DE19543750A1 - Cathepsin G inhibierende Aptamere - Google Patents

Cathepsin G inhibierende Aptamere

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Description

Die Erfindung betrifft Cathepsin G inhibierende Oligonukleotide und diese enthaltende Arzneimittel.
Cathepsin G ist eine Chymotrypsin ähnliche Serinprotease, die hauptsächlich in den azurophilen Granula polymorph­ kerniger Leukozyten (PMN) lokalisiert ist. Dieses Enzym wird während der PMN-Degranulation freigesetzt, stimuliert die Plättchenaggregation und hydrolysiert Proteoglykane, Glykoproteine und Collagen in der Gefäßwand. Weitere im Blut zirkulierende Zellen, insbesondere Leukozyten, werden aktiviert. Von Bedeutung ist ferner, daß Cathepsin G an der Aktivierung von Gerinnungsfaktoren wie Faktor V und an der proteolytischen Aktivierung der menschlichen Plättchen-Gly­ koproteine Ib-IX und IIb/IIIa beteiligt ist. Die Plättchen stimulierende Wirkung von Cathepsin G ähnelt der des Thrombins, unterscheidet sich von dieser aber dadurch, daß sie über separate Mechanismen (Rezeptoren) vermittelt wird. Cathepsin G kann überdies zu Schädigungen der Gefäßwand und anderer Gewebe führen.
Darüber hinaus ist eine Vielzahl weiterer Wirkungen des Cathepsin G bekannt, so daß zusammenfassend festgestellt werden kann, daß Cathepsin G während der Degranulation von PNN freigesetzt wird, biologisch wichtige Proteine spaltet und somit zur Gewebezerstörung während entzündlicher und ischämischer Vorgänge beiträgt. Die bisherigen Feststellungen zu den Wirkungen von Cathepsin G lassen vermuten, daß die Hemmung von Cathepsin G zur Behandlung und Vorbeugung entzündlicher Vorgänge und prokoagulatorischer Zustände geeignet ist.
Bekannte Cathepsin G Antagonisten sind die Proteine Eglin B und C (Handbook of Enzyme Inhibitors, 2. Aufl., Verlag Chemie Weinheim, 1993), die aber nicht oral als Arzneimittel eingesetzt werden können und das bedeutsame Risiko immunologischer Komplikationen bergen. Weitere Inhibitoren wie Heparin sind nicht selektiv und inhibieren auch andere Enzyme wie Thrombin.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Cathepsin G Inhibitoren sowie diese enthaltende Arzneimittel bereitzustellen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch Cathepsin G inhibierende Aptamere, die eine Basensequenz
5′-GGN3-6GGN8-14GGN1-4GGN1-4GGN2-6GG-3′
enthalten oder daraus bestehen, worin N weitere Nukleotide bedeutet und die Ziffer die Anzahl der an dieser Stelle möglichen Nukleotide angibt, und 3 bis 5 der einen Loop bildenden Nukleotide N8-14 komplementär zueinander sind. Diese Sequenzen sind auch als Bestandteil eines längeren Oligonukleotids mit beispielsweise 90 Nukleotiden wirksam.
Die erfindungsgemäßen Aptamere zeigen eine starke Inhibierung von reinem Cathepsin G. Die Cathepsin G induzierte Stimulation der Aggregation gewaschener menschlicher Plättchen wurde konzentrationsabhängig durch das Cathepsin G Aptamer inhibiert. Die erfindungsgemäßen Aptamere hemmen ebenfalls die fMLP stimulierte Freisetzung von O₂⁻-Radikalen aus PMN.
Da eine Denaturierung der erfindungsgemäßen Aptamere oder Oligonukleotide im Magen-Darm-Trakt nicht zu erwarten ist, eignen sie sich voraussichtlich als oral applizierbare Arzneimittel.
Als Arzneimittel werden die erfindungsgemäßen Aptamere insbesondere zur Behandlung von Erkrankungen eingesetzt, wo neutrophile Granulozyten aktiviert werden. Solche Erkrankungen oder krankhaften Zustände umfassen entzündliche und prokoagulatorische Zustände. Spezielle Indikationen sind Asthma, Bronchitis, Knochen- und Knorpelerkrankungen und rheumatoide Zustände. Andere Indikationen sind die Vorbeugung und Behandlung von intravaskulären Koagulopathien, insbesondere bei septischem Schock und verwandten Krankheiten, thrombotische Erkrankungen und arterielle und venöse Vasopathien, welche die durch PMN induzierte Aktivierung von Plättchen, des plasmatischen Gerinnungssystems und Gefäßverletzungen einschließen.
Solche Erkrankungen sind insbesondere Myokardinfarkte, periphere Gefäßverschlüsse sowie entzündliche und thrombotische Erkrankungen des venösen Systems, Reperfusionsschäden durch Cathepsin G abhängige Gewebezerstörungen des ischämischen Herzmuskels. Schließlich werden die erfindungsgemäßen Aptamere zur Vorbeugung und Hemmung der Progression der Alzheimer-Krankheit vorgeschlagen.
Bevorzugte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Aptamere sind nachfolgend wiedergegeben, sie weisen sämtlich die durch die oben angegebene Sequenz bedingte und gewünschte Wirkung auf:
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können als DNA- oder RNA-Nukleotide vorliegen. Die Sequenzen können modifiziert sein, um deren Halbwertzeit zu erhöhen. Hierzu bieten sich erfindungsgemäß Nukleotide an, die beispielsweise durch 2′-Fluoruracil oder 2′-Fluorcytosin modifiziert sind, oder Nukleotide wie 2′-Amino-CTP und 2′-Amino-UTP. Die Oligonukleotide können auch mit Phosphorthioat stabilisiert sein.
Erfindungsgemäß geeignete Arzneiformen zur Applikation der Aptamere sind injizierbare, oral applizierbare und topisch wirksame Zubereitungen. Unter oral applizierbare und topisch wirksame Arzneiformen fallen insbesondere Tabletten, Dragees, Kapseln und Säfte in Form von Lösungen oder Suspensionen der erfindungsgemäßen Aptamere sowie streichfähige Zubereitungen. Die Herstellung dieser Arzneiformen und die einzusetzenden Hilfsstoffe sind dem Fachmann bekannt.
Fig. 1 zeigt die Inhibition von Cathepsin G durch ein erfindungsgemäßes Aptamer. Gemessen wurde die Aktivität von Cathepsin G anhand der Hydrolyse von Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Pna.
Fig. 2 zeigt die Hemmung eines erfindungsgemäßen Aptamers auf die durch Cathepsin G stimulierte Aggregation von gewaschenen Humanplättchen. Die Zahlenwerte an den Graphen zeigen die berechneten maximalen Änderungen der Lichtdurchlässigkeit.
Fig. 3 zeigt die Inhibition der durch Cathepsin G induzierten Aggregation humaner Thrombozyten durch ein Cathepsin G inhibierendes Aptamer im Vergleich zu einem Thrombin hemmenden Aptamer. Diese Darstellung zeigt die hohe Spezifität der erfindungsgemäßen Aptamere.
Alle in den Fig. 1 bis 3 angegebenen Daten sind Mittelwerte von n = 3 ± SEM.
Diese biologischen Prüfungen zeigen, daß eine maximale Hemmung bereits bei etwa 200 nM Cathepsin G-Aptamer erzielt wird. Die Inhibitionskonstante IC₅₀ beträgt etwa 60 bis 100 nM, was eine Ki im unteren nanomolaren Bereich erwarten läßt.
Die erfindungsgemäßen Cathepsin G inhibierenden Aptamersequenzen können in bevorzugter Weise gemäß einem Verfahren erhalten werden, das für die Isolierung einsträngiger DNA-Nukleotide, die Humanthrombin binden und dieses inhibieren, in grundsätzlicher Weise in NATURE 355: 564-566 (1992) und insbesondere in Gene, 137 (1993) 25-31 beschrieben ist.
Herstellungsbeispiel
Zunächst erfolgt die Bereitstellung eines Oligonukleotidpools, der mindestens 10¹³ verschiedene DNA-Sequenzen aufweisen sollte, wobei die DNA-Sequenzen über eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifizierbar sein müssen, d. h. sowohl am 5′- wie auch am 3′-Ende sollen definierte Primer bindende Bereiche sein und ferner muß die Möglichkeit zur gerichteten Klonierung durch Einbau einer entsprechenden Restriktionsschnittstelle gegeben sein.
Hierzu wurde das nachfolgend dargestellte 96 Basen lange Oligonukleotid bereitgestellt, welches an seinen Enden 18 Basen einer definierten Sequenz und in einem dieser Bereiche eine EcoRI-Schnittstelle aufweist.
Zwischen diesen 18 Basen langen Primer bindenden Regionen befinden sich 60 Nukleotide. In diesem Bereich kann sich auf jeder Position jede der möglichen Basen befinden. Hierdurch wird die Anzahl von etwa 10¹³ unterschiedlichen Sequenzen erreicht.
Dieses Oligonukleotid wurde synthetisch gemäß bekannten Verfahren hergestellt und mittels HPLC gereinigt. Anschließend wurde eine ausreichende Menge dieses Pools (100 µg) mit 100 µg Cathepsin G in einem Tris-Puffer (50 mM), pH 7,4, in Gegenwart von 150 mM NaCl, 5 mM MgCl₂ und 5 mM KCl etwa 30 Minuten lang inkubiert und das Inkubat mit einem Gesamtvolumen von 2 ml nachfolgend einer Affinitätschromatographie mit einem Kationenaustauscher (Pharmacia® Hitrap SP-Kationenaustauschersäule) unterzogen. Das Säulenmaterial war zuvor mit dem Inkubationspuffer äquilibriert worden.
Dabei wurde das positiv geladene Cathepsin G einschließlich der daran gebundenen DNA gebunden, wohingegen die negativ geladenen DNA-Fragmente ausgewaschen werden konnten. Zur Beladung und zum Waschen der Säule wurde eine Membranpumpe bei einer Flußgeschwindigkeit von 0,5 ml/min eingesetzt. Der Säule nachgeschaltet war ein Durchflußphotometer zum Nachweis der in der Lösung vorhandenen DNA bei einer Wellenlänge von 260 nm.
Die Elution des an das Säulenmaterial gebundenen DNA/Enzym-Komplexes erfolgte mit 0,8 M NaCl und 30 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,4. Photometrisch als DNA enthaltend identifizierte Fraktionen wurden gesammelt und der bekannten Ethanolfällung nach Maniatis (1989) unterzogen. Es wurde das dreifache Volumen Ethanol zugesetzt. Nach einer Fällung über Nacht bei -20°C wurde eine Stunde lang bei 13 000 UpM zentrifugiert (Heraeus Biofuge 13). Das erhaltene Pellet wurde getrocknet und in 100 µl sterilem H₂O aufgenommen. Von dieser Lösung wurden 30 bis 50 µl einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unterworfen und die geringen gebundenen Mengen DNA amplifiziert. Dabei wurden die allgemein üblichen Bedingungen einer PCR angewendet. Die Annealing-Temperatur betrug 45°C, und es wurden 40 Zyklen gefahren. Die nach Prüfung auf einem Agarosegel (2%) als positiv bewerteten PCR-Produkte wurden mit Ethanol gefällt, nach Aufnahme in sterilem H₂O bei 95°C 5 Minuten hitzedenaturiert und dabei wieder in die Einzelstränge überführt. Anschließend wurde auf Eis abgekühlt.
Das erhaltene Produkt wurde auf die Pufferstärke des Inkubationspuffers eingestellt und erneut der Inkubation mit Cathepsin G unterzogen. Dieses Verfahren wurde fünfmal wiederholt.
Zur Vermeidung der Anreicherung unspezifisch an das Säulenmaterial bindender Sequenzen wurden noch zwei weitere solcher Zyklen nachgeschaltet, in denen Cathepsin G auf eine entsprechende Säule aufgebracht und anschließend die Zugabe der DNA über eine identische vorgeschaltete Chromatographiesäule erfolgte.
Das Endprodukt der letzten Polymerase-Kettenreaktion wurde in bekannter Weise gemäß EcoRI/Sma in einem Plasmidvektor pUC 18 kloniert und nach Transformation, Bakterienanzucht und Plasmidpräparation entsprechend üblichen Verfahrensweisen sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden mittels eines Computerprogramms ausgewertet, die Consensussequenz synthetisch in einem DNA-Synthesizer hergestellt und in den folgenden biologischen Prüfungen eingesetzt, deren Ergebnisse in den Fig. 1 bis 3 dargestellt sind.

Claims (16)

1. Cathepsin G inhibierende Aptamere, gekennzeichnet durch die Nukleotidsequenz 5′GGN3-6GGN8-14GGN1-4GGN1-4GGN2-6GG-3′,worin N weitere Nukleotide und die Zahlenwerte die mögliche Anzahl weiterer Nukleotide bedeuten, wobei 3 bis 5 der einen Loop bildenden Nukleotide (N8-14) komplementär zu einander sind.
2. Cathepsin G inhibierendes Aptamer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz GGTACCCGGA TCCGAGCTCC ACGTGGGGGC ACGGACT.
3. Cathepsin G inhibierendes Aptamer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz GGGTTGAGGG TGGATTACGC CACGTGGAGC TCGGATCCA CATCCAGG.
4. Cathepsin G inhibierendes Aptamer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz GGTCCTGGTG CTCCTCGTGG AGTTCGGATC CGGGG.
5. Cathepsin G inhibierendes Aptamer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz GGTCGAGGCT AGCTAGCGAG CGGTAGTCTA GAACCTTAGG CGTGGTGAGG.
6. Cathepsin G inhibierendes Aptamer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz GGACCTTAAG GGCACAACTG AGGAAATGGA GGTAGG.
7. Cathepsin G inhibierendes Aptamer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz GGTGTGTACA CACATTGGCG GTGGATGAGG TCGG.
8. Cathepsin G inhibierendes Aptamer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz GGCTCGAGGT GCACCGTTAC CAGGGTGGAT GGTACCTAGG.
9. Cathepsin G inhibierendes Aptamer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz GGGGCGCA GTTAGGTGTG AGGTGTGAGG TCACGTGGGC TCGG.
10. Cathepsin G inhibierendes Aptamer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz GGRGGTTAGT TACAAACGTA GGSACGTGGR GCTCGGATYY CSGG.
11. Cathepsin G inhibierendes Aptamer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz GGTSCTGGTS CCCYACGGTC GACSCTAGCG TAGGAAACS CCGGCTAGG.
12. Cathepsin G inhibierendes Aptamer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz GGTGGACCST ACSAGGKTTA CYKGGAWYCS AGGYCCAMST GG.
13. Cathepsin G inhibierendes Aptamer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz GGCTGGRTYC CSAGSTYCAC CGKGGGRGGR CAAMAATGGG GG.
14. Cathepsin G inhibierendes Aptamer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz GGATGATATC CTCATGGCAG GGAATGGTGC GGGCTCCAGG.
15. Cathepsin G inhibierendes Aptamer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz GGGGTGAGAC GGGCATGTTG TTGGBATTCG GTTGATGCTC CACGTGGAGC TCGG.
16. Arzneimittel, enthaltend ein oder mehrere Cathepsin G inhibierende Aptamere der Ansprüche 1 bis 15.
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