JPH11502515A - 細胞増殖抑制剤処理における耐性形成に対する５’置換ヌクレオシドの利用と、このヌクレオシドを含む医薬品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞増殖抑制療法の間の耐性の形成を予防もしくは軽減する医薬品を製造するために５’置換ヌクレオシドを少なくとも１種類の細胞増殖抑制剤と組み合わせた利用と、ＢＶＤＵまたはその代謝生成物あるいはその両方を含む医薬品に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞増殖抑制剤処理における耐性形成に対する５’置換 ヌクレオシドの利用と、このヌクレオシドを含む医薬品 「薬剤耐性」は癌の薬物療法の失敗の主たる理由である。当初は細胞増殖抑制 剤に極めて鋭敏に反応する腫瘍が、ある治療期間の後には勢いを取り戻すことが 非常に多く、その後は種々のタイプの抗腫瘍薬の作用に耐性となる。「薬剤耐性 」の問題は細胞増殖抑制剤による癌の治療が始まった１９４８年以来知られてい たが、耐性形成を防ぐ方法は今日に至るまで見つかっていない。現在まで研究さ れてきた高度耐性の腫瘍および細胞株の特性は小グループの遺伝子の増幅（増殖 ）である。このＤＮΛすなわち遺伝子の増幅の結果として、これらの遺伝子の発 現増加が示され、それによって薬剤に耐性となる。このＤＮＡ増幅の結果、種々 の遺伝子の発現増加が証明できる。毒素を細胞外に輸送する役割を果たす保護タ ンパク質が増量生成する（ｐ−糖タンパク質）。また、この作用は「多剤耐性」 （ＭＤＲ）の名でも知られている。 ＭＤＲに加えて、ある遺伝子、中でも癌遺伝子の増幅度は悪性度と相関してい る。従って胃癌でＥＲＶＶ２、ＲＡＳＫＩ、ＩＮＴ３、ＨＳＴ１、ＭＹＣ、ＫＳ ＲＡＭがある場合（Ｓ．ヒロハシ、Ｔ．スギムラ、「Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅ ｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ」、Ｃａｎ ｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、３：４９−５ ２、１９９１）と卵巣癌でＥＲＢＢ２、ＭＹＣがある場合（Ｈ．ササノ、Ｃ．Ｔ Ｇａｒｒｅｔｔ、Ｄ．Ｓ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｓ．Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇ、Ｊ ．Ｃｏｍｅｒｆｏｒｄ、Ｊ．Ｈｙｄｅ、「Ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｍ ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｐｌｏｉｄｙ ｉｎ ｈｕｍａ ｎ ｏｖａｒｉａｎ ｎｅｏｐｌａｓｍ」、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．、２１：３ ８２−３９１、１９９０）には生存の可能性は極めて乏しい。乳癌では、ＭＹＣ の増幅（Ａ．Ｂｏｒｇ、Ｂ．Ｂａｌｄｅｔｏｒｐ、Ｍ．Ｆｅｒｎｏｅ、Ｈ．Ｏｌ ｓ ｓｏｎ、Ｈ．Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ、「Ｃ−ｍｙｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ ｎ ｉｓ ａｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏ ｒ ｉｎ ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ」、Ｉ ｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５１：６８７−６９１，１９９２）とＩＮＴ２、ＨＳ Ｔ１の共増幅（Ａ．Ｂｏｒｇ、Ｈ．Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ、Ｇ．Ｍ．Ｃｌａｒｋ ら、「Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＮＴ２／ＨＳＴ１ ｃｏａｍｐｌｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔ ｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｐ ｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ」、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６３：１３６１４２ 、１９９１）が疾病の進行と相関する。ＥＲＢＢ２の増幅（Ｆ．Ｄｅｓｃｏｔｅ ｓ、Ｊ．−Ｊ．Ｐａｖｙ、Ｇ．Ｌ．Ａｄｅｓｓｉ、「Ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ＨＥ Ｒ−２／ｎｅｕ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ａｎ ｕｎｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ 」、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１３：１１９−１２４、１９９３）とＥ ＧＦＲ（Ｊ．Ｇ．Ｍ．Ｋｌｉｊｎ、Ｐ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．Ｂｅｒｎｓ、Ｐ．Ｉ．Ｍ． Ｓｃｈｍｉｔｚ、Ｊ．Ａ．Ｆｏｅｋｅｎｓ、「Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉ ｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏ ｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦ−Ｒ）ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎ ｃｅｒ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ ５２３２ ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｅｎｄｏｃ ｒ．Ｒｅｖ．、１３：３−１７、１９９２）は予後不良と関連がある。食道癌で はＨＳＴ１とＩＮＴ２の共増幅が浸潤度と相関する（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，Ｔ ．、Ｅ．タハラ、Ｇ．カジヤマ、Ｈ．サカモト、Ｍ．テラダ、Ｔ スギムラ、「 Ｈｉｇｈ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｓｔ−１ ａｎｄ ｉｎｔ−２ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｓｏｐ ｈａｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４９：５５０ ５−５５０８、１９８９）。要約すると、発癌性細胞増殖抑制剤による長期治療 により誘発された遺伝子増幅によって、この治療に対する耐性だけではなく悪性 度を制御するある癌遺伝子が過発現されると主張できる。 獲得した薬剤耐性に拮抗作用する一連の化合物が記述されている。その中には 蛋白質分解酵素阻害剤の抗癌効果に関するケネディの研究書（Ａ．Ｒ．Ｋｅｎｎ ｅｄｙ、「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５４ ：１９９９−２００５、１９９４）がある。これらの化合物は発癌物質によって 誘発された遺伝子増幅をほぼ通常の水準に抑えることができる。ケネディは、放 射線誘発悪性転換抑制能に対応して放射線誘発遺伝子増幅が抑制されたことを観 察したが、これによってこれら２過程間の関係が仮定された。加えて、蛋白質分 解酵素阻害剤は試験管内における悪性転換の際に（共組換え発生）腫瘍誘発剤の 拮抗剤の役割を果たす。また、蛋白質分解酵素阻害剤は試験管内の実験における 効果的な抗プロモーターとしても記述されている（Ｗ．Ｔｒｏｌｌ、Ａ．Ｋｌａ ｓｓｅｎ、Ａ．Ｊａｎｏｆｆ、「Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｏｕｓ ｅ ｓｋｉｎ：ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｎｈｉｂ ｉｔｏｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔ ｏｎ ＤＣ）１６９：１２１１−１２１３、１９７０）。 Ｉ．Ａ．Ｍｏｓｃｏｗ、Ｋ．Ｈ．Ｃｏｗａｎ、「Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓ ｉｓｔａｎｃｅ」、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１４−２０ 、１９８８からベラパミールが抗ＭＤＲ作用をすることが分かる。この「カルシ ウム拮抗薬」は細胞内薬剤蓄積を増大させることによって細胞毒性を強化する。 これは恐らくＰ−糖タンパクその他の輸送タンパク質に対する効果によって起き る。上記及び例えばキニジンなどの類似化合物は毒性があるため、医療には不適 である。 この点から、本発明の目的は、細胞増殖抑制剤による治療に対する耐性形成を 予防または軽減するのに有効な化合物を提案し、対応する医薬品を提案すること である。 この化合物に関する目的は請求項１の特性を表わす特徴によって達成され、医 薬品に関する目的は請求項９によって達成される。 従って、本発明によると５’置換ヌクレオシドと細胞増殖抑制剤の同時投与に よる耐性形成の予防または軽減が提案される。意外にも５’置換ヌクレオシドに よって発癌物質誘発性の遺伝子増幅が予防または減弱されることが明らかとなっ た。このことから、本薬剤に対する耐性の発生を予防する可能性が与えられ、ま たこれらのヌクレオシドを細胞増殖抑制剤と同時投与することによって悪性度に 影響を及ぼす可能性が与えられる。 以下は５’ヌクレオシドの実例である。５−（２−ブロモビニル−２’−デオ キシウリジン（ＢＶＤＵ）、（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−１−β−Ｄ− アラビノフラノシルウラシル、（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオ キシ−４１−チオウリジン。第２図：５−ヨード−２’−デキシシチジン、５− ヨード−２’−デオキシウリジン、２’−デオキシ−５−トリフルオロメチルウ リジン、特に好ましいのはＢＶＤＵと（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）ウラシ ル（ＢＶＵ）である。 さらに本発明は細胞増殖抑制剤処理に対する耐性形成を予防するための医薬品 に関し、前記医薬品は５’ヌクレオシドを含む。５’ヌクレオシドは血中濃度が ０．０２μｇ／ｍＬないし１０μｇ／ｍＬとなるような量が医薬品製剤中に含ま れる。最適範囲は０．０５μｇ／ｍＬないし５μｇ／ｍＬであることが実験的に 示されている。 細胞増殖抑制剤は製剤中に予め通常量含ませることができる（Ｙ．Ｏｓｈｉｒ ｏ、Ｃ．Ｅ．Ｐｉｐｅｒ、Ｐ．Ｓ．Ｂａｌｗｉｅｒｚ、Ｍ．Ｌ．Ｇａｒｒｉｏｔ （１９９２）、「Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ （Ｅ）− ５（２−ｂｒｏｍｏｖｉｎｙｌ）−２１−ｄｅｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＢＶＤＵ ）」、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇ ｙ、１ ８、４９１−４９８）。細胞増殖抑制剤の実例はシクロホスファミドその他のア ルキル化剤、メトトレキセートなどの代謝拮抗物質、ビンブラスチンなどのアル カロイド、ブレオマイシン、シスプラチンなどの抗生物質、その他の物質等であ る。細胞増殖抑制剤のその他の実例は「Ｒｅｄ Ｌｉｓｔ １９９５」、Ｅｄｉ ｔｉｏ Ｃａｎｔｏｒ Ｖｅｒｌａｇ ｆｕｅｒ Ｍｅｄｉｚｉｎ ｕｎｄ Ｎ ａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ、Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ／Ｗｕｅｒｔｔ． 、１９９５に見られる。 担体、添加剤、補助剤は以前より従来の技術から公知のものに相当する。薬剤 自体は固体または液体、さらには噴霧剤の剤形にすることができる。本発明はモ デル実験を参照することによって、より詳細に説明されよう。 Ａ．モデル化合物 増幅現象の研究に使用される細胞としてゲノム中に組み込まれたウイルス（シ ミアンウイルス４０）を含むハムスター細胞株がある。この細胞株は、遺伝毒性 化合物の添加ばかりではなく種々の「非遺伝毒性」発癌物質および腫瘍誘発剤に よってハムスターのゲノム中におけるＳＶ４０−ＤＮＡが増幅することが知られ ている。その方法は、プローブの役目をする増幅された数のＳＶ４０−ＤＮΛを 含むハムスター細胞−ＤＮＡによって標識されたＳＶ４０−ＤＮＡがハイブリダ イズされるという事実に基づいている。結合したプローブの量によると組み込ま れたウイルスＤＮＡの増幅度が洞察される。 増幅度を決定するためＳＶ４０−ＤＮＡと同時に胚乳−遺伝子−ＤＮＡを測定 した。胚乳−遺伝子は、ＳＶ４０−ＤＮＡと異なり、細胞中で増幅していなかっ た。よって相対ＳＶ４０−ＤＮＡ含有率は、ＳＶ４０−ＤＮＡとハイブリダイズ したＤＮＡプローブの測定強度を同一のＳＶ４０で形質転換したハムスター胚細 胞ＣＯ６３１由来の胚乳遺伝子とハイブリダイズしたＤＮＡプローブの測定強度 で除した商から得られる。 以下の物質をモデル化合物とした。 １．変異原性物質および組換え誘発遺伝毒性発癌物質（陽性対照） トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）４−ニトロキノリン１−オキシド（４−ＮＱ Ｏ） ２．突然変異も組換えも誘発しない非発癌物質（陰性対照） アセトン ジメチルホルムアミド ３．共組換え誘発腫瘍誘発剤 メゼレイン １２−０−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ） クリサロビン クマリン ４．作用機序が未知の組換え誘発非遺伝毒性発癌物質 チオアセトアミド アセトアミド ５．ラット肝臓ミクロソーム（Ｓ９−ミックス）による代謝後の実験とＳ９−ミ ックスを使用しない実験 実験操作 Ｓ９−ミックス抗組換え剤ありおよびＳ９−ミックス共組換え剤なし 上に挙げたモデル化合物単独または発癌物質との組合せの効果を遺伝子増幅系 で試験した。 モデル化合物による結果を第１図から第３図に示す。 非発癌物質であるアセトンとジメチルホルムアミドは効果を示さなかった。 その他の全ての化合物、すなわち未知の作用機序をもつ非遺伝毒性発癌物質、 チオアセトアミドおよびアセトアミド、遺伝毒性発癌物質ＴＥＭおよび４−ＮＱ Ｏ、腫瘍誘発剤メゼレイン、１２−０−テトラデカノイル−ホルボール−１３− アセテート（ＴＰＡ）、クリサロビンおよびクマリンは単独でＳＶ４０の遺伝子 増幅を増大させる。 Ｓ９−ミックスを加えた実験によると、メトトレキセート（ＭＴＸ）の増幅効 果が減少し、Ｓ９−ミックスがないとアミノ−６−メルカプトプリン（ＡＭＰ） の増幅効果が増大する。 これらの結果から、組換え開始とＳＶ４０遺伝子増幅の一致が示される。 Ｂ．（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン（ＢＶＤＵ） による発癌物質誘発遺伝子増幅の抑制 結果を第４図から第７図に整理する。 酵母での実験では（第４図）、ＢＶＤＵは抗組換え誘発および共変異原効果を 示した。この効果は低濃度の肝臓ミクロソーム（Ｓ９−ミックス）が存在する状 態でＳ９−ミックスが無い場合よりもよく認められ、ずっと明確であった。この ように、ＢＶＤＵの代謝によると抗組換え誘発効果が強化される。 ＢＶＤＵは臨床的に適切な投与量でＡＭＰ誘発遺伝子増幅の抑制を示す。この 効果は約０．０５μｇ／ｍＬで急に現れ、用量に応じて５μｇ／ｍｌでＡＭＰ誘 発遺伝子増幅を完全に抑制する（第５図）。 独立の反復実験により結果を確認した（第６図）。加えて、ＢＶＤＵ単独では 自発的増幅度の僅かな低下を示す。 Ｓ９−ミックスを添加しても同様にＡＭＰ誘発遺伝子増幅の低下を示す。しか し、これはＳ９−ミックスを使用しない実験よりも低い用量範囲で起きる。可能 性のあるＢＶＤＵの代謝はさらにこのように現れ、増幅抑制効果を強化する（第 ７図）。このことから結果の妥当性がさらに強調されよう。 要約すると、ＢＶＤＵは発癌物質誘発遺伝子増幅を抑制すると言える。このこ とから、ＢＶＤＵを細胞増殖抑制剤と同時投与することによって、この薬剤に対 する耐性の発生を予防し、悪性度を低下させる可能性が開かれる。 Ｃ．ＢＶＤＵの同時投与によるヒトおよび動物腫瘍細胞における細胞増殖抑制剤 に対する「多剤耐性」（ＭＤＲ）の形成予防 ヒト腫瘍細胞株Ｋ５６２−ＷＴ（第８図）およびマウスの腫瘍細胞株Ｆ４６− ＷＴ（第９図）（ＷＴ−野生型−細胞増殖抑制剤に感受性−ＭＤＲ遺伝子の増幅 なし）を数週間にわたって段階的に濃度を上昇させたアドリアマイシンによって 処理した。細胞処理中に、この処理に対する耐性を獲得した。非耐性細胞ではア ドリアマイシン２０ｎｇ／ｍＬ処理期間４日間で強い毒性効果があるのにもかか わらず、濃度を段階的に高めた長期処理後の細胞はアドリアマイシン２０ｎｇ／ ｍＬに対して全く感受性がなかった（第８図および第９図）。この耐性形成はＭ ＤＲ遺伝子の増幅による。これはＭＤＲ遺伝子をプローブとして、ＲＮＡを指示 する方法、すなわち遺伝子の転写であるノーザン法の助力によって示される（第 １０図）。耐性細胞はバンドを示し、非耐性細胞（処理開始時の状態）はバンド を示さない。 アドリアマイシンについての並行実験では、０．５もしくは１μｇ／ｍＬのＢ ＶＤＵを一緒に与えた（ＢＶＤＵは、ヒト腫瘍細胞中では約１０μｇ／ｍＬから しか毒性を現さず、マウス腫瘍細胞では約８μｇ／ｍＬからしか毒性を現さない （第８図および第９図）。ＢＶＤＵはアドリアマイシンに対する耐性形成を予防 する。腫瘍細胞は細胞増殖抑制剤処理に感受性のままであり、死滅する。ＢＶＤ Ｕの効果は非常に強く、実験を６〜８週間を超えて延ばすためには休止期（化合 物のない状態で培養）によって実験を中断せざるをえない。 ＢＶＤＵ＋アドリアマイシン処理によると、アドリアマイシン単独処理よりも ＭＤＲ遺伝子の増幅がかなり弱くなる（第１０図）。ＢＶＤＵ処理の効果は、実 際はバンドの減弱によって現されるよりもずっと大きい。すなわち、処理終了時 にはアドリアマイシン処理に対する少なくともなんらかの耐性を獲得した細胞だ けが残る。ＢＶＤＵ処理の結果、非耐性のままとなった細胞は、すでにそれ以前 に死滅している。従って、実際の適切な効果、しかもノーザン法の助力によって も検出できない効果は、非耐性細胞の死滅にあり、それは生細胞数減少曲線（第 ８図および第９図）において測定される。 同様にヒト腫瘍の細胞増殖抑制剤処理に対する耐性の形成もＭＤＲ遺伝子の増 幅に基づくため、ＢＶＤＵを任意選択の細胞増殖抑制剤と組み合わせると治療を 低用量で以前よりも長期間にわたって施行することが可能になる。さらに、耐性 形成の予防はその他の適用にとっても重要である。 Ｄ．抗組換え剤５’置換ヌクレオシドの同時投与による細胞増殖抑制剤処理に対 する「多剤耐性」（ＭＤＲ）形成の予防 第１１図および第１２図を見ると、抗組換え効果はＢＶＤＵだけに特有なので はなく、５’置換ヌクレオシド全体の性質であることが分かる。 このように、第１１図はサッカロミセス−セレビジエＭＰ１中の（Ｅ）−５− （２−ブロモビニル）−２１−デオキシウリジン、（Ｅ）−５−（２−ブロモビ ニル）−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−ウラシル、（Ｅ）−５（２−ブロモ ビニル）−２１−デオキシ−４１−チオウリジンの抗組換え効果を示し、 第１２図はサッカロミセス−セレビジエＭＰ１中の５−ヨード２’−デオキシ シチジン、５−ヨード−２’−デオキシウリジン、２’−デオキシ−５−トリフ ルオロメチルウリジンの抗組換え効果を示す。 マウス腫瘍細胞株Ｆ４−６−ＷＴ（ＷＴ＝野生型＝細胞増殖抑制剤に感受性＝ ＭＤＲ遺伝子の増幅なし）を数週間にわたって段階的に濃度を上昇させたアドリ アマイシンによって処理した。細胞処理中に、この処理に対する耐性を獲得した 。非耐性細胞ではアドリアマイシン２０ｎｇ／ｍＬ処理期間４日間で強い毒性効 果があるのにもかかわらず、濃度を段階的に高めた長期処理後の細胞はアドリア マイシン２０ｎｇ／ｍＬに対して全く感受性がなかった（第１３図および第１４ 図）。この耐性形成はＭＤＲ遺伝子の増幅による。これはＭＤＲ遺伝子をプロー ブとして、ＲＮＡを指示する方法、すなわち遺伝子の転写であるノーザン法の助 力によって示される（第１５図）。耐性細胞はバンドを示し、非耐性細胞（処理 開始時の状態）はバンドを示さない。β−アクチンｍＲＮＡ濃度を比較対照と同 様に分析した。β−アクチンはＲＮＡ量の内部標準として使用した。 並行実験では、アドリアマイシンをそれぞれ１μｇ／ｍＬの５’置換ヌクレオ シドと共に投与した。６種類の５’置換ヌクレオシドはすべてアドリアマイシン に対する耐性形成を予防する。腫瘍細胞は細胞増殖抑制剤処理に対して感受性が あるままであり、死滅する。５’置換ヌクレオシドの効果は非常に強かったので 、実験を６〜８週間を超えて延ばすためには休止期（化合物のない状態で培養） によって実験を中断せざるをえなかった。 第１５図にＲＮＡのノーザン・ブロット分析を示す。 マウス腫瘍細胞株Ｆ４−６−ＷＴにおけるＭＤＲ遺伝子の発現。比較のためβ −アクチンｍＲＮＡ濃度も同様に分析した。β−アクチンはＲＮＡ量の内部標準 として使用した。 陽性対照：アドリアマイシン耐性Ｆ４−６−ＷＴ細胞 陰性対照：アドリアマイシン感受性Ｆ４−６−ＷＴ細胞 １ （Ｅ）−５（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン１μｇ／ｍＬ ＋アドリアマイシン ２ （Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル− ウラシル１μｇ／ｍＬ＋アドリアマイシン ３ （ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシ−４’−チオウリジ ン１μｇ／ｍＬ＋アドリアマイシン ４ ５−ヨード−２’−デオキシシチジン１μｇ／ｍＬ＋アドリアマイシン ５ ５−ヨード−２’−デオキシウリジン１μｇ／ｍＬ＋アドリアマイシン ６ ２’−デオキシ−５−トリフルオロメチルウリジン１μｇ／ｍＬ＋アドリ アマイシン ７ （Ｅ）−５（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン（ＢＶＤＵ） １μｇ／ｍＬ＋アドリアマイシン ５’置換ヌクレオシド＋アドリアマイシン処理によると、アドリアマイシン単 独処理よりもＭＤＲ遺伝子の増幅がかなり弱くなる（第１５図）。この処理の効 果は、実際はバンドの減弱によって現されるよりもずっと大きい。すなわち、処 理終了時にはアドリアマイシン処理に対する少なくともなんらかの耐性を獲得し た細胞だけが残る。ＢＶＤＵ処理によって非耐性のままとなった細胞は、すでに それ以前に死滅している。従って、実際の適切な効果、しかもノーザン法の助力 によっても検出できない効果は、非耐性細胞の死滅にあり、それは生細胞数減少 曲線（第１３図および第１４図）において測定された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＢＲ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞増殖抑制療法における耐性の形成を予防もしくは軽減する医薬品を製造 するために５’置換ヌクレオシドを少なくとも１種類の細胞増殖抑制剤と組み合 わせた利用。 ２．ヌクレオシドとして（Ｅ）−５−（２−ブロモビニール）−２’−デオキシ ウリジン（ＢＶＤＵ）またはその代謝生成物あるいはその両方を使用することを 特徴とする請求項１に記載の利用。 ３．ヌクレオシドとして（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）ウラシル（ＢＶＵ） を使用することを特徴とする請求項２に記載の利用。 ４．ヌクレオシドとして（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−１−β−Ｄ−アラ ビノフラノシルウラシルまたはその代謝生成物あるいはその両方を使用すること を特徴とする請求項１に記載の利用。 ５．ヌクレオシドとして（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシ− ４’−チオウリジンまたはその代謝生成物あるいはその両方を使用することを特 徴とする請求項１に記載の利用。 ６．ヌクレオシドとして５−ヨード−２’−デオキシシチジンまたはその代謝生 成物あるいはその両方を使用することを特徴とする請求項１に記載の利用。 ７．ヌクレオシドとして５−ヨード−２’−デオキシウリジンまたはその代謝生 成物あるいはその両方を使用することを特徴とする請求項１に記載の利用。 ８．ヌクレオシドとして２’−デオキシ−５−トリフルオロメチルウリジンまた はその代謝生成物あるいはその両方を使用することを特徴とする請求項１に記載 の利用。 ９．最終血中濃度が０．０２〜１０μｇ／ｍＬとなる量の請求項１から８のうち 少なくとも１項による５’置換ヌクレオシド、少なくとも１種類の細胞増殖抑制 剤、従来の担体および補助剤を含む医薬品。 １０．最終血中濃度が０．０５〜５μｇ／ｍＬとなる量のヌクレオシドを含むこ とを特徴とする請求項９に記載の医薬品。 １１．細胞増殖抑制剤をアルカロイド、アルキル化剤、抗代謝剤、抗生物質また はシスプラチンから選択することを特徴とする請求項９または１０に記載の医薬 品。