DE19525654A1 - Verfahren zur mechanischen Beeinflussung von biologischen Objekten mittels magnetischer Partikel (Beads) in einem inhomogenen Magnetfeld - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mechanischen Beeinflussung von biologischen Objekten mittels magnetischer Partikel (Beads) in einem inhomogenen Magnetfeld.

Methoden zur unspezifischen mechanischen Reizung von Zellen sind seit längerem bekannt. Dazu läßt man z. B. Zellen auf einer flexiblen Membran zu einer Monolayer-Schicht wachsen und verformt dann diese Membran.

Bei einer anderen Technik strömen Flüssigkeiten über eine Zellschicht.

Diesen Methoden ist gemein, daß die Zellen in ihrer Ganzheit dem Streß ausgesetzt werden, und nicht nur spezifische Zellbestandteile.

Um z. B. spezielle Rezeptoren zu beeinflussen, werden seit kürzerem mit z. B. Antikörpern oder natürlichen Liganden der Rezeptoren beschichtete ferromagnetische Beads genutzt. Durch ein starkes homogenes Magnetfeld werden die Beads permanent magnetisiert und darauf folgend durch ein schwächeres perpendikular zum vorherigen gerichtetes homogenes Magnetfeld verdreht. (WANG, BUTLER und INGBER, Science 260 (1993), S. 1124-1127].

Das selbe Verfahren nutzend, können mechanische Kräfte über phagozytierte ferromagnetische Beads im Inneren der Zelle zum Wirken gebracht werden. [STAHLHOFEN und MÖLLER, J. Aerosol Sci. 21 (supple 1) (1990), S. 435-438].

Das hier beschriebene Verfahren vereint die Vorteile der beiden letztgenannten Methoden durch die Nutzung von Beads in Magnetfeldern, bzw. führt neue Optionen ein. Das heißt, durch entsprechende Beschichtung der Beads kann man sowohl spezifische als auch unspezifische mechanische Reizungen der Zellen erwirken bzw. durch phagozytierte Beads mechanische Kräfte einwirken lassen. Zur Anwendung bei diesem Verfahren gelangen Translationskräfte, im Gegensatz zu den anderen Verfahren, bei denen Drehmomente die Reize bewirken.

Paramagnetische, ferromagnetische oder diamagnetische Beads werden biologischem Material an- bzw. eingelagert. Durch ein äußeres Magnetfeld werden die Beads temporär oder permanent magnetisiert. Aufgrund der inhomogenen Ausbildung des Magnetfeldes entstehen translatorische Kräfte in Richtung der größten Inhomogenität proportional dem Feldgradienten bei paramagnetischen und ferromagnetischen Beads bzw. bei diamagnetischen in die entgegengesetzte Richtung.

Reaktionen auf diese Reize lassen sich vielfältig, z. B. durch Messung zellphysiologischer Parameter wie des intrazellulären Kalziums, nachweisen und quantifizieren.

Während es bei den beiden oben genannten Methoden unter Benutzung von Beads systembedingt eine obere Grenze für das einwirkende Drehmoment gibt - limitiert durch den maximalen Drehwinkel, die maximale Remanenz oder die Grenzfeldstärke der Ummagnetisierung der Beads - kann man mit dem hier vorgestellten Verfahren beliebige Krafteinwirkungen hervorrufen, nur begrenzt durch die Dimensionierung des Magnetsystems. Des weiteren läßt sich die hier vorgestellte Erfindung, im Gegensatz zu den bisher bekannten Techniken, nicht nur für adhärierte Zellen, sondern auch für in Suspension befindliche Objekte nutzen, wenn die Zeitkonstante der Drift Berücksichtigung findet.

Bei den anderen Verfahren ist die Nutzung von speziell hergestellten ferromagnetischen Beads eine zwingende Grundvoraussetzung, während bei dem vorgestellten Verfahren ferromagnetische, diamagnetische wie auch paramagnetische Beads, die in großer Vielfalt kommerziell erhältlich sind, Anwendung finden können. Weiter ist auch eine Kombination von Verdrehung und Translationskraft bei adhärierten Zellen möglich, wenn man ferromagnetische Beads nutzt, die zuerst in einem starken homogenen Magnetfeld permanent magnetisiert werden und dann einem etwa perpendikular gerichteten schwachen inhomogenen Feld ausgesetzt werden. Von den beiden vorher genannten Methoden ist bekannt, daß sich die Beads nach einer Zeit ausgerichtet haben, so daß keine Kräfte mehr einwirken. Bei der hier vorgestellten Technik gibt es keine zeitliche Begrenzung der Krafteinwirkung.

Dem Verfahren ist es inhärent, daß ein inhomogen ausgeprägtes Magnetfeld zur Induktion der Krafteinwirkung auf die Beads genutzt wird. Gelangt ein magnetisierbares Teilchen wie ein paramagnetisches, diamagnetisches oder ferromagnetisches Bead in den Einfluß eines solchen Feldes, so wird es zu einem Magnetischen Dipol, der sich aufgrund der dadurch angreifenden Kraft bei paramagnetischen und ferromagnetischen Beads in Richtung des Feldstärkegradienten bewegt (Abb. 1), bzw. bei diamagnetischen Beads dazu entgegengesetzt bewegt. Die einwirkende Kraft ist proportional der Magnetisierung bzw. der magnetischen Dipolstärke des Teilchens und proportional dem Feldstärkegradienten.

Ist das Teilchen zudem ferromagnetisch, so kann es entweder schon permanent magnetisiert sein bzw. durch ein einwirkendes Feld permanent magnetisiert werden. Zeigt dieses permanente Dipolmoment in eine andere Richtung als das äußere, inhomogen ausgeprägte Feld, so wirkt auf es gleichzeitig ein Drehmoment, das danach strebt, es in Richtung des äußeren Feldes auszurichten.

Damit kann man sowohl paramagnetische, diamagnetische als auch ferromagnetische Beads zur Realisierung des hier vorgestellten Verfahrens nutzen, wobei man bei ferromagnetischen Beads noch die Option einer verdrehenden Kraft neben der Translationskraft durch eine vorhergehende Permanentmagnetisierung der Beads hat.

Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, beliebig starke Translationskräfte zu applizieren. Selbst bei Erreichen der Sättigungsmagnetisierung der Beads wird durch Erhöhung der Stärke des inhomogen ausgeprägten Magnetfeldes eine Erhöhung des Feldgradienten bewirkt, so daß die einwirkenden Kräfte steigen. Mit Hilfe von superleitenden Magnetsystemen sind prinzipiell beliebige Feldstärken erreichbar. Somit wird man, was die Grenzen der Methode anbelangt, unabhängig von den Materialeigenschaften der verwendeten Beads.

Zur Bestimmung der entstehenden Kräfte ist es empfehlenswert, eine Eichung zu benutzen, in etwa über die Messung der Stokes′schen Driftgeschwindigkeit der ledigen Beads in einer Flüssigkeit bekannter Viskosität.

Sollen Zellen in Suspension untersucht werden, so hat man eine Zeitkonstante zu beachten, da bei paramagnetischen und ferromagnetischen Beads durch die translatorischen Kräfte ein Transport der Zellen zu dem Ort der größten Inhomogenität des magnetischen Feldes (oder lokalen Maxima) innerhalb des Probenraumes stattfindet, bei diamagnetischen Beads entsprechend umgekehrt. Im allgemeinen werden die Verwendung findenden Zellen größere Dimensionen als die Beads haben, so daß diese Drift langsamer stattfinden wird als bei ledigen Beads. Die dabei wirkenden Kräfte entsprechen den Kräften auf gebundene Zellen bei ansonsten gleichen Bedingungen.

Das hier beschriebene Verfahren soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel erläutert werden.

Integrin-vermittelte mechanische Beeinflussung von Knochenzellen durch definierte mechanische Kräfte

Die Zellen einer Osteosarcom-Zellinie bzw. primäre Knochenzellen werden in die Kammern einer 96-Loch-Platte ausgesäet und wachsen bis zu einer subkonfluenten Monolage.

Paramagnetische Beads mit einem Durchmesser von 2,8 µm werden mit Anti-Integrin Antikörpern beschichtet und darauf folgend spezifisch durch Inkubation an die Interginrezeptoruntereinheiten gebunden. Diese mit Beads präparierte monolage Zellkultur wird einem definierten inhomogenen Magnetfeld ausgesetzt, wobei mechanischer Streß durch Zugkräfte an den Rezeptoren entsteht.

Zur Realisierung wird die Versuchsanordnung aus Abb. 2 genutzt: Das Magnetfeld einer Zylinderspule wird mittels Ferritkern in den Probenraum umgelenkt. Durch die spezielle Form der beiden Pole des Kerns - ein Pol ist flach während der andere zu einer Spitze geformt ist - entsteht ein inhomogenes Magnetfeld. Die dadurch auf die Beads einwirkende Kraft beträgt bis zu 2*10^-11N, was einer mittleren Spannung von 1Pa entspricht. Die Messung der Kraft wurde mittels der Driftgeschwindigkeit in einer viskosen Flüssigkeit entsprechend dem Stokes′schen Gesetz durchgeführt.

Als Parameter für die zelluläre Reaktion wurde die Änderung der intrazellulären Kalziumkonzentration gewählt, die mit dem Fluo-3-Farbstoff quantifiziert wurde. Es konnten Anstiege der intrazellulären Kalziumkonzentration nachgewiesen werden durch Applikation des mechanischen Stresses über das Einwirken des inhomogenen Magnetfeldes auf die Beads. Diese Anstiege waren signifikant höher, wenn die Beads spezifisch an die Interginrezeptoruntereinheiten gebunden waren, die als für die Signaltransduktion von mechanischen Reiten verantwortlich angenommen werden.

Claims (4)

1. Verfahren zur mechanischen Beeinflussung von biologischen Objekten mittels magnetischer Partikel (Beads) in einem inhomogenen Magnetfeld, das folgende Prämissen umfaßt:

• a) Es werden paramagnetische, diamagnetische bzw. ferromagnetische Partikel genutzt.
• b) Die magnetisierbaren Partikel werden an das biologische Material gebunden oder eingelagert.
• c) Ein äußeres, inhomogen ausgebildetes Magnetfeld erzeugt eine Kraft auf die magnetisierbaren Partikel
• d) Die auf die magnetisierbaren Partikel wirkende Kraft wird auf die biologischen Objekte übertragen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß translatorische Kräfte, gegebenenfalls kombiniert mit Drehmomenten, über die Beads auf die biologischen Objekte einwirken.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die biologischen Objekte adhäriert sind bzw. bei in Suspension befindlichen biologischen Objekten die Einwirkung nur so kurzzeitig ist, daß der hervorgerufene Transport nicht beachtet werden muß.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, wobei die Inhomogenität des Magnetfeldes durch einen spitzen Pol, der einem flachen Pol gegenübersteht, zwischen denen sich die Probe befindet, hervorgerufen wird (Vergl. Abb. 2).