 함량에 대한 내부 대조군으로 사용하였다. 실험군에 따라 아드리아마이신 외에 다음 표와 같은 약제를 각각 1㎍/㎖씩 동시 투약하였다.
대조군명 균주 처리
pos. 아드리아마이신-내성F46-WT 세포
neg. 아드리아마이신-민감성F46-WT 세포
1 F46-WT 세포 (E)-5-(2-브로모비닐)-2'-데옥시우리딘
2 F46-WT 세포 (E)-5-(2-브로모비닐-1-β-D-아라비노푸라노실-우라실
3 F46-WT 세포 (E)-5-(2-브로모비닐-2'-데옥시-4'-티오우리딘
4 F46-WT 세포 5-요오도-2'-데옥시시티딘
5 F46-WT 세포 5-요오도-2'-데옥시우리딘
6 F46-WT 세포 2'-데옥시-5-트리플루오로메틸우리딘
7 F46-WT 세포 (E)-5-(2-브로모비닐)-2'-데옥시우리딘(BVDU)
아드리아미이신 단독처리보다 5'-치환 뉴클레오시드+아드리아마이신 동시처리가 MDR-유전자의 증폭을 현저하게 약화시킨다(도 15). 처리효과는 밴드의 약화로 표현되는 것보다 훨씬 강력하다. 즉, 처리의 말기에는 단지 아드리아마이신 처리에 대하여 최소한의 내성을 획득한 세포만이 남는다. BVDU 처리 결과로 비내성 상태로 있던 세포는 이미 이전에 사멸된다. 그러므로, 노던법으로 검출되지 않는 실제적으로 상대적 효과는 비-내성 세포의 사멸로 이루어지고, 이는 비활성 커브를 측정하여 알 수 있다(도 13, 14).
본 발명은 각종의 암 또는 종양에 대한 세포증식 억제제 처치에 있어서 억제제 처치에 대한 저항력 즉, 내성의 형성을 저해하거나 감소시키기 위하여 5'-치환 뉴클레오시드가 함유된 세포증식 억제제 약제를 제공한다.

Claims (2)

  1. 세포증식 억제제의 처치에 대한 내성을 유발하는 유전자의 증폭 및 발현을 방지하는 항종양제로, (E)-5-(2-브로모비닐-)-2´-데옥시우리딘(BVDU) 및 1종 이상의 세포증식 억제제를 포함하며, 세포증식 억제제는 BVDU 및/또는 5-플루오로우라실(5-FU)이 아닌 것을 특징으로 하는 항종양제.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포증식 억제제는 알칼로이드, 알킬화제, 항-대사물질, 항생제 또는 시스-플라틴에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항종양제.
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